Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство и использование настраиваемых агарозных форм для культуры яичников мышей без каркаса

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68871

⸱

24 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Описаны методы культивирования фолликулов яичников в новой агарозной плесени, не содержащей каркаса, которая дополняет гаметогенез in vitro .

Аннотация

Фолликул яичника является функциональной единицей яичника, которая вырабатывает гормоны и гаметы, необходимые для поддержания женской репродуктивной функции и здоровья. Способность повторять фолликулогенез, овуляцию и лютеинизацию in vitro имеет широкое базовое, трансляционное и клиническое применение. Наиболее совершенные системы роста фолликулов in vitro поддерживают трехмерную (3D) архитектуру фолликула, которая имеет решающее значение для развития мейотически компетентных ооцитов метафазы II у человека. Недавно был разработан и валидирован бескаркасный метод роста многослойных вторичных фолликулов мышей in vitro . Для этого были использованы изготовленные на заказ 3D-печатные формы для микромоделирования агарозы с микролунками, которые учитывают объемное расширение фолликулов. Фолликулы, выращенные в этой среде, свободной от каркасов, показали сопоставимую выработку гормонов и жизнеспособность по сравнению с хорошо зарекомендовавшими себя системами инкапсулированного in vitro роста фолликулов (eIVFG) на основе альгината. Важно отметить, что агарозные микролунки являются масштабируемым методом, менее технически сложным и демонстрируют улучшенный рост фолликулов и скорость овуляции по сравнению с eIVFG. Эта методология позволяет изготавливать индивидуальные формы, которые биосовместимы с ооцитом, клеткой, обладающей высокой чувствительностью к специфическим материалам фильтратам и другим загрязнителям окружающей среды. Кроме того, фолликулы в этой системе культивируются в той же фокальной плоскости, что позволяет проводить покадровую визуализацию и анализ в режиме реального времени. Чтобы повысить доступность этого нового подхода, в данной статье подробно описаны методы, необходимые для проектирования и 3D-печати мастер-форм, создания силиконовых форм для 24- или 96-луночных планшетов и культивирования изолированных многослойных вторичных фолликулов яичников в агарозных формах. Эта установка также может быть интегрирована с экономичной системой покадровой визуализации, позволяющей проводить морфокинетический анализ. Кроме того, формы могут быть залиты парафином для последующего гистологического анализа. В целом, этот удобный для пользователя метод является универсальным инструментом для культивирования фолликулов и может быть дополнительно настроен для содействия дифференцировке и созреванию половых клеток в контексте фолликула для поддержания полного гаметогенеза in vitro .

Введение

Ооцит, или женская гамета, при оплодотворении отдает эмбриону основную часть цитоплазмы и половину генетического материала, что имеет важное значение для развития следующего поколения. Оогенез начинается во время эмбрионального развития, когда первичные половые клетки вступают в мейоз и останавливаются в профазе I. Эти ооциты находятся внутри примордиальных фолликулов и составляют овариальный резерв, конечный и невозобновляемый пул, из которого они постепенно рекрутируются. Фолликулы развиваются в процессе, известном как фолликулогенез, с целью в конечном итоге получить зрелую гамету, способную к оплодотворению 1,2,3,4,5. Развитие фолликулов начинается с ранней, независимой от гонадотропина фазы, когда паракринная сигнализация необходима для выживания и роста фолликула. По мере того, как фолликулы созревают до вторичной стадии, они становятся зависимыми от гонадотропинов, что знаменует собой сдвиг в сторону эндокринной сигнализации. Ключевой характеристикой вторичных фолликулов является ооцит, окруженный как минимум двумя полными слоями кубовидных гранулезных клеток, наряду с недавно развитым слоем теки. Клетки теки образуют самый внешний слой фолликула, обеспечивая андрогены и структурную поддержку 6,7. Наконец, заполненная жидкостью антральная полость формируется и разрывается в ответ на всплеск лютеинизирующего гормона (ЛГ) во время овуляции, высвобождая оплодотворяющую гамету, остановленную при мейозе II 2,8,9.

Ооцит достигает компетентности в развитии для оплодотворения и способности поддерживать раннее преимплантационное развитие эмбриона, называемое ядерным и цитоплазматическим созреванием, во время оогенеза и фолликулогенеза 10,11,12. Созревание цитоплазмы проявляется морфологически, так как ооциты расширяются на протяжении всего фолликулогенеза. В результате пролиферации соматических клеток, в том числе тековых, гранулезных и кумулюсных клеток, сами фолликулы испытывают значительное объемное расширение. У мышей диаметр фолликула увеличивается в пять раз от ранних вторичных до преовуляторных фолликулов. Двунаправленная связь между ооцитом и окружающими соматическими клетками имеет важное значение для оогенеза. В первичных фолликулах zona pellucida образуется из белков, секретируемых ооцитом, и коммуникация между этими фолликулярными компартментами частично опосредована трансзональными проекциями, которые обеспечивают физический контакт между этими двумя фолликулярными компартментами13,14. Следовательно, фолликулярное микроокружение жизненно важно для правильной организации роста, а также ядерного и цитоплазматического созревания ооцита 2,5. Чтобы лучше понять дискретные механизмы, поддерживающие эти процессы, существует потребность в передовых и физиологически значимых методах культивирования in vitro. Способность культивировать фолликулы in vitro имеет широкое применение, включая вспомогательные репродуктивные технологии и сохранение фертильности 15,16,17,18, сохранение видов19,20, разработку лекарств21 и токсикологический скрининг22,23.

Системы культивирования фолликулов in vitro также являются важным промежуточным этапом для получения гамет из плюрипотентных стволовых клеток, также известного как гаметогенез in vitro (IVG)24. Исследователи использовали эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для развития гамет у различных видов, часто полагаясь на соматические клетки для воссоздания нативного микроокружения фолликулов 25,26,27,28,29,30. Несмотря на то, что с помощью этих методов были достигнуты основные этапы проверки концепции, все еще существует проблема низкого качества ооцитов, что отражается в низком развитии эмбрионов и показателях живого потомства после экстракорпорального оплодотворения у мышей 31,32. У других видов до сих пор не было достигнуто ни одного живорождения, что подчеркивает необходимость постоянного совершенствования протоколов для полной поддержки оогенеза и фолликулогенеза.

В настоящее время для культивирования фолликулов используется несколько стратегий. Технически наименее требовательными и наиболее трудоемкими подходами являются бескаркасные методы, при которых фолликулы помещаются в пластиковую чашку или мембранную вставку 33,34. Здесь гранулезные клетки прилипают к поверхности культуры, теряя контакт с ооцитом33,34. Разрушение фолликулярной архитектуры ограничивает удобство использования и биологическую значимость этих методов. Тем не менее, культура без каркаса в низких пластинах прикрепления или инвертированных каплях позволяет фолликулу сохранять структурную целостность у нескольких видов млекопитающих 35,36,37. К сожалению, с помощью этих методов трудно контролировать взаимодействие между фолликулами и объем механической поддержки, которую они получают. Следовательно, для лучшего повторения физиологии in vivo были разработаны методы культивирования, в которых фолликулы инкапсулируются в гидрогели с определенными, настраиваемыми химическими составами и/или механическими свойствами 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. Например, инкапсулированная альгинатом система роста фолликулов in vitro может повторять ключевые транскриптомные сигнатуры, наблюдаемые in vivo21.

