Методическая статья

Простая и эффективная процедура лечения гемостаза в артериях мышей

391 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68907

⸱

28 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Данное исследование направлено на разработку эффективного метода достижения гемостаза в артериях мышей.

Аннотация

Во время артериальной пункции или канюляции у мышей часто требуется постоянное перевязывание артерии из-за трудностей достижения гемостаза после удаления иглы. Это приводит к постоянному ишемическому повреждению в области снабжения тканей. Такая локализованная ишемия часто вызывает вторичные осложнения, ухудшая результаты экспериментов на животных моделях. Текущий метод направлен на герметизацию места прокола после процедуры, сохраняя нормальный кровоток, тем самым предотвращая послеоперационную ишемию. Этот метод включает извлечение фрагмента жировой ткани из самого экспериментального животного, проведение артериальной пункции стандартными методами и затем обмотывание места прокола жировой подушечкой для достижения гемостаза при сохранении кровотока. В этом исследовании была проведена двусторонняя пункция общей сонной артерии на мышах, а затем гемостаз с использованием техники обмотки жира. Лазерная спекл-контрастная визуализация (LSCI) не выявила различий в изменениях кровотока в мозге между фиктивной и оперированной группами мышей, а значимых изменений в дооперационных и послеоперационных измерениях кровотока в оперированной группе не наблюдалось. Гистологическая оценка, проведённая через 7, 14 и 28 дней после операции, показала: (1) сохранена архитектура мозга (H&E-окрашивание), (2) нетронутая морфология нейронов без дегенеративных изменений (окрашивание по Нисслу), и (3) отсутствие патологических изменений в срезах мозга. Эта техника артериального гемостаза использует гибкость жировой ткани и физиологические механизмы свертывания. Процедура включает в себя: (1) обмотывание аутологичного жира вокруг места проколов, (2) закрепление его швами для оптимального контакта с артериальной адвентицией и (3) пропускание выходящей крови на границу жира и артерии, где она проходит свертывание. Этот тройной механизм обеспечивает надёжный гемостаз, сохраняя проходимость артерий и предотвращая ишемические осложнения после операции. Метод демонстрирует заметную процедурную простоту, клиническую эффективность и отличный трансляционный потенциал.

Введение

В животных моделях создание артериального повреждения является широко используемым экспериментальным подходом для моделирования различных патологических состояний, включая модели ишемии и реперфузии мозга, модели атеросклероза сонной артерии (CCA) или аорты (AO), а также модели ишемии спинного мозга.

Взяв модель мышей с церебральной ишемией-реперфузией (MCAO) в качестве примера, современный стандартный подход к моделированию 1,2,3 включает в себя: выделение наружной сонной артерии (ЭКА), перевязывание её дистального конца, зажатие проксимальной ЭКА артериальной зажимкой при наложении шва, создание проколового отверстия между этими точками, ретроградное вставление филамента через ККА, закрепление сосуда и филамента швом для стойки, пересечение ЭКА между местом прокола и дистальной перевязкой, освобождение артериального клипса, перенаправление филамента во внутреннюю сонную артерию (ИКА) для перекрытия средней церебральной артерии, а после удаления филамента — связывание проксимальной ЭКА.

Хотя эта процедура достигает реперфузии, она лишь восстанавливает кровоток между общим и ICA, оставляя ЭКА навсегда отключённой. Это рассечение ЭКА вызывает ишемическое повреждение ипсилатеральных областей лица — непреднамеренное повреждение, которое не только усложняет хирургическую процедуру, но и вызывает спутанную травму у экспериментальных животных, потенциально нарушая результаты исследований. Более тревожно, что в некоторых экспериментальных протоколах 4,5 исследователи проводят прямую пункцию CCA, вводят шов для установления MCAO, затем немедленно удаляют, после чего проводится постоянное перевязывание на обоих концах места прокола для гемостаза. Однако этот метод напрямую повышает сосудистое давление, тем самым повышая сердечную нагрузку и потенциально приводя к сердечнойнедостаточности 6.

Используя модель эндотелиального повреждения CCA или AO у мыши с диетой с высоким содержанием жиров для установления атеросклероза в качестве примера, традиционная методика 7,8,9,10 включает проведение артериальной пункции в ККА, брюшной аорте (АА) или бедренной артерии (КФА), введение баллонного катетера для индуцирования эндотелиальной денудации и достижение гемостаза путём постоянного перевязывания обоих концов места прокола. Этот стандартный подход имеет несколько критических ограничений: обязательная перевязка вызывает локализованную ишемию вдально от места окклюзии. Более того, липидное накопление происходит в местах перевязки. Валидность модели компромисса изменяется за счёт влияния на локальную гемодинамику, что мешает доставке лекарств для целевых поражений и искажает результаты фармакологической оценки.

