Описаны методы культивирования фолликулов яичников в новой агарозной плесени, не содержащей каркаса, которая дополняет гаметогенез in vitro .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Производство и использование настраиваемых агарозных форм для культуры яичников мышей без каркаса
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фолликул яичника является функциональной единицей яичника, которая вырабатывает гормоны и гаметы, необходимые для поддержания женской репродуктивной функции и здоровья. Способность повторять фолликулогенез, овуляцию и лютеинизацию in vitro имеет широкое базовое, трансляционное и клиническое применение. Наиболее совершенные системы роста фолликулов in vitro поддерживают трехмерную (3D) архитектуру фолликула, которая имеет решающее значение для развития мейотически компетентных ооцитов метафазы II у человека. Недавно был разработан и валидирован бескаркасный метод роста многослойных вторичных фолликулов мышей in vitro . Для этого были использованы изготовленные на заказ 3D-печатные формы для микромоделирования агарозы с микролунками, которые учитывают объемное расширение фолликулов. Фолликулы, выращенные в этой среде, свободной от каркасов, показали сопоставимую выработку гормонов и жизнеспособность по сравнению с хорошо зарекомендовавшими себя системами инкапсулированного in vitro роста фолликулов (eIVFG) на основе альгината. Важно отметить, что агарозные микролунки являются масштабируемым методом, менее технически сложным и демонстрируют улучшенный рост фолликулов и скорость овуляции по сравнению с eIVFG. Эта методология позволяет изготавливать индивидуальные формы, которые биосовместимы с ооцитом, клеткой, обладающей высокой чувствительностью к специфическим материалам фильтратам и другим загрязнителям окружающей среды. Кроме того, фолликулы в этой системе культивируются в той же фокальной плоскости, что позволяет проводить покадровую визуализацию и анализ в режиме реального времени. Чтобы повысить доступность этого нового подхода, в данной статье подробно описаны методы, необходимые для проектирования и 3D-печати мастер-форм, создания силиконовых форм для 24- или 96-луночных планшетов и культивирования изолированных многослойных вторичных фолликулов яичников в агарозных формах. Эта установка также может быть интегрирована с экономичной системой покадровой визуализации, позволяющей проводить морфокинетический анализ. Кроме того, формы могут быть залиты парафином для последующего гистологического анализа. В целом, этот удобный для пользователя метод является универсальным инструментом для культивирования фолликулов и может быть дополнительно настроен для содействия дифференцировке и созреванию половых клеток в контексте фолликула для поддержания полного гаметогенеза in vitro .
Введение
Ооцит, или женская гамета, при оплодотворении отдает эмбриону основную часть цитоплазмы и половину генетического материала, что имеет важное значение для развития следующего поколения. Оогенез начинается во время эмбрионального развития, когда первичные половые клетки вступают в мейоз и останавливаются в профазе I. Эти ооциты находятся внутри примордиальных фолликулов и составляют овариальный резерв, конечный и невозобновляемый пул, из которого они постепенно рекрутируются. Фолликулы развиваются в процессе, известном как фолликулогенез, с целью в конечном итоге получить зрелую гамету, способную к оплодотворению....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных, связанные с этим протоколом, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Северо-Западного университета и выполнены в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Адаптация конструкции мастер-формы
В этом разделе описываются первые шаги, выполненные на этапе проектирования (рис. 1), на котором специализированные микролунки вводятся в систему автоматизированного проектирования (САПР) мастер-фо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы определить, поддерживались ли выживаемость и рост фолликулов с помощью этой новой технологии, как описано в разделе 7 протокола, фолликулы тех же мышей были выделены и культивированы параллельно в агарозных микроформах или инкапсулированы в 0,5% альгинат. Репрезентативные изображения фолликулов из каждого второго дня культивирования продемонстрировали нормальное развитие, рост и формирование антральной полости на протяжении всего периода культивирования (рис. 6.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Гаметогенез и созревание in vitro являются ключевыми технологиями для фундаментального понимания биологии ооцитов с потенциальными применениями в вспомогательных репродуктивных технологиях, сохранении фертильности и сохранении видов. Методы поддержки ЭКО часто основываются на совместном культивировании с соматическими клетками для создания реконструированных яичников30. Важность этих опорных клеток хорошо известна in vivo, где фолликулярное сомат.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа финансировалась Национальными институтами детского здоровья и развития человека (R01HD105752 к F.E.D и T32HD094699 к E.J.Z) и программой SenNet Общего фонда NIH (U54AG075932 и UH3CA268105 до F.E.D.) и грантом Фонда Билла и Мелинды Гейтс (INV-003385 для F.E.D.). В соответствии с условиями гранта Фонда Билла и Мелинды Гейтс, общая лицензия Creative Commons Attribution 4.0 уже была присвоена версии рукописи, принятой автором, которая может возникнуть в результате этой заявки.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <Сильные>Материалы и химикаты | |||
| 50 мл полистиролных центрифугных трубок | Globe Scientific | 941-11017-CS | |
| Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл | Fisher Scientific | MCT-150 | Для snap, freeze и сохранения носителей |
| 100-мм тарелка, необработанная | Fisher Scientific | 08-757-100D | Для изготовления и хранения агарозных микроформ |
| 100% этанол | Mercedes Scientific | 1200 | Обработка тканей |
| 1000 и микро; L Наконечники пипет, низкое удержание | MIDSCI | PR-1000BK | Советы по культуре |
| 200 и микро; L Наконечники пипет, низкое удержание | MIDSCI | PR-200BK | Советы по культуре |
| 24-колодцевая пластина | Корнинг | 353047 | Культура |
| Тарелки диаметром 35 мм | Falcon | 351008 | Для изоляции яичников и инкубации в энизматических средах |
| 95% этанол | Mercedes Scientific | 1210 | Обработка тканей |
| Агарозе | Хёфер | GR140 | Микроформы |
| BioXtra Mineral Oil, лёгкое масло, подходит для культуры клеток эмбрионов мыши | Сигма-Олдрич | M5310-500ML | Используется как биосовместимый агент для снятия формы |
| Бычий сывороточный альбумин | MP Biomedicals | 103700 | Медиа роста |
| Чистящие пылесовые, 10 унций, упаковка из 6 штук | Office Depot | 110284 | Сжатый воздух |
| Прозрачная смола V4 1 л | Formlabs, Inc | RS-F2-GPCL-04 | Смола для 3D-печати |
| Многоразовый пластиковый стакан Corning Low Form 100 мл, полипропиленовый, градуированный | Корнинг | 1000P-100 | Стакан для смешивания силиконовых компонентов и bbsp; |
| ДНКа I | Цягэн | 79254 | Энзимная среда |
| Ecoflex 00-45 рядом с Clear | Smooth-On, Inc | B09M8Y9PTV | Силиконовый материал |
| F-12 + GlutaMAX | Gibco | 31765-035 | Медиа роста |
| Плод бычьего рогатого скота | Sigma | F-3385 | Медиа роста |
| Сыворотка для плода быка (FBS) | Сыворотка пика | PS-FB2 | Среда для диссекции, ферментативная среда и nbsp; Среды обслуживания и Созревающие медиа |
| Fisherbrand Стерилизационные подсумки | Fisher Scientific | 01-812-50 | Стерилизационные подсумки |
| Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) | EMD Serono, Inc. | Только Gonal-F Rx | Медиа роста и Созревающие медиа |
| Gibco DPBS, кальций, магний | Fisher Scientific | 14-040-182 | Физиологический раствор, буферированный фосфатом Дульбекко |
| Человеческий хорионический гонадотропин (ХГЧ) | Сигма Олдрич | C1063-1VL | Созревающие медиа |
| Инсулин-трансферрин-селен (ITS) | ThermoFisher | 41400045 | Медиа роста |
| Молекулярные зонды инвитрогенов родамин фаллоидин | Fisher Scientific | R415 | Пятно от цитоскелета яйца |
| Блюда для ЭКО | Thermo Scientific | 150260 | Для выделения, выбора и предварительного равновесия фолликулов |
| Лейбовиц 15 (L15) | Gibco | 11415-064 | Медиа для диссекции и Энзимная среда |
| Либераза | Сигма Олдрич | 5401119001 | Энзимная среда |
| МЭМ? + GlutaMAX | Gibco | 32561-037 | Среда обслуживания, и bbsp; Медиа роста и Созревающие медиа |
| Эпидермальный фактор роста мышей (EGF) | BD Biosciences | 354010 | Созревающие медиа |
| Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Вакуумный десикатор |
| Парафин | Fisher Scientific | 83-30 | Обработка тканей и обработка Вложение |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140-122 | Медиа для диссекции, энзимные среды и Среда обслуживания |
| Советы для стриптизёршей | Ориджио | MXL3-200 | Культура |
| VECTASHIELD PLUS Антифейдный медиум с DAPI | Vector Laboratories | H-2000 | Окраска ядра яйца |
| Ксилол | Mercedes Scientific | 9840 | Обработка тканей |
| α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Технология клеточной сигнализации | 5063S | Пятна от яйца тубулина |
| <Сильно>Снаряжение | |||
| Построить платформу 2 | Formlabs, Inc | BP-F3-02-01 | Компонент 3D-принтера |
| Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0 | Dino-Lite | AF4915ZTL | Imager для установки таймлапса |
| Форма 3 смоляный резервуар V2.1 | Formlabs, Inc | RT-F3-02-01 | Компонент 3D-принтера |
| 3D-принтер Form 3B+ | Formlabs, Inc | F3B-P-ПРИНТЕР | 3D-принтер стереолитографии (SLA) от Formlabs |
| Форма лечения | Formlabs, Inc | FH-CU-01 | Платформа для отверждения |
| Форма промывки | Formlabs, Inc | FH-WA-01 | Платформа для мойки |
| Пульверизатор с насосным испарителем | VWR | 0309-3005 | Чтобы нанести средство для снятия формы |
| Фокусировщик/конденсатор для конденсатора для серий Edge (за исключением моделей T5 и T8) | Dino-Lite | N3C-R | Компонент имиджера для таймлапс-настройки |
| Комплект Mount Holder, объединяющий стойку RK-10 и удлинение рычага RK-10-EX | Dino-Lite | RK-10A | Компонент имиджера для таймлапс-настройки |
| Тканевой вложитель | Leica | HistoCore Arcadia | Встраивать микроформы |
| Процессор тканей | Leica | TP1020 | Для обработки микроформ |
| 211DS Трясущий Инкубатор (Орбитальный Шейкер) | Labnet International | I-5211-DS | Инкубировать яичники в ферментативной среде для выделения фолликулов |
| Software | |||
| Autodesk Fusion | Autodesk, Inc | Программное обеспечение для автоматизированного проектирования (CAD). Autodesk предоставляет бесплатный образовательный доступ через образовательную программу Autodesk. | |
| DinoCapture 3.0 версии 1.1.1.3 | Dino-Lite | ||
| ImageJ | Национальные институты здравоохранения | Для анализа ОКТ-изображений и измерения фолликулов | |
| PreForm | Formlabs, Inc | Бесплатное программное обеспечение для подготовки печати, разработанное для работы с стереолитографией (SLA) принтеров Formlabs. |
Ссылки
- Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
- Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