Несмотря на успех и ценность протоколов инкапсулированного культивирования, у них есть несколько недостатков. Они могут быть технически сложными, трудоемкими, малопроизводительными и несовместимыми с автоматическими методами визуализации. Кроме того, методы инкапсулированного культивирования требуют многоступенчатых подходов для более крупных видов млекопитающих из-за более высокого объемного расширения фолликула37. Кроме того, инкапсулированные методы оказывают равномерную поддержку во всех направлениях, и фолликулы должны быть освобождены от гидрогеля до овуляции. Этого не происходит in vivo, где фолликул взаимодействует с окружающим микроокружением яичников, которое обеспечивает динамическую биомеханическую поддержку54. Например, жесткая кора яичников поддерживает покой примордиальных фолликулов, в то время как большие растущие фолликулы обычно обнаруживаются в более мягком медуллярном компартменте55,56. Как только фолликул с компетентной ооцитой достигает своего конечного размера, модификации стенки фолликула и эпителия поверхности яичников позволяют осуществить овуляцию. Таким образом, методы культивирования, при которых фолликулам позволено расти в одном направлении с небольшим сопротивлением, могут лучше имитировать физиологию in vivo.

В рамках нового подхода был разработан воспроизводимый, масштабируемый, технически менее требовательный и экономически эффективный метод культивирования многослойных вторичных фолликулов мышей57. Здесь изготавливаются агарозные микролунки со сверхнизкой адгезией с точно контролируемой геометрией (форма, размеры) и пространственным расположением (количество, близость) доступными методами. Фолликулы в агарозных формах испытывают механическую поддержку во всех направлениях, кроме одного, и культивируются в одной и той же фокальной плоскости, что позволяет проводить покадровую визуализацию для расширенного морфокинетического анализа. Стереолитография (SLA) 3D-печать была использована в качестве доступного метода для изготовления мастер-формы, за которой последовали этапы формования, в ходе которых создаются силиконовые формы без фильтрата для литья агарозы. Улучшение роста фолликулов и исходов овуляции было достигнуто с использованием новой системы по сравнению с традиционной эЭКО без ущерба для общей выживаемости, созревания или лютеинизации фолликулов57. В этом протокольном документе описываются шаги, необходимые для настройки и производства агарозных форм, как засеивать и культивировать многослойные вторичные фолликулы, обрабатывать и, наконец, выполнять таймлапс-анализ (Рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных, связанные с этим протоколом, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Северо-Западного университета и выполнены в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Адаптация конструкции мастер-формы

В этом разделе описываются первые шаги, выполненные на этапе проектирования (рис. 1), на котором специализированные микролунки вводятся в систему автоматизированного проектирования (САПР) мастер-формы для 24-луночных культуральных планшетов, называемую конструкцией основания 24-луночной мастер-формы (Дополнительный файл 1). Размеры микролунок определяют величину поддержки и максимальный размер роста фолликулов, в то время как количество лунок определяет максимальное количество фолликулов на агарозную плесень. Адаптированный дизайн мастер-формы будет использован в следующем разделе для создания биосовместимых силиконовых форм для литья в агарозу.

  1. Откройте файл .step для проектирования 24-луночной основы пресс-формы с помощью программного обеспечения CAD (Рисунок 2A).
  2. Выберите область внутренней поверхности объекта, затем перейдите на вкладку «Твердое тело » в рабочей области «Дизайн » и выберите «Создать эскиз », чтобы вставить желаемый проект микроформы (рис. 2Bi).
  3. Введите желаемые размеры xy и количество микролунок и выберите окончательный эскиз на панели инструментов (Рисунок 2Bii).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для многослойных вторичных фолликуловранее использовалась геометрическая форма стадиона размером 500 x 700 мкм. Разрешение печати может варьироваться в зависимости от используемых смол и SLA-принтеров; Минимальное расстояние между микролунками составляет 400 мкм.
  4. Создание микролунок глубиной 800 мкм с помощью функции выдавливания (нажмите на Solid | Создать | Выдавить). Обязательно выберите операцию резки , создав полость микролунки (Рисунок 2Biii).
  5. Выберите скругление радиусом 0,100 мм (нажмите на Дизайн | Твердый | Изменить | Скругление) для верхней части микролунок
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы создать микролунку с круглым дном, снова используйте операцию скругления для дна культуральной лунки и сделайте значение радиуса равным радиусу конструкции микролунки. Например, при проектировании скважин размером 500 мкм x 700 мкм выберите значение радиуса 0,250 мм (рис. 2Biv).
  6. Экспортируйте копию нового проекта мастер-формы в формате .step (нажмите на Файл | экспорт).

2. Создание емкостей для силиконовых форм

ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения выщелачивания цитотоксических соединений из напечатанных на 3D-принтере деталей будут изготовлены две биосовместимые силиконовые формы. В этом разделе описываются последние этапы этапа проектирования (рисунок 1), в результате чего для литья силикона будут использоваться два контейнера. Здесь будут использоваться три различных файла САПР, а именно новая конструкция мастер-формы, созданная на основе секции 1, и 24-луночные силиконовые литые контейнеры 1 и 2 (Рисунок 2Ci-ii и Дополнительный файл 2, Дополнительный файл 3 соответственно).

  1. Откройте файл 24-луночного силиконового литого контейнера 1.step и вставьте новую конструкцию мастер-формы в качестве внешнего компонента (перейдите к Solid | Вставка | Вставить компонент).
    1. Щелкните правой кнопкой мыши компонент и выберите «Разорвать ссылку », чтобы удалить связанную ссылку на новую конструкцию главной пресс-формы.
  2. Центрируйте новую конструкцию мастер-формы с 24-луночной поверхностью силиконового литого контейнера 1 , следя за тем, чтобы она была обращена внутрь.
    1. Щелкните правой кнопкой мыши новый объект конструкции мастер-формы в браузере и выберите опцию перемещения/копирования .
    2. Выберите операцию «Свободное перемещение » в разделе «Тип перемещения » и при необходимости поверните объект на 180° по оси X.
    3. Выберите операцию «От точки к точке » в разделе «Тип перемещения », указав середину нового объекта конструкции мастер-формы в качестве исходной точки и центр поверхности 1-го литого контейнера с 24 лунками в качестве целевой точки.
    4. Нажмите кнопку OK , чтобы выровнять объекты.
  3. Выберите операцию резки с контейнером в качестве целевого тела и эталонной пресс-формой в качестве конструкции корпуса инструмента (рисунок 2Ciii). Таким образом, создается контейнер для первого этапа литья силикона (Рисунок 2Civ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микролунки, которые были разработаны в первом разделе, теперь являются микростолбами, которые будут напечатаны на 3D-принтере, как описано в разделе 3. SLA-печать – это метод аддитивного производства; Следовательно, печать микростолбиков улучшает разрешение печати по сравнению с печатью микроколодцев.
  4. Сохраните и экспортируйте полученную новую 24-луночную силиконовую форму 1 в виде файлов .stl и .step.