В модели ишемии спинного мозга у мыши процедура включает артериальную пункцию (через доступ CCA, AA или CFA), после чего введение баллонного катетера для индуцирования ишемии в целевыхучастках 11. После удаления баллона традиционный гемостаз достигается путём постоянного перевязывания места прокола в обеих сторонах.

Во всех трёх вышеупомянутых моделях постпункционный гемостаз достигается равномерно путём двусторонней перевязки места прокола. Хотя этот подход эффективен для контроля кровотечений, он неизбежно вызывает локализованную ишемию, что приводит к вторичным осложнениям, которые в конечном итоге подрывают валидность модели. Поддержание сосудистой проходимости во время гемостатических процедур является физиологически и экспериментально критичным. Поэтому в этой статье представлен инновационный, простой и эффективный метод артериального гемостаза для экспериментов на мышах. Процедура заключается в том, чтобы сначала зажать оба конца места пункции артериальными сосудистыми зажимами, затем обмазать артерию жировой подушкой шириной 3 мм × 3 мм × 1 мм, чтобы закрыть пункцию. Жировая подушечка закрепляется на месте с помощью лигатурного шва вокруг артерии. Артериальные клипсы постепенно освобождаются, а плотность связки регулируется в зависимости от кровотечения до достижения полного гемостаза. Такой подход восстанавливает кровоток, поддерживает нормальную гемодинамику и предотвращает ишемическое повреждение окружающих тканей, вызванное постоянной связкой сосудов. Он особенно полезен для долгосрочного постмоделирования наблюдений за состоянием у мышей и оценки фармакологических вмешательств, что значительно повышает экспериментальную строгость доклинических исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в строгом соответствии с Руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных (Протокол Утверждения No SNLL25040501; Лицензия на использование животных No SYXK(Liao)2021 - 0010) учреждён Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Шэньянского сельскохозяйственного университета. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Детали и документация по животным: Документируйте все данные исследований на животных в соответствии с рекомендациями ARRIVE (Animal Research: отчёт о экспериментах in vivo). Используйте самцов мышей Balb/C возрастом 6-8 недель, весом 22 г ± 4 г. Поддерживайте жилищные условия на уровне 24 ± 2 °C с относительной влажностью 55% ± 5% при 12-часовом цикле свет/темнота.
  2. Приготовление животных
    1. Анестезиируйте мышей с помощью изофлуран-вапорайзера (согласно утверждённым институциональными протоколами). Индуцировать анестезию 4% изофлураном, затем поддерживать при 2% изофлурана.
    2. После анестезии депилируйте шейную и черепную области и продезинфицируйте открытую кожу повидон-йодом, затем введите 75% этанола для удаления остатков.
    3. Положите мышей на грелку при температуре 37 °C для всех последующих экспериментальных процедур.
  3. Измерение базового кровотока в мозге у мышей
    1. Поставьте мышей в положение лежа. Сделайте разрез на центральной линии кожи головы, чтобы обнажить теменные кости. Аккуратно рассеките и удалите верхний фасциальный слой с поверхности черепа.
    2. Отрегулировать систему LSCI для сканирования открытой теменной кости мыши при увеличении в 10 раз и записать исходные данные о кровотоке в мозге.
  4. Собрать жировую подушечку и выполнить прокол артерии
    1. Перестановите мышей в положении на спине. Сделайте разрез шейки матки на средней линии. Собрать подкожную жировую ткань толщиной 3 мм × 3 мм × 1 мм для последующего использования.
