Методическая статья

Анализ токсичности для развития, основанный на мониторинге в режиме реального времени нарушения сигнала фактора роста фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека

956 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68910

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Engineering, Yokohama National University, 2Division of Cellular & Molecular Toxicology, Center for Biological Safety & Research, National Institute of Health Sciences, 3Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 4Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology (KISTEC)

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы представляем анализ клеток in vitro для идентификации тератогенных химических веществ. Динамику передачи сигналов фактора роста фибробластов (FGF)/сывороточного фактора ответа (SRF) измеряли в индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) репортерных клетках человека, а риск тератогенности оценивали путем количественной оценки химического разрушения этого сигнального пути.

Аннотация

Токсичность для развития (Devtox) обычно оценивается на животных моделях. Тем не менее, существуют проблемы с обеспечением точности, такие как ложноотрицательные результаты из-за межвидовых различий и этических проблем с благополучием животных. Таким образом, существует потребность в новых тестовых системах для оценки человеческого Devtox и помощи в решении этих проблем. Мы предположили, что тератогены нарушают связанные с Devtox сигнальные пути, необходимые для морфогенеза, независимо от их молекулярных мишеней. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разработали репортерную систему фактора роста фибробластов (FGF) с использованием человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS). Эта система позволяет количественно оценить нарушения сигнала, вызванные химическими веществами, достигая уровня точности 83% для известных тератогенных и нетератогенных соединений. Поскольку сигнальная активность Devtox меняется со временем, важно фиксировать ее динамику непрерывно, а не измерять в одной конечной точке. Использование системы измерения люминесценции в режиме реального времени не является обязательным, но она повышает временное разрешение при меньших трудозатратах. Весь тест может быть завершен в течение 1 недели, от засеивания клеток в культуральную пластину до получения данных люминесценции.

Введение

Некоторые химические вещества вызывают токсичность для развития (Devtox), включая задержку роста, пороки развития, функциональный дефицит и смерть1. Оценка Devtox имеет важное значение для обеспечения безопасности фармацевтических препаратов и пестицидов2. Современные анализы Devtox обычно основаны на нескольких животных моделях. Однако из-за межвидовых различий животные модели имеют присущие им ограничения при экстраполяции результатов на людей3. Талидомид, хорошо известный токсикант для развития, был впервые назначен беременным женщинам в конце 1950-х годов для облегчения утренней тошноты. Хотя тератогенность у грызунов не наблюдалась, во всем мире сообщалось о серьезных пороках развития конечностей у новорожденных людей. Эта трагедия высветила ограничения испытаний на безопасность на животных и побудила международные усилия по внедрению и пересмотру руководящих принципов тестирования Devtox4. Кроме того, существуют опасения, связанные с благополучием животных, а также со значительными затратами времени и средств на испытания на животных. Поэтому необходимы альтернативные анализы in vitro, которые могут точно предсказать Devtox человека5.

В данной работе мы предлагаем анализ in vitro для оценки токсикантов развития на основе нарушения сигнальных путей, которые имеют решающее значение для эмбрионального развития 6,7,8. Анализ проводится с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSCs), генетически модифицированных для экспрессии люциферазы NanoLuc (Nluc), люминесцентного репортерного гена, под контролем элемента сывороточного ответа (SRE). SRE является сайтом связывания сывороточного фактора ответа (SRF), транскрипционного фактора в сигнальном пути фактора роста фибробластов (FGF). SRF интегрирует сигналы от нескольких лигандов и регулирует экспрессию более 200 генов, которые играют важную роль в различных биологических процессах, включая эмбриональное развитие9.

В этом анализе репортерные клетки подвергались воздействию исследуемого химического вещества и стимулировались FGF для активации передачи сигналов и усиления любого интерференционного воздействия химического вещества. Ключевой особенностью этого анализа является захват динамики сигнальной активности при изменении интенсивности люминесценции. Поскольку сигнальная активность изменяется со временем, конечные измерения в одной временной точке могут быть неточными10. Действительно, измерения в семи временных точках за 24-часовой период продемонстрировали повышенную точность прогнозирования, при этом площадь под кривой (AUC) составила 0,837.

Исследуемые химические вещества можно применять в широком диапазоне концентраций, от 0,01 нг/мл до 1000 г/мл, в зависимости от цитотоксичности и растворимости. Приблизительно 1,4 × 104 клеток требуется для засеивания одного 96-луночного планшета. Ограничением этого анализа является то, что тератогенные химические вещества могут быть необнаруживаемы, если они действуют через мишени, не экспрессируемые в недифференцированных iPS-клетках человека. Кроме того, этот анализ может не захватывать тератогенные метаболиты. Кроме того, в нем не содержится подробной информации о механизмах, лежащих в основе тератогенной токсичности, или о ее конкретных последствиях.

Использование системы мониторинга люминесценции в режиме реального времени еще больше повышает временное разрешение, снижает трудозатраты, необходимые для непрерывных измерений, и сводит к минимуму артефакты от повторного обращения с культуральными планшетами. Здесь мы представляем подробный протокол анализа Devtox на основе нарушения сигнала. Вся процедура может быть завершена в течение одной недели. Этот подход может быть автоматизирован, что делает его пригодным для химического скрининга и способствует сокращению количества испытаний на животных.

Протокол

В этом исследовании были использованы человеческие iPS-клетки (201B7), при этом ген Nluc под контролем элемента сывороточного ответа (SRE) был введен в локус Adeno-Associated Virus Integration Site 1 (AAVS1) с помощью системы CRISPR-Cas9 (рис. 1A). Подробности редактирования генов репортерных клеток (SRE-Nluc-knocked-in человеческих iPS-клеток) были опубликованы в других работах6. Протокол в основном разделен на три этапа: 1) анализ цитотоксичности химического вещества для определения его максимальной концентрации воздействия, 2) тестирование на нарушение сигнала и 3) анализ данных.

Чтобы свести к минимуму влияние испарения среды, проводите все эксперименты с клеточными культурами с использованием центральных 60 лунок 96-луночного планшета и добавляйте воду в крайние лунки и межскважинные пространства. Во время инкубации накройте пластину газопроницаемой герметизирующей пленкой, чтобы еще больше уменьшить испарение.

1. Подготовка клеток

  1. Культивируйте репортерные клетки в течение не менее 2 недель после размораживания замороженного поголовья. Поддерживайте клетки по 7-дневному графику повторения и используйте клетки 7-го дня для анализа. Оптимизируйте плотность посева до ~80% слияния в день прохода.
  2. Затравите одиночные клетки в дозе 2,0 ×10 5 клеток/лунку в шестилуночный планшет с покрытием ECM с 2 мл свежей поддерживающей среды с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK.
  3. Через 24 ч замените среду на 2 мл свежей среды для поддержания.
  4. Через 72 ч соберите клетки с помощью диссоциативного реагента на основе фермента для получения суспензии одиночных клеток. Затравливают по 1,0 ×10 5 клеток/лунку в шестилуночный планшет с покрытием ECM с 2 мл свежей поддерживающей среды с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK.
  5. Через 24 ч замените среду на 4 мл свежей поддерживающей среды.
  6. Через 96 ч соберите клетки в виде одиночной клеточной суспензии с помощью диссоциационного реагента на основе ферментов. Используйте эти ячейки для репортерного анализа.

2. Анализ цитотоксичности

  1. Предварительные испытания
    1. Затравите одиночные клетки в дозе 2,0 ×10 4 клеток/лунку в 96-луночный планшет с покрытием ECM с 200 мкл свежей поддерживающей среды с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK. Заклейте пластину газопроницаемой пленкой.
    2. Через 24 часа замените среду на 200 μл/лунку свежей технической среды и снова запечатайте пластину газопроницаемой пленкой.
    3. Через 72 часа замените среду на 100 μл/лунку пробирной среды и снова запечатайте пластину газопроницаемой пленкой.
    4. Через 96 ч замените среду на 100 μл/лунку пробирной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если 100% слияние не достигнуто, прекратите анализ. Поскольку скорость роста может варьироваться в зависимости от клеточной линии, оптимизируйте плотность посева, чтобы обеспечить полное слияние в день анализа.
    5. Растворить исследуемое вещество в исследуемой среде до максимальной растворимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании диметилсульфоксида (ДМСО) в качестве растворителя конечная концентрация ДМСО не должна превышать 0,1%.
    6. Приготовьте пятиточечное, пятикратное последовательное разведение исследуемого химического вещества в исследуемой среде с использованием раствора, указанного на Шаге 2.1.5.
    7. Добавьте 11 μл/лунку химических растворов из Шага 2.1.6. Для контроля транспортного средства добавьте 11 μл/лунку пробирной среды, содержащей ту же концентрацию ДМСО.
    8. Через 48 часов инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение 30 минут.
    9. Добавьте 111 μл/лунку предварительно уравновешенного реагента для анализа жизнеспособности люминесцентных клеток на основе АТФ при 25 °C. Для заготовки подготовьте лунку, содержащую 111 мкл пробирной среды и 111 мкл реагента.
    10. Встряхивайте пластину со скоростью 300 об/мин в течение 2 минут с помощью шейкера с микропластинами.
    11. Перенесите 200 μL смеси на черную пластину для измерения люминесценции. Инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение 10 минут.
    12. Измерьте интенсивность люминесценции, чтобы оценить количество клеток.
    13. Рассчитайте жизнеспособность клеток по следующей формуле:
      Жизнеспособность клеток (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите последующие шаги на основе жизнеспособности клеток. Если жизнеспособность составляет >50% при всех испытанных концентрациях, переходите к этапу 2.2 с максимальной концентрацией растворимости. Если жизнеспособность превышает 50% в пределах испытуемого диапазона, приступают к испытанию с использованием максимальной концентрации с жизнеспособностью >50%. Если жизнеспособность составляет <50% при всех концентрациях, повторите предварительное испытание, начиная с более низкой концентрации.
  2. Тест на определение
    1. Затравите одиночные клетки в дозе 2,0 ×10 4 клеток/лунку в 96-луночный планшет с покрытием ECM с 200 мкл свежей поддерживающей среды с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK. Заклейте пластину газопроницаемой пленкой.
    2. Через 24 часа замените среду на 200 μл/лунку свежей технической среды и снова запечатайте пластину газопроницаемой пленкой.
    3. Через 72 часа замените среду на 100 μл/лунку пробирной среды и снова запечатайте пластину газопроницаемой пленкой.
    4. Через 96 ч замените среду на 100 μл/лунку пробирной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если 100% слияние не достигнуто, прекратите анализ. Оптимизируйте плотность посева для обеспечения полного слияния на 4-й день.
    5. Растворить испытуемое вещество в исследуемой среде в соответствии с результатами предварительного испытания (Шаг 2.1).
    6. Приготовьте девятитое, двукратное последовательное разведение исследуемого химического вещества в исследуемой среде с использованием раствора, указанного на Шаге 2.2.5.
    7. Добавьте 11 μл/лунку химических растворов из Шага 2.2.6. Для контроля транспортного средства добавьте 11 μл/лунку пробирной среды, содержащей ту же концентрацию ДМСО.
    8. Через 48 часов инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение 30 минут.
    9. Добавьте 111 μл/лунку предварительно уравновешенного реагента для анализа жизнеспособности люминесцентных клеток на основе АТФ при 25 °C. Для заготовки подготовьте лунку, содержащую 111 мкл пробирной среды и 111 мкл реагента.
    10. Встряхивайте пластину со скоростью 300 об/мин в течение 2 минут с помощью шейкера с микропластинами.
    11. Перенесите 200 μL смеси на черную пластину для измерения люминесценции. Инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение 10 минут.
    12. Измерьте интенсивность люминесценции, чтобы оценить количество клеток.
    13. Рассчитайте жизнеспособность клеток по следующей формуле:
      Жизнеспособность клеток (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
    14. Постройте кривую "доза-реакция", используя данные девяти концентраций, и рассчитайте IC50 по кривой.

3. Репортерный анализ в режиме реального времени (Рисунок 1B)

  1. Затравите одиночные клетки в дозе 2,0 × 104 клеток/лунку в 96-луночный планшет с покрытием ECM с 200 мкл свежей поддерживающей среды с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK. Заклейте пластину газопроницаемой пленкой.
  2. Через 24 часа замените среду на 200 μл/лунку свежей технической среды и снова запечатайте пластину газопроницаемой пленкой.
  3. Через 72 часа замените среду на 100 μл/лунку пробирной среды и снова запечатайте пластину газопроницаемой пленкой.
  4. Через 96 ч замените среду на 100 мкл/лунку пробирной среды, содержащей 1% люминесцентной подложки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если 100% слияние не достигнуто, прекратите анализ. Поскольку скорость роста может варьироваться в зависимости от клеточной линии, оптимизируйте плотность посева, чтобы обеспечить полное слияние на 4-й день.
  5. Исследуемое вещество растворить в анализируемой среде в концентрации, определенной в разделе 2.
  6. Приготовьте восьмиточечное, двукратное последовательное разведение исследуемого химического вещества в исследуемой среде, начиная с раствора, приготовленного на Шаге 3.5.
  7. Через два часа после замены среды на Шаге 3.4 добавьте 11 μл/лунку химических растворов из Шага 3.6. Для контроля транспортного средства добавьте 11 μл/лунку пробирной среды, содержащей ту же концентрацию ДМСО.
  8. Через час после начала химического воздействия (Шаг 3.7) добавьте 12 μл/лунку пробирной среды, содержащей bFGF, до конечной концентрации 2 нг/мл.
  9. Непрерывное измерение люминесценции в течение 48 часов с помощью системы измерения люминесценции в режиме реального времени при увлажнении атмосферы, 5%CO2 при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите время 0 в точке сложения FGF (см. Рисунок 1B).