3. 3D печать силиконовых контейнеров

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются первые шаги, выполняемые на этапе производства (Рисунок 1), когда новые проекты САПР с желаемыми конструктивными особенностями микролунок печатаются на 3D-принтере.

  1. Откройте файлы .stl новой 24-луночной силиконовой формы 1 и 24-луночного силиконового литого контейнера 2 с помощью программного обеспечения для подготовки к 3D-печати.
  2. Сориентируйте отпечаток микростойками вверх и используйте функцию сверления отверстия , чтобы создать отверстие шириной 1 мм (Рисунок 2D). Убедитесь, что этот канал открыт сбоку от отпечатка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстие, которое позволяет избежать эффекта выпуклости во время печати и может быть заполнено после печати, или излишки силиконового материала могут быть удалены после первого литья силикона.
  3. Напечатайте два дизайна контейнеров с толщиной слоя 25 мкм (рис. 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Распечатайте каждую модель в трех экземплярах, чтобы учесть дефекты печати или повреждения во время обработки.
  4. Снимите формы с печатной платформы и промойте в 95% изопропаноле в соответствии с инструкциями производителя. Обильно распылите на секцию микростолба 95% изопропанола (Рисунок 3B). Удалите остатки этанола сжатым воздухом.
  5. Дайте оставшемуся этанолу испариться не менее 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно герметизировать канал сверла шириной 1 мм. Это можно сделать, нанеся небольшую каплю неполимеризованной смолы с помощью наконечника пипетки p200 на внешнюю сторону отпечатка. Капиллярные силы будут заполнять канал.
  6. Отверждение 3D-принтеров при температуре 60 °C с помощью ультрафиолетового света в течение 15 минут.
  7. Осмотрите каждый отпечаток с помощью стереомикроскопа и отбросьте все 3D-отпечатки с дефектами (рисунок 3C-F). Тщательно осмотрите каждый отпечаток визуально, убедившись, что все микростолбики отделены друг от друга и одинаковы по размеру и внешнему виду (Рисунок 3D). Отбраковывайте дефектные мастер-формы со слитыми микростойками (рис. 3E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Распространенными проблемами являются поврежденные микростойки или мосты из-за оставшейся немытой смолы (Рисунок 3Fi, ii).
  8. Накройте внешнюю сторону отпечатка парапленкой, если канал для сверла не заполнен, и храните до дальнейшего использования.

4. Изготовление силиконовых форм

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются заключительные этапы этапа производства (Рисунок 1), где будут происходить два этапа литья силикона. Это необходимо для предотвращения выделения токсичных фильтратов при 3D-печати деталей.

  1. Приготовьте силикон в соответствии с инструкцией производителя, вкратце:
    1. Тщательно перемешайте содержимое контейнеров с частями А и В , поставьте стакан на весы и перелейте в контейнер в соотношении 1А:1В по весу. Убедитесь, что у вас есть лишний материал.
    2. Тщательно перемешивайте в течение 3 минут, обязательно соскребая бока и дно.
    3. Поместите материал в вакуумный эксикатор и оставьте на 5 минут, чтобы устранить застрявшие пузырьки воздуха. Повторите дегазацию до 2 раз, если пузырьки воздуха остались.
  2. Вылейте смесь равномерным потоком в силиконовую форму для емкости 1. Убедитесь, что уровень смеси находится на том же уровне, что и при 3D-печати, или немного ниже, чтобы обеспечить плоскостность силиконовой формы (рис. 4Ai, ii).
    1. Удалите захваченный воздух с помощью наконечника для дозатора p200 и при необходимости используйте вакуумную дегазацию.
  3. Перед извлечением из формы силикон отверждается при комнатной температуре не менее 5 часов, а лучше в течение ночи.
  4. Извлеките силикон из напечатанной на 3D-принтере формы и визуально подтвердите целостность микроформ с помощью стереомикроскопа (рис. 4Aiii, B). При необходимости удалите излишки материала из канала сверления (Рисунок 4Aiv). Выбросьте плесени с мостами или поврежденными микролунками (Рисунок 4C).
  5. Поместите силиконовую форму в контейнер для силиконовой формы 2 для второго этапа формования силикона (рисунок 4Av). Силиконовый контейнер 2 имеет отверстие диаметром 1 мм в боковой стенке, которое будет закрыто после установки силиконовой формы.
  6. Слегка сбрызните силиконовую форму безопасным для эмбрионов минеральным маслом и удалите излишки масла из микролунок. Это будет действовать как разделительный агент для разделения обеих силиконовых частей после отверждения.
  7. Повторите шаги смешивания, описанные в шаге 4.1, и вылейте смесь в емкость для силиконовой формы 2. Убедитесь, что уровень смеси находится ниже или на той же высоте, что и при 3D-печати, чтобы обеспечить плоскостность силиконовой формы (Рисунок 4Avi).
  8. Дайте силикону затвердеть при комнатной температуре в течение не менее 5 часов, желательно в течение ночи, перед извлечением из формы.
  9. Извлеките силикон из напечатанной на 3D-принтере формы и отделите силиконовые формы 1 и 2 друг от друга (рисунок 4Avii). Визуально подтвердите целостность микростолбиков с помощью стереомикроскопа (рисунок 4D). Выбросьте плесень, если в микролунках присутствовали пузырьки или избыток масла (рисунок 4E).
  10. Вымойте силиконовую форму с 70% этанолом и дайте высохнуть на воздухе в течение 30 минут в колпаке с ламинарным потоком.
  11. Поместите в стерилизационный пакет и отстойните в автоклаве с использованием сухого цикла для стерилизации (давление в рубашке: 20 фунтов на квадратный дюйм, температура камеры: 250 °F, время стерилизации: 15 минут).

5. Приготовление питательных сред

ПРИМЕЧАНИЕ: Для переваривания ткани яичников для выделения и культивирования фолликулов, созревания ооцитов in vitro и лютеинизации требуется шесть типов сред: диссекционные среды (ДМ), ферментативные среды (ЭМ), поддерживающие среды (ММ), питательные среды (ГМ), среды созревания (IVM) и лютеинизирующие среды (LM). Приготовление этих сред можно найти так, как описано ранее в Converse et al.38 с объяснением важности различных компонентов среды, проанализированных Simon et al.33, а их назначение кратко упомянуто в таблице 1.

  1. Подготовьте среду за 1 неделю и храните при температуре 4 °C.

6. Литье и хранение кастомной агарозной плесени и культуры фолликулов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как отлить нестандартные агарозные формы для культивирования фолликулов из силиконовых форм, созданных в разделе 4. Формы из агарозы можно изготавливать и хранить при температуре 4 °C до 2 недель до посева фолликулов.

  1. Поместите формы в стерилизационный мешок и проведите автоклав, используя сухой цикл, как описано в разделе 4.11. Перед использованием дайте формочкам остыть.
  2. Приготовьте раствор агарозы, растворив стерильный 1,5% раствор агарозы (w/v) в фосфатно-солевом буфере (PBS) в микроволновой печи или на горячей плите. Используйте стерильную коническую трубку, которую помещают в стакан с водой, чтобы обеспечить более равномерный нагрев агарозы и замедлить затвердевание жидкого раствора агарозы.
  3. Пипеткой стерильный раствор агарозы в силиконовые отливки в ламинарном проточном колпаке. Делайте пипетку медленно и плавно, чтобы свести к минимуму образование пузырьков и убедиться, что верхняя часть формы плоская, а не выпуклая или вогнутая. Верх при литье будет дном формы при культивировании и должен лежать ровно. Используйте приблизительно 600 мкл агарозы для 24-луночной микроформы и 85 мкл для микроформы, которая помещается в 96-луночный планшет.
  4. Дайте микроформам остыть в течение ~3 минут до застывания. Инвертируйте силиконовую отливку, чтобы вытеснить микроформы на чашку Петри диаметром 100 мм.
  5. Оцените микроформы под микроскопом на предмет деформаций, включая трещины, сращивание микролунок или неполные границы. Поместите микроформы в стерильный PBS + 1% пенициллин-стрептомицин и храните при температуре 4 °C до 2 недель перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовьте больше форм, чем необходимо, чтобы учесть деградацию с течением времени или повреждение микроформ при переносе с одной пластины на другую.
  6. Уравновесьте микроформы в 750 мкл поддерживающей среды 2 раза в течение не менее 1 ч (всего две инкубации) в день выделения фолликулов.
  7. Удалите все поддерживающие среды, добавьте 750 μл питательной среды и поместите в инкубатор на 1 час.
  8. Замените свежими и сбалансированными питательными средами перед посевом.

7. Выделение и культивирование поздних вторичных фолликулов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе объясняется, как выделить и засеять фолликулы в агарозных микроформах для культивирования фолликулов. Многослойные вторичные оциты культивируются в течение 8 дней, должны иметь жизнеспособность более 80% и производить зрелые ооциты. Выделение и культивирование вторичных фолликулов были подробно описаны в других работах38. Выделение и отбор фолликулов для инкапсуляции установленного альгината и для посева в агарозные формы являются последовательными.

  1. Препарируйте яичники у мышей и удалите из периовариальной жировой ткани и бурсу. Поместите яичники в 2,5 мл ферментативной среды и инкубируйте в орбитальном шейкере при 37 °C в течение 20 минут, как описано ранее57.
  2. Пипетку 2 мл поддерживающей среды в чашку для ЭКО и поместите в инкубатор (37 °C, 5%CO2) перед выделением фолликулов.
  3. Реакцию гашения 250 мкл FBS. Отбирают поздние вторичные фолликулы после ферментативной изоляции и переносят их в чашку ЭКО с СД.
  4. Перенесите фолликулы в чашку для ЭКО с предварительно уравновешенной поддерживающей средой и поместите в инкубатор (37 °C, 5%CO2) на 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начальный размер поздних вторичных фолликулов составляет 150-180 мкм с присутствием более двух слоев гранулезных клеток.
  5. Добавьте 750 μL свежего ГМ в агарозные микроформы и храните в инкубаторе для подготовки к посеву. Добавляйте стерильный PBS в соседние лунки, окружающие агарозные микроплесневые грибы, для поддержания влажности и минимизации испарения среды в течение всего периода культивирования.
  6. Семенные фолликулы в агарозные формы, которые были предварительно уравновешены и погружены в GM. Перенесите высококачественные многослойные вторичные фолликулы в агарозные микроформы под микроскопом с помощью стрипперного наконечника размером 200 мкм. Убедитесь, что 10 фолликулов перенесены в каждую микроплесень в 24-луночной пластине и что каждый фолликул находится в отдельной, но соседней микролунке.
    1. Согните кончик стриппера, чтобы обеспечить более точные манипуляции и перенос фолликулов в микролунки.
    2. Быстро передавайте фолликулы, чтобы свести к минимуму изменения температуры и pH, так как MM и GM буферизуютсяCO2 .
    3. Убедитесь, что фолликулы в микроплесени имеют одинаковый начальный размер после переноса всех 10 фолликулов.
  7. Поместите засеянные микроформы обратно в инкубатор не менее чем на 1 ч, чтобы фолликулы восстановились перед визуализацией.
  8. Визуализируйте фолликулы с 4-кратным и 10-кратным увеличением через день, чтобы количественно оценить выживаемость фолликулов и результаты роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Покадровая съемка также может быть настроена для выполнения морфокинетических измерений и более подробно описана в разделе 9.
  9. Меняйте 50% питательных сред через день.
  10. Отработанный материал заморозьте сухим льдом, а затем храните при температуре -80 °C. Используйте эту кондиционированную среду для оценки выработки гормонов с помощью эстрадиола ИФА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ГМ производится в день посева (начало периода культивирования), среду можно хранить при температуре 4 °C и использовать в течение всего периода культивирования.
  11. Удалите и заморозьте всю питательную среду (750 μл) на 8-й день культивирования.
  12. Замените питательную среду на среду IVM, чтобы обеспечить овуляцию in vitro .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Овуляция также может происходить при покадровой визуализации для оценки времени и особенностей разрыва.
  13. Удалите кумулюс-ооцитарные комплексы (КОК) через 14-16 ч после добавления среды IVM и оцените состояние созревания.
    1. Определить статус созревания можно следующим образом: определить MII по экструзии первого полярного тельца (ожидаемый результат для здоровых ооцитов), GVBD/MI по отсутствию полярного тельца или зародышевого пузырька (задержка созревания), GV по сферическому ядру, видимому в центре ооцита (отсутствие мейотической прогрессии) или дегенеративно уплощенному и/или потемневшему ооциту.
  14. Необязательно: Поскольку веретенообразные параметры ооцитов MII, включая выравнивание хромосом, форму и объем, тесно коррелируют с качеством ооцитов и исходами эмбрионов58,59, используйте их для оценки успеха оогенеза in vitro. Чтобы оценить морфологию веретена, зафиксировать и окрашивать яйцеклетки MII с помощью иммуноцитохимии цельного монта.
    1. Фиксация: Зафиксируйте яйца в 3,8% PFA с 0,1% Triton X-100 при 37 °C в течение 20 минут. Промойте яйца 3 раза в блокирующем буфере (PBS с кальцием и магнием (PBS +/+) с 10% Tween-20 и 0,3% BSA).
    2. Окрашивание веретена:
      1. Инкубировать яйца в буфере для пермеабилизации (PBS +/+ с 0,1% Triton X-100 и 0,3% BSA) в течение 15 минут при комнатной температуре
      2. Промойте 2 раза в блокирующем буфере.
      3. Инкубируйте яйца в конъюгированном анти-альфа-тубулине Alexa Fluor 488 в концентрации 1 г/мл на коромысле, завернутом в фольгу, в течение 2 ч при комнатной температуре.
      4. Яйца промыть в течение 3 х 20 минут в блокирующем буфере перед установкой на предметные стекла микроскопа с помощью DAPI-содержащей монтажной среды.
      5. Для наблюдения за цитоскелетом ооцитов во время окрашивания включают в себя 1:50 родамин фаллоидин.
    3. Получение изображений образцов на конфокальном микроскопе с помощью объектива с 63-кратным увеличением и z-стеком шириной 1,0 мкм по всему шпинделю.

8. Последующее применение нестандартных агарозных форм

Агарозные микроформы могут быть использованы для гистологического анализа, что позволяет количественно оценить и локализовать различные гены или белки, представляющие интерес. Микроформы создают фолликулярный микрочип, который позволяет окрашивать несколько фолликулов параллельно. Оптическая когерентная томография (ОКТ) также может быть выполнена без необходимости переноса фолликулов (Рисунок 1, Применение). Оптическая когерентная томография — это метод визуализации, который позволяет проводить 3D-реконструкцию образцов и имеет более высокую глубину проникновения и разрешение по сравнению с конфокальной микроскопией, что позволяет улучшить визуализацию 3D-образцов, таких как фолликулы, культивируемые in vitro60.

  1. Для применения в гистологии приготовьте раствор агарозы (1,5% мас./об.), как описано в шаге 6.2.
    1. Удалите все среды, окружающие агарозные микроформы в лунке, и осторожно удалите среду в полости микроформы с помощью пипетки p200 в углах полости.
    2. Осторожно намочите пипеткой 100 μл жидкого раствора агарозы, чтобы заполнить и запечатать микролунки и полость, не взбалтывая фолликулы; Убедитесь, что верхняя часть плоская. Удалите все пузырьки с помощью стерильного наконечника для дозатора P10.
    3. Дайте агарозе застыть при комнатной температуре в течение 2 минут. Убедитесь под микроскопом, что микроплесень полностью закрыта.
    4. Зафиксируйте микроформы на ночь при температуре 4 °C с легким покачиванием в 750 μл фиксатора (модифицированный раствор Дэвидсона или 3,8% параформальдегида).
    5. Отсадите фиксатор и промойте запечатанные микроформы в возрастающих концентрациях этанола, начиная с 50% и в конечном итоге до 70% EtOH.
    6. Процесс осуществляется с помощью автоматизированного тканевого аппарата с использованием стандартных протоколов обработки (Таблица 2) и погружения в парафин. При встраивании обратите внимание на ориентацию микроформ. Убедитесь, что до и после образца в процессе заделки присутствует воск, чтобы свести к минимуму потерю тканей во время среза.
    7. Последовательно разрезают заложенные образцы на толщину 5 мкм и помещают на заряженные предметные стекла микроскопа.
    8. Перед нанесением изображения выполните окрашивание H&E с помощью автоматического морилки и герметизации монтажным материалом.
  2. При выполнении ОКТ микроплесень с фолликулами помещают в чашку диаметром 50 мм, содержащую средства ИВМ.
    1. Чтобы следовать процедуре, используемой для получения репрезентативных ОКТ-изображений, необходимо получить изображение с помощью специально разработанной ОКТ-системы, работающей в спектральном диапазоне видимого света с осевым разрешением 1,3 мкм и боковым разрешением 9,4 мкм61,62.
    2. Сканирование фолликулов в поле зрения 1,58 x 1,58 мм2 , состоящее из 512 А-линий и 512 В-сканов, повторение 2 раза за В-сканирование и 3 раза за объем.
    3. Обрабатывайте ОКТ-изображения с помощью ImageJ для визуализации 3D-структуры фолликулов и количественной оценки объемов.
      1. Загружайте изображения в ImageJ в виде Z-стека, перетаскивая файлы в открытое приложение.
      2. Визуализируйте z-стек в виде 3D-изображения, перейдя в раздел Плагины|3D|Просмотрщик громкости. Поворачивайте 3D-изображение, чтобы увидеть его под разными углами в разные моменты времени.
      3. Перейдите в раздел Файл| Сохранить как |Tiff для сохранения изображения в нужном месте.

9. Таймлапс-анализ культуры фолликулов

Примечание: Фолликулы, выращенные в системе бескаркасных культур, находятся в той же фокальной плоскости и совместимы с покадровой визуализацией в инкубаторе. Покадровая визуализация может быть начата после посева фолликулов на шаге 7.7 (Рисунок 1, Применение).

Убедитесь, что все изменения точны на протяжении всего таймлапса. Следовательно, проходите через всю стопку после каждого шага, чтобы убедиться в отсутствии расхождений в измерениях.