    2. Проведите тупую диссекция поднижней челюсти, грудиноподъязычной мышцы и грудно-ключно-соместовидной мышцы. Обнажить обе CCA.
    3. Освободите CCA, чтобы разоблачить ICA и ECA.
    4. Прикрепите сосудистый зажим 1 к дистальному концу ККА и сосудистый зажим 2 на проксимальный конец.
    5. Проколите CCA между двумя зажимами иглой на 23 G.
  5. Нанесение жировой подушки
    1. После удаления иглы обмотайте CCA в месте прокола поверхностью среза (не серозной стороной) жировой подушечки.
    2. Наложите шов размером 4-0 под область, обёрнутую жиром; затем аккуратно привязывайте один бросок к жировой поверхности, чтобы приложить давление для надёжного контакта между жировой подушечкой и стенкой сосуда; Наконец, постепенно корректируйте лигатуру, чтобы достичь баланса давления для гемостаза.
    3. Поднимите дистальный КЦА влажной ватной палочкой. Освободите сосудистый зажим 1 и медленно уберите мазок, чтобы обеспечить постепенный кровоток к месту прокола.
    4. Проверьте кровоток; если наблюдается активное кровотечение, ре-защипте дистальный КЦА сосудистым зажимом 1.
    5. Подождите 1 минуту, затем медленно отпустите сосудистый зажим 1; Если происходит кровотечение, переместите жировую подушечку или немного затяните единичный ход лигатуры для увеличения давления; Продолжайте эти корректировки до достижения полного гемостаза.
    6. Поднимите проксимальный ККА влажной ватной палочкой. Освободить сосудистый зажим 2 и постепенно убрать мазок, чтобы обеспечить контролируемый кровоток к месту укола.
    7. Если происходит кровотечение, реклампируйте дистальный CCA сосудистым зажимом 2.
    8. Слегка затянуть единый ход шва для увеличения давления; подождите 1 минуту, затем поднимите проксимальный КЦА и освободите сосудистый зажим 2; медленно катил влажную ватную палочку к месту прокола.
    9. Если кровотечение продолжается, повторяйте два предыдущих шага, пока не достигнете полного гемостаза.
    10. Наместите дополнительный удар вместе с швом, чтобы сформировать двойной узел поверх первоначального, тем самым лучше закрепляя жировую подушечку на стенке сосудов и достигая гемостаза за сбалансированное внутрисосудистое и внешнее давление.
    11. Подтвердить, что общие сонные артерии с обеих сторон жировой подушки были заполнены и демонстрируют стабильный диаметр сосудов; Считайте это успешным восстановлением кровотока и гемостаза.
    12. Повторите ту же процедуру для проведения пункционного гемостаза на противоположной общей сонной артерии.
    13. Обнажать двусторонние общие сонные артерии у фиктивных мышей без проведения артериальных пункций или обмотки жировой подушечки, при этом сохраняя все остальные процедуры, идентичные оперированной группе.
    14. Наложите шов на цервикальный хирургический разрез и нанесите антисептик.
  6. Проведение послеоперационной оценки кровотока в мозге
    1. После завершения двустороннего пункционного гемостаза CCA у мышей настройте систему LSCI, чтобы сканировать открытую теменную кость и получить изображения в 10 раз увеличенные; Затем записывайте изменения кровотока в мозге.
    2. Зашвите разрез на коже головы и примените антисептик, дайте мышам восстановиться на грелке при температуре 37 °C, прежде чем вернуть их в клетку для дальнейшего ухода.
  7. Проведение послеоперационного мониторинга и сбора тканей
    1. Ежедневно отслеживайте и фиксируйте состояние выживаемости, моторную активность и любые признаки кровотечения в цервикомандибулярной области мышей в послеоперационный период.
    2. В послеоперационные дни 7, 14 и 28 проведите эвтаназия мышей углекислым газом (согласно утверждённым протоколам) и закрепите ткани мозга в 4% параформальдегида.

