Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель циркулирующей глиомы для исследований Т-клеточной терапии химерных антигенных рецепторов

410 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68881

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В соответствии с настоящим протоколом создана модель циркулирующей глиомы путем инъекции в латеральный желудочек для изучения терапевтического эффекта терапии Т-клетками с химерным антигенным рецептором in vivo.

Аннотация

Циркулирующие опухолевые клетки в спинномозговой жидкости (СМЖ) являются значимым фактором рецидива опухоли и внутричерепного метастазирования при глиоме. Многие исследования пытаются определить эффективные стратегии для нацеливания и устранения циркулирующей опухоли в спинномозговой жидкости. Терапия Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR) часто используется при различных циркулирующих опухолях. Тем не менее, исследования ограничены из-за отсутствия подходящей модели циркулирующей глиомы. Здесь была разработана модель циркулирующей глиомы, которая была применена в исследованиях CAR T-клеточной терапии. Эта модель была сконструирована с использованием инъекции бокового желудочка, которая широко используется в местном лечении внутричерепных заболеваний. Клетки глиомы были введены в боковой желудочек для формирования внутричерепной первичной опухоли. Опухоли, которые были отторгнуты из бокового желудочка, использовались для указания на циркулирующую опухоль в ликворе. Модель проста в сборке и может быть применена в различных исследованиях по CAR T-клеточной терапии циркулирующей глиомы. В результате, модель циркулирующей глиомы обеспечивает уникальную модель метастазирования глиомы для эффективных исследований CAR T-клеточной терапии циркулирующей опухоли.

Введение

Глиома является наиболее распространенной первичной злокачественной опухолью головного мозга у взрослых 1,2. Современные методы лечения, включая хирургию, лучевую терапию и химиотерапию, демонстрируют ограниченную эффективность, с медианой выживаемости всего 14-15 месяцев 3,4,5. Циркулирующие клетки глиомы в спинномозговой жидкости играют решающую роль в рецидиве опухоли и внутричерепном метастазировании 6,7. Следовательно, существует острая необходимость в разработке более эффективных стратегий лечения для устранения циркулирующих клеток глиомы.

Последние исследования глиомы в основном сосредоточены на внутричерепных первичных опухолях 8,9. Тем не менее, самая важная проблема, которую необходимо решить в клинике, заключается в том, как нацелить и устранить циркулирующие клетки глиомы. Поэтому исследования циркулирующей глиомы до или после операции требуют большего внимания. Терапия Т-клетками с помощью химерного антигенного рецептора (CAR) является наиболее распространенной стратегией, используемой в исследованиях циркулирующих опухолевых клеток10,11. Однако из-за особого анатомического строения внутричерепных опухолей трудно разработать подходящую модель циркулирующей глиомы, которая имеет решающее значение для изучения циркулирующей глиомы 12,13,14,15,16.

В этом исследовании была создана уникальная модель циркулирующей глиомы, основанная на инъекции латерального желудочка. В этой модели клетки глиомы вводятся в латеральный желудочек, а внутричерепная первичная опухоль и циркулирующая опухоль в спинномозговой жидкости обнаруживаются с помощью биолюминесцентной визуализации in vivo и анализа проточной цитометрии на 10-й день. CAR-T-терапия была начата, когда опухолевая нагрузка у мышей с моделью циркулирующей глиомы достигала примерно 6,5× 10-5/с. Опухолевую нагрузку контролировали каждые 5 дней для оценки терапевтического эффекта CAR-T-клеток. Эта модель имитирует состояние десквамации опухолевых клеток у пациентов с глиомой и может быть использована в различных исследованиях циркулирующей глиомы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены и контролировались Институциональным наблюдательным советом и Комитетом по этике животных Нанкинского медицинского университета (IACUC-1905048). Для настоящего исследования были использованы самки мышей C57BL/6J в возрасте 6-8 недель. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

  1. Размещение мышей в барьерном режиме, цикл свет/темнота 12 ч/12 ч, температура окружающей среды 24 °C и относительная влажность 50% в клетке.
  2. Взвесьте мышей и обезболите их (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) с помощью внутрибрюшинной инъекции 50 мг/кг пентобарбитала натрия и 10 мг/кг ксилазина17.
    Примечание: Комбинация пентобарбитала натрия и ксилазина широко используется в процедурах стереотаксических инъекций у мышей. Надлежащая анестезия была подтверждена отсутствием реакции на пощипывание пальца ноги, что гарантировало, что животное было полностью без сознания до операции. Для предотвращения сухости и повреждения роговицы во время анестезии на глаза наносили ветеринарную офтальмологическую мазь.
  3. Удалите волосы на голове мыши с помощью бритвы для лабораторных животных и зафиксируйте голову и конечности мыши на стереотаксическом аппарате.
  4. Простерилизуйте голову мыши с помощью йодофора с ватным тампоном, а остальную часть тела мыши накройте стерильным хирургическим полотенцем.
  5. Разрежьте скальпелем волосистую часть головы примерно на 1 см по средней линии в верхней части правого лба.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть должным образом стерилизованы перед использованием для предотвращения инфекции. Следует соблюдать осторожность при обращении с инструментами во избежание травм, а все процедуры должны выполняться в стерильных условиях.
  6. Отрегулируйте носовой зажим и ушной стержень, убедившись, что разница высот оси Z между лямбда-швом и брегмой меньше или равна 0,05 мм.

2. Построение модели циркулирующей глиомы

  1. Отметьте точку на расстоянии 1,5 мм вправо от средней линии и на 1,1 мм до задней стороны брегмы с помощью ватного тампона, смоченного в горечавке фиолетовой (координаты: AP -1,1 мм, ML -1,5 мм от брегмы).
  2. С помощью миниатюрного черепного сверла диаметром 0,5 мм просверлите отверстия по целевым координатам для обнажения твердой мозговой оболочки.
  3. Промойте солевым раствором, чтобы удалить остатки костей.
  4. Наберите 5 мкл суспензии опухолевых клеток с помощью микрошприца с ограничительной по глубине пробкой (GL261-Luc-Gfp, 1×105 клеток/мкл в PBS, содержащей 0,1% BSA).
  5. Введите иглу со скоростью 0,2 мм/с на глубину 3,0 мм и верните иглу на 0,5 мм, сделайте паузу на 10 с для стабилизации давления в ткани.
  6. Вводите ячейки со скоростью 1 μл/мин с помощью откалиброванного насоса для микровпрыска с 10-минутным временем выдержки после впрыска для минимизации обратного потока.
  7. Медленно извлекайте микрошприц, придавливайте к месту инъекции стерильным ватным тампоном в течение 30-60 с.
  8. Зашить волосистую часть головы рассасывающимся хирургическим швом (6-0), а разрез повторно продезинфицировать йодофором.
  9. Поместите мышь на грелку с температурой 37 °C для согревания и следите за ее состоянием.
  10. Верните мышь в чистую клетку после демонстрации устойчивого рефлекса выпрямления и спонтанной локомоции.
  11. Визуализируйте мышь с помощью биолюминесцентной системы визуализации in vivo (IVIS Spectrum) для обнаружения трансплантированной опухоли на 10-й день после выноса опухоли.
  12. Введите мышке внутрибрюшинно D-люциферин калийной соли (150 мг/кг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте D-люциферин калийной солью с помощью стерильного D-PBS.
  13. Вызвать анестезию с помощью 2% изофлурана в дозе 1 л/минО2 в течение 10-минутного периода ожидания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран следует использовать в вентилируемом химическом колпаке, чтобы свести к минимуму воздействие паров анестетиков. Это необходимо для обеспечения безопасности как животных, так и исследователей во время процедуры.
  14. Поддерживайте анестезию на уровне 1,5% изофлурана через носовой конус.
  15. Выполняйте биолюминесцентную визуализацию с помощью IVIS Spectrum.
  16. Выполните сбор спинномозговой жидкости путем прокола сердцемозгового бачка у мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: СМЖ собирали путем прокола церебелломедуллярного цистерны у мышей под анестезией изофлурана. Все процедуры, включая анестезию, хирургическое воздействие и сбор образцов, проводились в условиях SPF, чтобы свести к минимуму риск заражения и инфекции. Мышей помещали в положение лежа на стереотаксическую раму, а цистерну тщательно экспонировали под рассекающим микроскопом. Игла для шприца Hamilton массой 27 г использовалась для прокола цистерны и сбора спинномозговой жидкости с использованием техники свободной руки. Примерно 5-10 мкл прозрачной спинномозговой жидкости было получено от каждой мыши. Чтобы еще больше снизить риск инфекции, место операции было стерилизовано йодофором перед пункцией, а все хирургические инструменты были автоклавированы. После сбора спинномозговой жидкости место прокола было аккуратно сжато стерильной ватой, чтобы предотвратить утечку жидкости. Затем мышей помещали на согревающую подушку и непрерывно контролировали до полного восстановления после анестезии. Для облегчения дискомфорта вводили послеоперационные анальгетики. За животными наблюдали ежедневно в течение как минимум трех дней подряд, чтобы убедиться в отсутствии неврологических симптомов или признаков инфекции.
  17. Выполнение проточной цитометрии для обнаружения опухолевых клеток в ликворе. Популяция GFP+ представляет собой опухолевые клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия мышиной глиомы GL261 была спроектирована для переноса люциферазы (Luc). Когда значение флуоресценции достигает ~5 × 105/с и в спинномозговой жидкости обнаруживаются опухолевые клетки, процедура проходит успешно. В качестве программного обеспечения для обработки изображений использовался Living Image 4.5.2, а параметры визуализации были установлены на люминесцентные.
  18. Отбор мышей с успешным переносом опухоли для оценки терапевтической эффективности CAR-T-клеток.

3. Лечение циркулирующей глиомы путем введения CAR-T-клеток в боковой желудочек

  1. Когда размер опухоли у мышей с моделью циркулирующей глиомы становится ~6,5 × 105 /с, выберите этих мышей для лечения CAR-T.
  2. Взвесьте мышей с циркулирующей глиомой и обезболите мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции 50 мг/кг пентобарбитала натрия и 50 мг/кг ксилазина.
  3. Повторите процесс выполнения пунктов 1.3−1.5.
  4. Отделите кожу головы и череп и точно определите отверстие, сделанное во время построения модели циркулирующей глиомы, и следуйте процедуре, упомянутой в шагах 2.2-2.3.
  5. Аспирируйте 10 мкл суспензии CAR-T-клеток с помощью микрошприца, осторожно введите иглу в боковой желудочек мыши, отрегулируйте глубину введения с помощью стереотаксического аппарата и медленно введите раствор CAR-T-клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с инъекцией клеток GL261, CAR-T-клетки были введены в правый боковой желудочек (координаты: AP -1,1 мм, ML -1,5 мм от брегмы) с глубиной инъекции 2,5 мм. Контрольную группу лечили PBS вместо CAR-T-клеток.
  6. Удерживайте иглу в течение 10 минут, затем медленно извлеките иглу и слегка прижмите точку инъекции стерильной марлей, чтобы предотвратить кровотечение после завершения инъекции. Зашить волосистую часть головы рассасывающимся хирургическим швом (6-0) и продезинфицировать разрез.
  7. Поместите мышь на грелку с температурой 37 °C для согревания и следите за ее состоянием.
  8. Верните мышь в чистую клетку после демонстрации устойчивого рефлекса выпрямления и спонтанной локомоции.
  9. Выполнение биолюминесцентной визуализации in vivo для мониторинга роста опухолей у мышей. Оптическая визуализация позволяет оценить терапевтическую эффективность CAR-T-клеток.
  10. Взвешивайте мышей через день и выполняйте визуализацию BLI каждые 5 дней, чтобы более точно отслеживать рост опухоли до тех пор, пока не будет достигнута конечная точка.
  11. Усыпить мышь и зафиксировать мозговую ткань в 4% параформальдегиде на 24-48 ч.
  12. Погрузите ткани в парафин и разделите их на ломтики толщиной 5 мкм.
  13. Депарафинизируйте срезы, регидратируйте с помощью сортированных спиртов, окрасьте гематоксилином, закрасьте эозином и закрепите срезы с помощью покровного стекла.
    Примечание: В настоящем исследовании конечной точкой был 30-й день, и мышей усыпляли путем передозировки пентобарбитала натрия с внутрибрюшинной инъекцией. Тушки мышей были переданы в Центр медицинских экспериментальных животных Нанкинского медицинского университета для утилизации. Выброшенные иглы были помещены в контейнер для острых предметов и переданы на факультет управления лабораторией и оборудованием Нанкинского медицинского университета для централизованной утилизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Принципиальная схема модели циркулирующей глиомы для CAR-T-терапии представлена на рисунке 1. CAR-T-клетки вводили в боковой желудочек с помощью микрошприца для демонстрации их терапевтического эффекта. Этот метод позволяет напрямую доставлять CAR-T-клетки в мозг, нацеливаясь на циркулирующие клетки глиомы. Процедура инъекции была проведена на 11-й день после имплантации клеток GL261 в латеральный желудочек мыши. В различные моменты времени (15, 20, 25 и 30 д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модель циркулирующей глиомы, созданная в этом исследовании с использованием инъекции бокового желудочка, обеспечивает значительный прогресс, предлагая ряд преимуществ по сравнению с существующими моделями. Техника инъекции бокового желудочка обладает высокой воспроизводимостью, что позволяет последовательно моделировать опухоль в относительно короткие сроки. Это делает его ценным инструментом для исследователей, стремящихся изучить распространение опухолевых клеток в спинномозговой жидко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данное исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (82230059), Программой развития ключевых исследований провинции Цзянсу Китая (BE2022770).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Рассасывающийся хирургический шовный материалШанхай Пудун Цзиньхуань Медикал Продактс Ко., ЛтдР611
КАР-ТКреативные биолаборатории
D-люциферин калийная сольMCEHY-12591B
GL261-Luc-GfpШанхай Чжун Цяо Синь Чжоу Биотехнология Ко., Лтд.ЗК0932
Биолюминесцентная система визуализации in vivoТанонТанон ABL X6
Бритва для лабораторных животныхBeyotime BiotechnologyФС600
МышейЦентр для животных Нанкинского медицинского университета
Микроинжекционный насосЗадний приводР462
МикрошприцГамильтон87943
Мини упражнение для черепаЗадний привод78001
Пентобарбитал натрия ChemSrc57-33-0
Стереотаксические аппаратыЗадний привод68043
КсилазинChemSrc7361-61-7

Ссылки

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CAR T
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.