  1. Настройка таймлапса:
    1. Наденьте колпачок фокусера/концентратора света на ручной микроскоп.
    2. Поместите ручной микроскоп с держателем крепления в инкубатор и подключите его к ноутбуку с установленным программным обеспечением.
    3. Поместите и хорошо выровняйте культуру под микроскопом и отрегулируйте высоту и фокус микроскопа так, чтобы все фолликулы были в фокусе. С помощью функции «Автоматический баланс белого» (AWB) выберите оптимальные условия освещения с помощью светодиодного управления, отключите автоматическую экспозицию (AE) и выберите оптимальное время экспозиции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выравнивание формы одинаково до и после каждой смены среды; В противном случае анализ придется делать отдельно каждые 2 дня посева.
    4. Запустите таймлапс-съемку, выбрав продолжительность 8 дней и интервал 30 минут. Выберите фотографию и Выключите светодиод, когда не делаете снимки.
  2. Укажите, какие измерения будут записаны в диалоговом окне набора измерений (нажмите Анализ | установить измерения) перед анализом ImageJ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о возможных измерениях, встроенных в программное обеспечение ImageJ, см. руководство пользователя, подраздел 30.763.
  3. Поместите все изображения в отдельную папку анализа, чтобы начать анализ.
  4. Перетащите папку анализа в программу ImageJ, чтобы открыть таймлапс в виде стопки. Убедитесь, что выбраны числовые имена сортировки , и если последовательности изображений не помещаются в оперативной памяти компьютера, выберите виртуальный стек.
  5. Используйте инструмент прямоугольного выделения , чтобы выделить область, где присутствуют все фолликулы на протяжении таймлапса. Для этого сначала используйте последнее изображение и прокрутите стопку, чтобы убедиться, что ни один из фолликулов не будет обрезан. Затем обрежьте выделение (перейдите к Изображение | Обрезка или Ctrl+Shift+X, рисунок 5Ai, ii).
  6. Установите масштабную линейку для стека таймлапса (Analyze | Установите масштаб). Используйте изображение дня 0, полученное с помощью тепловизора, и измерьте три идентифицируемых признака, таких как фолликулы или микролунки. Используйте изображение того же дня 0 из стека таймлапса и определите масштаб для одного из измерений; Используйте два других измерения, чтобы убедиться, что точный масштаб установлен.
  7. Выровняйте все изображения с помощью плагина SIFT (перейдите к Плагины | Регистрация | Линейное выравнивание стека с помощью SIFT (рис. 5Bi, ii). Используйте следующие стандартные настройки, которые можно регулировать для каждого случая: Линейное выравнивание стека с помощью SIFT, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 ближайших/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation=Жесткая интерполяция.
  8. Преобразование стека в 8-битные оттенки серого (Изображение | Тип | 8 бит).
  9. Удалите фон с помощью инструмента Вычитание фона Rolling Ball (нажмите Процесс | Вычесть фон, рисунок 5Ci,ii) с использованием следующих настроек, которые можно регулировать в каждом конкретном случае: Радиус катящегося шара = 70,0 пикселей; Выберите Отключить сглаживание.
  10. Пороговое значение изображения (перейдите в раздел Изображение | Настройка | Threshold), чтобы разделить таймлапс-изображения на два класса пикселей, используя следующие настройки: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Apply LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Convert to Mask", "method=Intermodes background=Dark calculate black").
  11. Измерьте каждый фолликул по отдельности с помощью выделения прямоугольника, затем выберите функцию анализа частиц (нажмите «Анализ» | Анализируйте частицы). Используйте следующие настройки: Анализировать частицы...", "size= 8000-Infinity display exclude include summarize overlay add composite stack (Рисунок 5Di,ii).
    1. Перед сохранением результатов убедитесь, что ROI для каждого изображения точен (рис. 5Ei, ii). Сохраните сводку и результаты в . Формат CSV.
    2. Повторите это для всех остальных фолликулов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы определить, поддерживались ли выживаемость и рост фолликулов с помощью этой новой технологии, как описано в разделе 7 протокола, фолликулы тех же мышей были выделены и культивированы параллельно в агарозных микроформах или инкапсулированы в 0,5% альгинат. Репрезентативные изображения фолликулов из каждого второго дня культивирования продемонстрировали нормальное развитие, рост и формирование антральной полости на протяжении всего периода культивирования (рис. 6...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Гаметогенез и созревание in vitro являются ключевыми технологиями для фундаментального понимания биологии ооцитов с потенциальными применениями в вспомогательных репродуктивных технологиях, сохранении фертильности и сохранении видов. Методы поддержки ЭКО часто основываются на совместном культивировании с соматическими клетками для создания реконструированных яичников30. Важность этих опорных клеток хорошо известна in vivo, где фолликулярное сомат...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальными институтами детского здоровья и развития человека (R01HD105752 к F.E.D и T32HD094699 к E.J.Z) и программой SenNet Общего фонда NIH (U54AG075932 и UH3CA268105 до F.E.D.) и грантом Фонда Билла и Мелинды Гейтс (INV-003385 для F.E.D.). В соответствии с условиями гранта Фонда Билла и Мелинды Гейтс, общая лицензия Creative Commons Attribution 4.0 уже была присвоена версии рукописи, принятой автором, которая может возникнуть в результате этой заявки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<Сильные>Материалы и химикаты
  50 мл полистиролных центрифугных трубокGlobe Scientific941-11017-CS
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 млFisher ScientificMCT-150Для snap, freeze и сохранения носителей
100-мм тарелка, необработаннаяFisher Scientific08-757-100D Для изготовления и хранения агарозных микроформ
100% этанолMercedes Scientific1200Обработка тканей
1000 и микро; L  Наконечники пипет, низкое удержаниеMIDSCIPR-1000BKСоветы по культуре 
200 и микро; L  Наконечники пипет, низкое удержаниеMIDSCIPR-200BKСоветы по культуре 
24-колодцевая пластинаКорнинг353047Культура
Тарелки диаметром 35 ммFalcon351008Для изоляции яичников и инкубации в энизматических средах
95% этанолMercedes Scientific1210Обработка тканей
АгарозеХёферGR140Микроформы
BioXtra Mineral Oil, лёгкое масло, подходит для культуры клеток эмбрионов мышиСигма-ОлдричM5310-500MLИспользуется как биосовместимый агент для снятия формы
Бычий сывороточный альбумин MP Biomedicals103700Медиа роста
Чистящие пылесовые, 10 унций, упаковка из 6 штукOffice Depot 110284Сжатый воздух
Прозрачная смола V4 1 лFormlabs, IncRS-F2-GPCL-04Смола для 3D-печати
Многоразовый пластиковый стакан Corning Low Form 100 мл, полипропиленовый, градуированныйКорнинг1000P-100Стакан для смешивания силиконовых компонентов и bbsp;
ДНКа IЦягэн79254Энзимная среда
Ecoflex 00-45 рядом с ClearSmooth-On, IncB09M8Y9PTVСиликоновый материал
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Медиа роста
Плод бычьего рогатого скотаSigmaF-3385Медиа роста
Сыворотка для плода быка (FBS)Сыворотка пикаPS-FB2Среда для диссекции, ферментативная среда и nbsp; Среды обслуживания и Созревающие медиа
Fisherbrand  Стерилизационные подсумкиFisher Scientific01-812-50 Стерилизационные подсумки
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)EMD Serono, Inc.Только Gonal-F Rx Медиа роста и Созревающие медиа
Gibco  DPBS, кальций, магнийFisher Scientific14-040-182 Физиологический раствор, буферированный фосфатом Дульбекко
Человеческий хорионический гонадотропин (ХГЧ)Сигма ОлдричC1063-1VLСозревающие медиа
Инсулин-трансферрин-селен (ITS)ThermoFisher41400045Медиа роста
Молекулярные зонды инвитрогенов родамин фаллоидинFisher ScientificR415Пятно от цитоскелета яйца
Блюда для ЭКОThermo Scientific150260Для выделения, выбора и предварительного равновесия фолликулов
Лейбовиц 15 (L15)Gibco11415-064Медиа для диссекции и Энзимная среда
ЛиберазаСигма Олдрич5401119001Энзимная среда
МЭМ? + GlutaMAXGibco32561-037Среда обслуживания, и bbsp; Медиа роста и Созревающие медиа
Эпидермальный фактор роста мышей (EGF)BD Biosciences354010Созревающие медиа
Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design DesiccatorThermo Scientific5311-0250Вакуумный десикатор 
ПарафинFisher Scientific83-30Обработка тканей и обработка Вложение
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122Медиа для диссекции, энзимные среды и Среда обслуживания
Советы для стриптизёршейОриджиоMXL3-200Культура
VECTASHIELD PLUS Антифейдный медиум с DAPIVector LaboratoriesH-2000Окраска ядра яйца
КсилолMercedes Scientific9840Обработка тканей
α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)Технология клеточной сигнализации5063SПятна от яйца тубулина
<Сильно>Снаряжение
Построить платформу 2Formlabs, IncBP-F3-02-01 Компонент 3D-принтера
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLImager для установки таймлапса
Форма 3 смоляный резервуар V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-01Компонент 3D-принтера
3D-принтер Form 3B+Formlabs, IncF3B-P-ПРИНТЕР3D-принтер стереолитографии (SLA) от Formlabs
Форма лечения Formlabs, IncFH-CU-01Платформа для отверждения 
Форма промывкиFormlabs, IncFH-WA-01Платформа для мойки
Пульверизатор с насосным испарителемVWR0309-3005Чтобы нанести средство для снятия формы
Фокусировщик/конденсатор для конденсатора для серий Edge (за исключением моделей T5 и T8)Dino-LiteN3C-RКомпонент имиджера для таймлапс-настройки
Комплект Mount Holder, объединяющий стойку RK-10 и удлинение рычага RK-10-EXDino-LiteRK-10AКомпонент имиджера для таймлапс-настройки
Тканевой вложительLeicaHistoCore ArcadiaВстраивать микроформы
Процессор тканейLeicaTP1020Для обработки микроформ
211DS Трясущий Инкубатор (Орбитальный Шейкер)Labnet InternationalI-5211-DSИнкубировать яичники в ферментативной среде для выделения фолликулов
Software 
Autodesk FusionAutodesk, IncПрограммное обеспечение для автоматизированного проектирования (CAD). Autodesk предоставляет бесплатный образовательный доступ через образовательную программу Autodesk.
DinoCapture 3.0 версии 1.1.1.3 Dino-Lite
ImageJНациональные институты здравоохраненияДля анализа ОКТ-изображений и измерения фолликулов
PreFormFormlabs, IncБесплатное программное обеспечение для подготовки печати, разработанное для работы с стереолитографией (SLA) принтеров Formlabs. 