2. Патологическое обследование

  1. После 24-часовой фиксации обезвоживайте ткани мозга с помощью градиента этанола, прочистите ксилолом и внедрите в парафин для секционирования.
  2. Проведите H&E окрашивание срезов гиппокампа и изучите морфологию тканей мозга под микроскопом.
  3. Проведите окрашивание Nissl на срезах гиппокампа и изучите архитектуру нейронов под микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ данных лазерного контрастного лазера до и после операции и относительных измерений перфузии как в фальшивой, так и в оперированной группах не выявил значимых изменений, что показало, что этот метод артериального гемостаза успешно герметизировал общее место пункции сонной артерии без нарушения кровотока в мозге (см. рисунок 1).

Мыши из оперированной группы подвергались непрерывному мониторингу в течение 28 дней после операци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В моделях MCAO сохранение ЭКА лучше отражает клиническую патологию, предотвращая ишемические повреждения лица, связанные с пересечением и пересечением ЭКА. Хотя традиционный подход к введению филамента с помощью пункции CCA предлагает техническую простоту, он требует двусторонней перевязки места прокола, что приводит к перфузии мозга, зависящей от коллатерального кровообращения круга Уиллиса — неоптимального представления истинной патофизиологии инсульта. Техника гемостаза жиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Эта работа была поддержана научно-исследовательским проектом Генерального таможенного управления (грант No 2005HK006) под названием «Исследования, разработки и применение технологии мультиплексного обнаружения патогенов для инфекционных заболеваний, передающихся через переносчики в приграничных районах Северного Китая». Эта работа также поддерживалась Национальной ключевой программой НИОКР Китая (грант No 2022YFC2302700) и Международной программой сотрудничества в области науки и технологий Министерства науки и технологий (грант No KY201901014). Успешная разработка этого метода артериального гемостаза заслуживает глубокой благодарности профессору Перри (главному редактору The Perry Manual of Mouse Experiments) за его экспертное руководство и компании RWD Life Science Co., Ltd. (Шэньчжэнь) за предоставление лазерной системы контрастной визуализации с точками. Искренняя благодарность была выразена профессору Хань Сяоху, нашему наставнику, и компании Shenyang Biohao Biotech Co., Ltd. за их неоценимую поддержку. Искренняя благодарность также выражается всем участникам, которые сделали это исследование возможным.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-0 с иглой для шитья ниткамиШанхайская Пудун Цзиньхуань Медикал Снабз Ко., Лтд
Balb/C мышьBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd6-8 недель, мужчина
Нагревательная и сушильная печь серии DHGShanghai Yiheng Technology Co., LtdDHG-9123A
Гематоксилин и эозин (H& E) Набор для окрашивания высокого разрешенияServicebioG1076-500ML
ИзофлуранШэньчжэнь Руйводе Лайф Технотехническая Компания, ОООR510-22
Лазерный спекл-анализаторШэньчжэнь Руйводе Лайф Технотехническая Компания, ОООRFLSI ZW
Раствор красителя NisslServicebioG1036-100ML
Организационная машина вложенияLeicaHistoCore Arcadia H
Система сканирования слайдовШэньчжэнь Шэнцянь Технолоджи Ко., ЛтдSQS-40R
Аппарат для анестезии мелких животныхШэньчжэнь Руйводе Лайф Технотехническая Компания, ОООR500
Сушитель тканейLeicaЖемчужина HistoCore
Система ультрачистой водыТермо50132370
Ультратонкий полуавтоматический микротомLeicaHistoCore MULTICUT

Ссылки

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  2. Yang, X. Y., Wang, K. K., Liu, D. N. Relationship between cerebral ischemia-reperfusion injury and mitochondrial autophagy in mice. Chin J Comp Med. 33 (2), 48-55 (2023).
  3. Wang, Y., Wang, T., Zhao, L., Li, L. The effect of local cerebral ischemia-reperfusion injury on TMEM166 gene and neuronal autophagy in mice. Chin J Comp Med. 28 (7), 28-32 (2018).
  4. Xue, J., Sun, F., Liu, T. The effect of mononucleoside on Wnt7a and APC expression in focal cerebral ischemia-reperfusion rats. Chin J Comp Med. 9, 9-13 (2014).
  5. Hu, Z., Zhao, J., Song, W., et al. Protective effect of ginkgo biloba extract on the brain in a cerebral ischemia-reperfusion injury rat model. Chin J Comp Med. 32 (9), 55-61 (2022).
  6. Chen, Z., et al. Cardiac damage after permanent focal cerebral ischemia in mice. CNS Neurosci Ther. 20 (11), 989-997 (2014).
  7. Wang, C., Ma, X. Experimental study on establishing atherosclerotic animal models using high-fat diet combined with arterial intimal mechanical injury. J Pract Tradit Chin Intern Med. 26 (6), 31-33 (2012).
  8. Zhang, C., Li, L., Qi, W., Zhao, Y., Zhang, H. Intervention effect of puerarin on restenosis after carotid artery balloon injury in rats based on Wnt signaling pathway analysis. J Integr Tradit Chin West Med Cardiovasc Cerebrovasc Dis. 21 (4), 662-665 (2023).
  9. Cai, B., Xie, M. Effect of Xiaoyu Tablet on the stability of atherosclerotic plaque in rabbit abdominal aorta. J Chin Med Pharm. 5, 855-857 (2006).
  10. Liu, Z. Study on the mechanism of detoxification and blood circulation formula promoting vascular re-endothelialization after balloon injury of rat thoracic aorta. , Jiangxi Univ Tradit Chin Med. (2023).
  11. Chen, H., et al. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated spinal cord ischemia-reperfusion injury and its protective mechanism. Folia Neuropathol. 60 (3), 308-315 (2022).
  12. Comba, F. G., Smith, J. A., Jones, R. B. The mechanical properties of human adipose tissues and their relationships to the structure and composition of the extracellular matrix. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (5), C1226-C1240 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи