Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественная оценка фагоцитоза аллогенных и ксеногенных эритроцитов макрофагами крыс in vitro

775 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68904

⸱

22 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Regenerative Medicine, and Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Jiangsu University, 2Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Large Animal Models for Biomedicine, and South China Institute of Large Animal Models for Biomedicine, School of Pharmacy and Food Engineering, Wuyi University, 4State Key Laboratory of Cell Biology, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 5Innovation and Transformation Center, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6Prometheus RegMed Tech Ltd, 7Department of Medicinal and Life Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе описан стандартизированный протокол in vitro для количественной оценки и сравнения скорости фагоцитоза ксеногенных (человеческих) и аллогенных (крысиных) эритроцитов выделенными макрофагами крыс.

Аннотация

Трансплантация ксеногенных клеток часто сталкивается со значительным иммунным отторжением, даже на животных моделях с иммунодефицитом. Среди остаточных иммунных компонентов макрофаги могут активно фагоцитозировать трансплантированные клетки человека, что создает проблему для долгосрочного приживления. Чтобы решить эту проблему, мы разработали стандартизированный анализ in vitro для количественной оценки макрофаг-опосредованного фагоцитоза эритроцитов человека по сравнению с эритроцитами крысы. Перитонеальные макрофаги крыс были изолированы, культивированы и подвергнуты воздействию эритроцитов человека или крысы. Эритроциты человека были идентифицированы с помощью CD235a, в то время как крысиные эритроциты были предварительно помечены DeepRed. Анализ проточной цитометрии проводили с использованием CD163 для выявления исключения макрофагов и йода пропидия (ПИ) из ворот живых клеток. Результаты показали существенную разницу в фагоцитарной активности: 5,08% макрофагов поглощали эритроциты человека, в то время как только 1,59% фагоцитировали эритроциты крыс, что дало относительный индекс фагоцитоза 3,21. Этот протокол позволяет количественно оценить иммунную совместимость и предлагает воспроизводимый метод оценки врожденных иммунных реакций при ксенотрансплантации. Он обладает потенциалом для уточнения выбора донора-реципиента и руководства иммуносупрессивными стратегиями в трансляционных исследованиях.

Введение

Использование ксеногенной трансплантации клеток, в частности, приживления клеток человека к животным моделям, является важной стратегией в биомедицинскихисследованиях. Он позволяет оценить выживаемость клеток, приживление и иммунные реакции в контролируемой среде in vivo . В то время как мышиные модели исторически доминировали в этой области благодаря хорошо описанной генетике и простоте манипуляций, их небольшой размер представляет собой существенное ограничение в исследованиях, требующих больших объемов крови или высокого выхода клеток. В отличие от этого, крысы обладают рядом преимуществ, включая большую массу тела, улучшенную физиологическую значимость для систем человека и более высокий выход биологических образцов, таких как кровь или перитонеальныемакрофаги. Следовательно, модели на крысах все чаще используются в исследованиях, связанныхс исследованиями кроветворения и иммунной системы.

Одной из основных проблем при ксеногенной трансплантации является иммунное отторжение. Даже в моделях с иммунодефицитом, где Т-клетки, В-клетки или NK-клетки генетически удалены, остаточные клетки врожденного иммунитета, особенно макрофаги, остаются функционально активными4. Макрофаги служат защитниками первой линии иммунной системы хозяина, распознавая и устраняя чужеродные клетки посредством фагоцитоза5. Этот процесс частично регулируется взаимодействием между сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPα) на макрофагах и CD47, сигналом «не ешь меня», выраженным на большинстве типов клеток. Когда CD47 из клеток человека не распознается SIRPα грызунов, это несоответствие может привести к усилению фагоцитоза. Даже у этих разрешительных иммунодефицитных животных это явление также существует 6,7.

Количественная оценка макрофаг-опосредованного фагоцитоза в этом контексте имеет решающее значение для оценки вероятности выживания клеток иоптимизации стратегий трансплантации. Несмотря на то, что для оценки иммунного отторжения были разработаны различные методы in vivo и ex vivo , стандартизированные анализы in vitro на фагоцитоз макрофагов остаются ограниченными. Традиционные методы, основанные на микроскопии, часто трудоемки и не имеют количественной строгости. Проточная цитометрия, напротив, предлагает одноклеточный анализ и количественную платформу, способную точно различать типы клеток и измерять поглощение фагоцитов с помощью обнаружения поверхностных маркеров.

В данной статье мы разработали стандартизированный анализ in vitro для оценки дифференциального фагоцитоза эритроцитов человека и крысы перитонеальными макрофагами крысы. Эритроциты служат идеальной моделью для анализа фагоцитоза благодаря своей простой структуре и экспрессии CD47, который действует как «собственный» сигнал для ингибирования макрофаг-опосредованного клиренса9. В этом протоколе перитонеальные макрофаги крысы собирают с помощью перитонеального лаважа, культивируют in vitro и подвергают воздействию либо человеческих эритроцитов, либо аллогенных крысиных эритроцитов, меченных DeepRed. После совместной инкубации проточную цитометрию используют для оценки интернализации эритроцитов макрофагами. Макрофаги идентифицируются по экспрессии CD163, эритроциты человека — по CD235a, а эритроциты крыс — по флуоресценции DeepRed. Мертвые клетки исключаются с помощью PI-окрашивания, что гарантирует, что анализируются только жизнеспособные макрофаги.

Этот подход позволяет точно количественно оценить фагоцитарную активность аллогенных и ксеногенных эритроцитов in vitro, что дает представление о степени макрофаг-опосредованного иммунного клиренса. В наших экспериментах макрофаги крыс продемонстрировали достоверно более высокий фагоцитоз эритроцитов человека (5,08%) по сравнению с эритроцитами крыс (1,59%), что дало относительный индекс фагоцитоза 3,21. Эти результаты подчеркивают важность врожденных иммунных механизмов в ксеногенных условиях и подчеркивают ценность этого анализа в доклинической валидации модели.

В заключение, представленный здесь протокол предлагает воспроизводимый и эффективный метод измерения фагоцитоза макрофагов in vitro. Он особенно полезен для исследователей, работающих в области ксенотрансплантации, исследования гемопоэтических стволовых клеток и тестирования на иммунологическую совместимость. Обеспечивая стандартизированную основу для количественного определения фагоцитоза, этот анализ может способствовать улучшению экспериментальной воспроизводимости и лучшему пониманию врожденных иммунных реакций в моделях межвидовой трансплантации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с участием животных проводились в соответствии с этическими политиками и процедурами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Цзянсу (UJS-IACUC) (Разрешение No. UJS-IACUC-2021090102). Это исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Аффилированной больницы Университета Цзянсу. Все образцы были собраны у пациентов, предоставивших информированное согласие. Удаленный надосадочный жидкость должен быть помещен в специальный резервуар для отходов и передан в инфекционное отделение больницы.

1. Выделение макрофагов

  1. Подготовка: Подготовьте необходимые материалы, включая подопытных крыс, контейнеры для анестезии, мензурки и изофлуран в качестве анестетика, и предварительно охладите центрифугу при 4 °C.
  2. Обезболивание и жертвоприношение крыс: Следуя рекомендациям по уходу за животными в учреждении, усыпляйте крыс после вдыхания чрезмерной анестезии изофлураном.
  3. Алкогольная дезинфекция: Поместите жертвенную крысу в мензурку и добавьте достаточное количество 75% этанола, чтобы полностью покрыть крысу. Замочить на 10 минут.
  4. Инъекция и смешивание брюшной жидкости: Продезинфицируйте брюшную полость крысы и введите 50 мл ледяного стерильного PBS в брюшную полость по средней линии с помощью шприца.
    1. Аккуратно встряхните крысу и помассируйте пальцами брюшную стенку, чтобы обеспечить тщательное перемешивание жидкости в брюшной полости. Массаж 2-3 минуты.
  5. Сбор брюшной жидкости: Сделайте небольшой разрез на брюшной стенке крысы, слегка наклоните тело и аспирируйте брюшную жидкость с помощью шприца.
  6. Центрифугирование: Центрифугируйте собранную жидкость при давлении 500 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Лизис эритроцитов: Добавьте в 3-5 раз больше объема клеточных гранул буфера для лизиса эритроцитов и аккуратно перемешайте в течение 1-2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если объем клеточной гранулы составляет 1 мл, добавьте 3-5 мл буфера для лизиса. Этот этап может быть выполнен при комнатной температуре или при 4 °C с последующим центрифугированием при 400-500 x g в течение 5 минут. Центрифугирование при 4 °C более эффективно. Из-за осмотического давления эритроциты будут лизироваться, и раствор станет красным. После центрифугирования удалите красную надосадочную жидкость.
    1. Рецепт буфера для лизиса эритроцитов (эритроцитов): растворите 8,3 г NH4Cl, 1,0 г KHCO3 и 1,8 мл 5% ЭДТА в 800 мл дистиллированного H2O, стерилизуйте фильтром через фильтр 0,2 мкм qs до 1000 мл с дистиллированным H2O и отрегулируйте pH 7,2 ~ 7,4. Если красный осадок все еще виден, повторяйте этот шаг до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и прозрачным. Как правило, небольшое количество остаточных эритроцитов не влияет на последующие анализы (если в грануле мало эритроцитов, этот этап можно пропустить).
  8. Промывка ячеек: Дважды промойте ячейки примерно 10 мл предварительно охлажденной среды RPMI 1640. Центрифугируйте при температуре 500 x g в течение 5 минут при температуре 4 °C каждый раз и выбросьте надосадочную жидкость.
  9. Ресуспендия и подсчет клеток: Ресуспендирование клеток в предварительно охлажденной среде, состоящей из RPMI 1640 + 1 % FBS + 1 % PS, подсчет клеток с помощью окрашивания Trypan Blue и оценка жизнеспособности клеток.
  10. Культура клеток: Если требуется культура, засейте клетки плотностью 1 × 106/мл в 24-луночный культуральный планшет с 1 мл среды RPMI 1640-10% FBS-1% PS на лунку. Через 2 ч инкубации замените среду и промойте лунки 1-2 раза средой RPMI 1640 для удаления неадгезивных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адгезивные клетки образуют монослой макрофагов. Если требуется экстракция РНК, добавьте 1 мл тризола в клеточную гранулу, сделайте пипетку несколько раз, чтобы разрушить клетки, и переложите смесь в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для немедленной экстракции РНК или храните при температуре -80 °C. Для анализа FACS отрегулируйте количество клеток до 1 × 106 на пробирку, добавьте 20 μL буфера FACS и продолжайте окрашивание FACS. Буфер FACS: DPBS + 2% FBS, фильтр стерилизовать через фильтр 0,22 мкм, хранить при температуре 4 °C).

2. Сбор эритроцитов крысы или человека

  1. Способ приготовления: Предварительно промыть 15 мл центрифужных пробирок и 10 мл шприцев с гепарином.
  2. Сбор крови сердца крысы: После обезболивания и принесения крысы в жертву осторожно отрежьте ножницами небольшой участок хвоста крысы и соберите кровь из хвостовой вены.
  3. Забор человеческой крови: Сбор человеческой крови с помощью техники венепункции.
  4. Смешивание образцов крови: Смешайте 1 мл PBS с 1 мл венозной крови человека или крысы.
  5. Разделение градиента плотности по Фиколлу: Добавьте 1,5 мл раствора Фиколла с плотностью 1,077 в центрифужную пробирку для периферической крови человека объемом 15 мл; добавить 1,5 мл раствора Фиколла плотностью 1,084 мл в центрифужную пробирку для крови крыс объемом 15 мл.
  6. Наслоение образцов крови: Медленно нанесите разбавленные образцы крови вдоль стенки пробирки центрифуги на соответствующий раствор градиента плотности.
  7. Центрифугирование: центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при температуре 18-20 °C.
  8. Удаление слоев плазмы и лимфоцитов: Удалите верхний слой плазмы, слой лимфоцитов и слой раствора Фиколла, оставив только нижний слой эритроцитов.
  9. Промывание эритроцитов: Промойте эритроциты один раз 10 мл PBS.
  10. Центрифугирование и удаление надосадочной жидкости: Центрифугируйте при давлении 400 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
  11. Ресуспензия и подсчет клеток: Добавьте 1 мл среды RPMI 1640 в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, смешайте с соответствующим количеством гранул эритроцитов и выполните подсчет клеток.

3. Анализ на фагоцитоз in vitro

  1. Выделение и культивирование макрофагов: Изолируйте макрофаги и затравите их с плотностью 1 ×10 6 клеток/лунку в 12-луночный культуральный планшет. Инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 ч, чтобы клетки прилипли.
  2. Удаление неадгезивных клеток: Через 2 ч инкубации тщательно удалите неадгезивные клетки и аккуратно промойте средой RPMI 1640.
  3. Продолжение культивирования: Продолжайте культивировать адгезивные макрофаги в течение 2 ч, чтобы обеспечить полную адгезию к нижней части культурального планшета.
  4. Лечение голоданием: через 2 ч замените среду бессывороточным препаратом RPMI 1640 и инкубируйте в условиях голодания в течение 2 ч для усиления фагоцитарной активности макрофагов.
  5. Добавление человеческих клеток: Добавьте в культуральную пластину человеческие клетки, предварительно окрашенные DeepRed, и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 часов, чтобы макрофаги могли фагоцитировать клетки человека.
  6. Заключение и анализ: После анализа фагоцитоза наблюдайте за фагоцитарной активностью под микроскопом или количественно оценивайте с помощью проточной цитометрии (FACS).

4. Проточная цитометрия

  1. Клеточная подготовка: Расщепите клетки с 0,05% трипсина-ЭДТА и остановите переваривание с помощью среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS. Центрифугируйте клетки, выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в буфере FACS и подсчитайте их. Подготовьте 1 × 10по 6 клеток в каждой пробирке в двух пробирках. Кроме того, приготовьте одну пробирку человеческих эритроцитов и одну пробирку крысиных эритроцитов.
  2. Приготовление пробирки с одним окрашиванием: Добавьте антитело CD163 мыши и крысы в одну пробирку с образцом, антитело мыши против человеческого CD235a в пробирку с эритроцитами человека и DeepRed в пробирку с эритроцитами крысы.
    1. Инкубируйте эти трубки на льду, защищенном от света, в течение 30 минут, перемешивая каждые 10 минут. Добавьте 1 мл буфера FACS, чтобы смыть все несвязанные антитела, центрифугуйте и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте элементы в 500 мкл буфера FACS.
  3. Подготовка образца: Добавьте в пробирки с образцами CD163 против мыши, антитела против человека CD235a мыши и DeepRed. Выдерживать на льду, защищенном от света, в течение 30 минут, с перемешиванием каждые 10 минут. Добавьте 1 мл буфера FACS в каждую пробирку с образцом, чтобы смыть все несвязанные антитела, центрифугуйте и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте элементы в 500 мкл буфера FACS.
  4. Анализ: Исключить клеточную адгезию путем стробирования по FSC-H в сравнении с FSC-A. Используйте пробирки с одним пятном для регулировки соответствующих настроек напряжения и компенсации перед анализом образцов (Рисунок 1). Анализируйте данные с помощью программного обеспечения FlowJo v10.8.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки компенсации использовались элементы управления CD163-FITC и PI с одинарным окрашиванием.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью анализа проточной цитометрии мы можем сделать вывод о скорости фагоцитоза макрофагов крысы в отношении эритроцитов человека и эритроцитов крысы. Мертвые клетки сначала исключаются с помощью ПИ. CD163-положительные макрофаги, экспрессирующие CD235a-положительные, указывают на фагоцитоз эритроцитов человека. Доля макрофагов, которые имеют фагоцитированные hRBCs, определяется как скорость фагоцитоза макрофагов крыс по отношению к эритроцитам человека. Аналогичным образом рассчитыв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании был создан надежный и воспроизводимый in vitro анализ для оценки макрофагально-опосредованного фагоцитоза как ксеногенных и аллогенных эритроцитов. В этом исследовании эритроциты человека были помечены CD235a-BV421, в то время как эритроциты крыс были окрашены красителем DeepRed. Когда макрофаги фагоцитируют меченые эритроциты, конъюгированные антитела (CD235a-BV421) или краситель (DeepRed) интернализуются вместе. В результате сами макрофаги проявляют соответ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

JYG является научным консультантом Prometheus RegMed Tech Ltd. Левые авторы не заявляют о потенциальном конфликте интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить г-жу Мэй Фан, г-жу Минь Ма, г-жу Юй-Тун Мэн и г-на Цюань-Кай Лэя за их первоначальный вклад. Это исследование было частично профинансировано Национальным фондом естественных наук Китая (82270697), Проектом планирования науки и технологий провинции Гуандун Китая (2021B1212040016), Фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (2023A1515012574), Подразделением культивирования ключевых медицинских дисциплин провинции Цзянсу (JSDW202229) и Инновационным фондом лаборатории клеточной экосистемы Хайхэ (HH24KYZX0008), Китайским фондом молодежного предпринимательства и занятости - Incaier Public Welfare Фонд (HH25KYHX0003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин-ЭДТАThermoFisher25300062
Трекер глубоких красных клетокThermoFisher  C34565Порошок (15 и мю; g) был распущен в DMSO (20 и mu; L)
Диметилсульфоксид (DMSO)SigmaD2650
Физиологический раствор с фосфатным буфером Дульбекко (DPBS)ThermoFisherC10010500BT
Ficoll-Paque PLUSЦитива17144002
Ficoll-Paque PREMIUMЦитива17544602
Антитело к CD235a BV421 к мышиBD Biosciences562938
Антитело FITC CD163 к мыши против крысBIO-RADMCA342F
Белок KSigmaP2308
RPMI 1640ThermoFisher11875093

Ссылки

  1. Ito, M., et al. NOD/SCID/GAMMAC(null) mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  2. Szpirer, C. Rat models of human diseases and related phenotypes: A novel inventory of causative genes. Mamm Genome. 33 (1), 88-90 (2022).
  3. Zhang, L., et al. Survival-assured liver injury preconditioning (SALIC) enables robust expansion of human hepatocytes in Fah Rag2(-/-) IL2rg(-/-) rats. Adv Sci (Weinh). 8 (19), e2101188(2021).
  4. Rongvaux, A., et al. Corrigendum: Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 35 (12), 1211(2017).
  5. Furuya, K., et al. The evidence of a macrophage barrier in the xenotransplantation of human hematopoietic stem cells to severely immunodeficient rats. Xenotransplantation. 28 (4), e12702(2021).
  6. Barclay, A. N., Van den Berg, T. K. The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPα) and CD47: Structure, function, and therapeutic target. Annu Rev Immunol. 32, 25-50 (2014).
  7. Ide, K., et al. Role for CD47-SIRPalpha signaling in xenograft rejection by macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5062-5066 (2007).
  8. Matlung, H. L., et al. The CD47-SIRPα signaling axis as an innate immune checkpoint in cancer. Immunol Rev. 276 (1), 145-164 (2017).
  9. Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  10. Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Cytometry A. 85 (4), 313-321 (2014).
  11. Joffe, A. M., Bakalar, M. H., Fletcher, D. A. Macrophage phagocytosis assay with reconstituted target particles. Nat Protoc. 15 (7), 2230-2246 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD163CD235ain vitro
Количественная оценка фагоцитоза аллогенных и ксеногенных эритроцитов макрофагами крыс in vitro
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.