Ссылки

  1. Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
  2. Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annu Rev Physiol. 79 (1), 237-260 (2016).
  3. Baerwald, A. R., Adams, G. P., Pierson, R. A. Ovarian antral folliculogenesis during the human menstrual cycle: a review. Hum Reprod Updat. 18 (1), 73-91 (2012).
  4. American Society for Reproductive Medicine. Testing and interpreting measures of ovarian reserve: a committee opinion. Fertil Steril. 114 (6), 1151-1157 (2020).
  5. Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
  6. Young, J. M., McNeilly, A. S. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle. Reproduction. 140 (4), 489-504 (2010).
  7. Liu, T., Qin, Q. Y., Qu, J. X., Wang, H. Y., Yan, J. Where are the theca cells from: the mechanism of theca cells derivation and differentiation. Chin Med J. 133 (14), 1711-1718 (2020).
  8. Abbara, A., Clarke, S. A., Dhillo, W. S. Novel concepts for inducing final oocyte maturation in in vitro fertilization treatment. Endocr Rev. 39 (5), 593-628 (2018).
  9. Conti, M., Franciosi, F. Acquisition of oocyte competence to develop as an embryo: integrated nuclear and cytoplasmic events. Hum Reprod Updat. 24 (3), 245-266 (2018).
  10. Williams, C. J., Erickson, G. F. Morphology and physiology of the ovary. , (2000).
  11. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. T., Castrillon, D. H., Felici, M. D., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  12. Jiang, Y., He, Y., Pan, X., Wang, P., Yuan, X., Ma, B. Advances in oocyte maturation in vivo and in vitro in mammals. Int J Mol Sci. 24 (10), 9059(2023).
  13. Clarke, H. J. Regulation of germ cell development by intercellular signaling in the mammalian ovarian follicle. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (1), (2018).
  14. Hsueh, A. J. W., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. J. M. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocr Rev. 36 (1), 1-24 (2015).
  15. Smitz, J., et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Hum Reprod Updat. 16 (4), 395-414 (2010).
  16. Resetkova, N., Hayashi, M., Kolp, L. A., Christianson, M. S. Fertility preservation for prepubertal girls: update and current challenges. Curr Obstet Gynecol Rep. 2 (4), 218-225 (2013).
  17. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W., Anderson, R. A. Fertility preservation in pre-pubertal girls with cancer: the role of ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 105 (1), 6-12 (2016).
  18. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility preservation in women. Nat Rev Endocrinol. 9 (12), 735-749 (2013).
  19. Cabeza, J. P., Gambini, A. Advancements and challenges in in vitro reproductive technologies for the conservation of equine species. Theriogenology Wild. 2, 100036(2023).
  20. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reprod Fertil. 2 (1), 35-46 (2021).
  21. Zhang, J., et al. An ex vivo ovulation system enables the discovery of novel ovulatory pathways and nonhormonal contraceptive candidates. Biol Reprod. 108 (4), 629-644 (2023).
  22. Gal, A., Gedye, K., Craig, Z. R., Ziv-Gal, A. Propylparaben inhibits mouse cultured antral follicle growth, alters steroidogenesis, and upregulates levels of cell-cycle and apoptosis regulators. Reprod Toxicol. 89, 100-106 (2019).
  23. Zhou, H., Shikanov, A. Three-dimensional hydrogel-based culture to study the effects of toxicants on ovarian follicles. Methods Mol Biol. 1758, 55-72 (2018).
  24. Silber, S. J., Goldsmith, S., Castleman, L., Hayashi, K. In vitro maturation, in vitro oogenesis, and ovarian longevity. Reprod Sci. 31 (5), 1234-1245 (2024).
  25. Tian, C., et al. Functional oocytes derived from granulosa cells. Cell Rep. 29 (13), 4256-4267 (2019).
  26. Zolfaghar, M., et al. Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells differentiate into oocyte like cells in vitro by follicular fluid and cumulus cells conditioned medium. Heliyon. 6 (10), e04992(2020).
  27. Psathaki, O. E., et al. Ultrastructural characterization of mouse embryonic stem cell-derived oocytes and granulosa cells. Stem Cells Dev. 20 (12), 2205-2215 (2011).
  28. Malik, H. N., Singhal, D. K., Saini, S., Malakar, D. Derivation of oocyte-like cells from putative embryonic stem cells and parthenogenetically activated into blastocysts in goat. Sci Rep. 10 (1), 10086(2020).
  29. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  30. Saitou, M., Hayashi, K. Mammalian in vitro gametogenesis. Science. 374 (6563), eaaz6830(2021).
  31. Yoshino, T., et al. Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells. Science. 373 (6552), (2021).
  32. Hikabe, O., et al. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature. 539 (7628), 299-303 (2016).
  33. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variables. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  34. Green, L. J., Shikanov, A. In vitro culture methods of preantral follicles. Theriogenology. 86 (1), 229-238 (2016).
  35. Wycherley, G., Downey, D., Kane, M. T., Hynes, A. C. A novel follicle culture system markedly increases follicle volume, cell number and oestradiol secretion. Reproduction. 127 (6), 669-677 (2004).
  36. Nation, A., Selwood, L. The production of mature oocytes from adult ovaries following primary follicle culture in a marsupial. Reproduction. 138 (2), 247-255 (2009).
  37. Xiao, S., Zhang, J., Romero, M. M., Smith, K. N., Shea, L. D., Woodruff, T. K. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5 (1), 17323(2015).
  38. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2022).
  39. Tomaszewski, C. E., DiLillo, K. M., Baker, B. M., Arnold, K. B., Shikanov, A. Sequestered cell-secreted extracellular matrix proteins improve murine folliculogenesis and oocyte maturation for fertility preservation. Acta Biomater. 132, 313-324 (2021).
  40. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  41. Xu, Y., Duncan, F. E., Xu, M., Woodruff, T. K. Use of an organotypic mammalian in vitro follicle growth assay to facilitate female reproductive toxicity screening. Reprod Fertil Dev. 28 (9), 1295-1306 (2015).
  42. West, E., Shea, L., Woodruff, T. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  43. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod. 84 (4), 689-697 (2011).
  44. Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biol Reprod. 73 (5), 942-950 (2005).
  45. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  46. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142 (2), 309-318 (2011).
  47. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  48. Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnol Bioeng. 103 (2), 378-386 (2009).
  49. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Mol Hum Reprod. 28 (10), gaac033(2022).
  50. Brito, I. R., et al. Alginate hydrogel matrix stiffness influences the in vitro development of caprine preantral follicles. Mol Reprod Dev. 81 (7), 636-645 (2014).
  51. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  52. Amorim, C. A., Langendonckt, A. V., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  53. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  54. Thorne, J. T., Segal, T. R., Chang, S., Jorge, S., Segars, J. H., Leppert, P. C. Dynamic reciprocity between cells and their microenvironment in reproduction. Biol Reprod. 92 (1), 25(2015).
  55. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Biomed Eng. 16 (1), 29-52 (2014).
  56. Berkholtz, C., Shea, L., Woodruff, T. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  57. Zaniker, E. J., Hashim, P. H., Gauthier, S., Ankrum, J. A., Campo, H., Duncan, F. E. Three-dimensionally printed agarose micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  58. Fluks, M., Milewski, R., Tamborski, S., Szkulmowski, M., Ajduk, A. Spindle shape and volume differ in high- and low-quality metaphase II oocytes. Reproduction. 167 (4), (2024).
  59. Tomari, H., et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 17 (3), 268-274 (2018).
  60. Popescu, D. P., et al. Optical coherence tomography: fundamental principles, instrumental designs and biomedical applications. Biophys Rev. 3 (3), 155(2011).
  61. Fang, R., et al. Robotic visible-light optical coherence tomography visualizes segmental Schlemm's canal anatomy and segmental pilocarpine response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 47(2025).
  62. Kim, D., et al. In vivo quantification of anterior and posterior chamber volumes in mice: implications for aqueous humor dynamics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 18(2025).
  63. ImageJ user guide - IJ 1.46r | Analyze menu. , https://imagej.net/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.7 (2012).
  64. Takashima, T., Fujimaru, T., Obata, Y. Effect of in vitro growth on mouse oocyte competency, mitochondria and transcriptome. Reproduction. 162 (4), 307-318 (2021).
  65. Xu, J., Zelinski, M. B. Oocyte quality following in vitro follicle development. Biol Reprod. 106 (2), 291-315 (2021).
  66. Li, A., et al. Nuclear and cytoplasmic quality of oocytes derived from serum-free culture of secondary follicles in vitro. J Cell Physiol. 236 (7), 5352-5361 (2021).
  67. Jin, S. Y., Lei, L., Shikanov, A., Shea, L. D., Woodruff, T. K. A novel two-step strategy for in vitro culture of early-stage ovarian follicles in the mouse. Fertil Steril. 93 (8), 2633-2639 (2010).
  68. Xiao, S., Duncan, F. E., Bai, L., Nguyen, C. T., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Size-specific follicle selection improves mouse oocyte reproductive outcomes. Reproduction. 150 (3), 183-192 (2015).
  69. Pepling, M. E., Sundman, E. A., Patterson, N. L., Gephardt, G. W., Medico, L., Wilson, K. I. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  70. Canning, J., Takai, Y., Tilly, J. L. Evidence for genetic modifiers of ovarian follicular endowment and development from studies of five inbred mouse strains. Endocrinology. 144 (1), 9-12 (2003).
  71. Hirshfeld-Cytron, J. E., Duncan, F. E., Xu, M., Jozefik, J. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Animal age, weight and estrus cycle stage impact the quality of in vitro grown follicles. Hum Reprod. 26 (9), 2473-2485 (2011).
  72. Tingen, C. M., Bristol-Gould, S. K., Kiesewetter, S. E., Wellington, J. T., Shea, L., Woodruff, T. K. Prepubertal primordial follicle loss in mice is not due to classical apoptotic pathways. Biol Reprod. 81 (1), 16-25 (2009).
  73. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  74. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  75. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), e13259(2020).
  76. Umehara, T., Richards, J. S., Shimada, M. The stromal fibrosis in aging ovary. Aging (Albany NY). 10 (1), 9-10 (2018).
  77. Pietroforte, S., Plough, M., Amargant, F. Age-associated increased stiffness of the ovarian microenvironment impairs follicle development and oocyte quality and rapidly alters follicle gene expression. bioRxiv. , (2024).
  78. McElhinney, K. L., Rowell, E. E., Laronda, M. M. Encapsulation of bovine primordial follicles in rigid alginate does not affect growth dynamics. Bioengineering. 11 (7), 734(2024).
  79. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB J. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  80. Sosa, E., et al. Reconstituted ovaries self-assemble without an ovarian surface epithelium. Stem Cell Rep. 18 (11), 2190-2202 (2023).
  81. Rogers, H. B., et al. Dental resins used in 3D printing technologies release ovo-toxic leachates. Chemosphere. 270, 129003(2021).
  82. de Almeida Monteiro Melo Ferraz, M., et al. Potential health and environmental risks of three-dimensional engineered polymers. Environ Sci Technol Lett. 5 (2), 80-85 (2018).
  83. Bomba-Warczak, E. K., et al. Exceptional longevity of mammalian ovarian and oocyte macromolecules throughout the reproductive lifespan. eLife. 13, RP93172(2024).
  84. Rajendran, S., et al. Automatic ploidy prediction and quality assessment of human blastocysts using time-lapse imaging. Nat Commun. 15 (1), 7756(2024).
  85. Bori, L., Meseguer, F., Valera, M. A., Galan, A., Remohi, J., Meseguer, M. The higher the score, the better the clinical outcome: retrospective evaluation of automatic embryo grading as a support tool for embryo selection in IVF laboratories. Hum Reprod. 37 (6), 1148-1160 (2022).
  86. Merces, G. O. T., Kennedy, C., Lenoci, B., Reynaud, E. G., Burke, N., Pickering, M. The incubot: a 3D printer-based microscope for long-term live cell imaging within a tissue culture incubator. HardwareX. 9, e00189(2021).
  87. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  88. Pernodet, N., Maaloum, M., Tinland, B. Pore size of agarose gels by atomic force microscopy. Electrophoresis. 18 (1), 55-58 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3Din vitro
Производство и использование настраиваемых агарозных форм для культуры яичников мышей без каркаса
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.