4. Анализ данных (Рисунок 1В)

  1. Рассчитайте log2-кратное изменение (LogFC) интенсивности люминесценции, нормализовав тестовую группу по системе управления транспортным средством:
    LogFC = log2(Luc_sample / Luc_vehicle)
  2. Интегрируйте LogFC в 48-часовом временном ряду, чтобы оценить площадь между кривыми (ABC) для тестовой группы и контрольной группы автомобиля.
  3. Сумма значений ABC для всех концентраций для количественной оценки общей степени нарушения сигнала, вызванного исследуемым химическим веществом.
  4. Выполнение анализа кривой рабочих характеристик приемника (ROC) для определения порогового значения для классификации Devtox.

Результаты

По нашему опыту, морфология клеток полезна для определения правильности проведения анализа. На рисунке 2А показаны типичные конфокальные микроскопические изображения клеток непосредственно до и после химического воздействия. В конце анализа почти вся поверхность лунок покрывается ячейками. На рисунке 2B показаны изображения окрашивания живых/мертвых клеток. Количество мертвых клеток, окрашенных йодидом пропидия (ПИ), увеличивается после химического воздействия; однако жизнеспособность клеток составляет не менее 50%, и почти все клетки окрашиваются кальцеином-АМ.

В таблице 1 перечислены испытуемые химические вещества, использованные в наших предыдущих исследованиях 7,8. Эти исследования показывают, что химические вещества Devtox могут быть различимы с повышенной точностью на основе нарушения сигнала FGF в iPS-клетках человека. Ключевой вывод заключается в том, что непрерывный мониторинг сигнальной активности имеет решающее значение, поскольку она динамически меняется с течением времени. Использование системы измерения люминесценции в реальном времени обеспечивает значительно более высокое временное разрешение при меньших затратах на измерение. Здесь мы опишем протокол, который использует систему мониторинга в режиме реального времени.

На рисунке 3А показаны изменения интенсивности люминесценции в течение 48 часов в шести повторяющихся лунках в тех же условиях без испытуемого химиката. Шесть кривых почти выровнены, что указывает на хорошую воспроизводимость от скважины к скважине. Несмотря на то, что в наших предыдущих исследованиях 24-часовые ручные измерения не были четко идентифицированы, два отчетливых пика - начальный пик сразу после добавления лиганда FGF и второй пик примерно через 24 часа - появляются при 48-часовых измерениях в реальном времени. На рисунке 3B показаны изменения интенсивности люминесценции при воздействии вальпроевой кислоты (ДПА), хорошо известного токсиканта для развития. VPA является ингибитором гистондеацетилазы, который вызывает дефекты нервной трубки, сердца и конечностей¹¹. VPA нарушает передачу сигналов FGF в зависимости от концентрации. Автоматизированная измерительная система в режиме реального времени фиксирует динамику сигнала более точно, чем ручные измерения.

figure-results-1
Рисунок 1: Анализ нарушения сигнала FGF/SRF. (A) Генная инженерия iPS-клеток человека для получения сигнальных репортерных клеток FGF/SRF. Плазмида была сконструирована, содержащая Nluc после элемента сывороточного ответа, гомологичные плечи для целевого вбивания и ген резистентности к пуромицину под контролем промотора фосфоглицераткиназы человека. После отбора пуромицина были установлены репортерные клетки SRE-Nluc. (B) График проведения анализа. Репортерные ячейки были засеяны в 96-луночный планшет и выращивались в течение 4 дней, чтобы покрыть всю поверхность. Люминесцентную подложку и испытуемое химическое вещество добавляли за 3 и 1 ч до начала измерения соответственно. Время добавления лиганда FGF было установлено равным 0 ч, а интенсивность люминесценции непрерывно измерялась в течение следующих 48 ч. (C) Анализ данных. Динамика сигнала регистрировалась в ячейках, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию испытательных химических веществ, и нормализовалась для управления транспортным средством для оценки площади между кривыми как степени нарушения сигнала, вызванного химическим веществом. Значения АВК были получены для каждого химического вещества при различных концентрациях, и рассчитана их сумма. Анализ кривой рабочих характеристик ресивера был выполнен с использованием всех известных токсикантов, испытанных для определения порогового значения. Сокращения: iPS = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; RLU = относительная световая единица; AUC = площадь под кривой; FGF = фактор роста фибробластов; SRF = сывороточный фактор реакции; SRE = элемент сывороточного ответа; HA = гомологичная рука; L = левый; R = правый; PuroR = ген устойчивости к пуромицину; hPGK = фосфоглицераткиназа человека; Nluc = люцифераза NanoLuc; ROC = рабочая характеристика ресивера; ABC = площадь между кривыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Морфология клеток и окрашивание живых/мертвых клеток. (А) Конфокальные микроскопические изображения клеток до (день 4) и после (день 6) воздействия исследуемого химического вещества. Оставшиеся ячейки, покрывающие практически всю поверхность скважин после испытания, являются показателем успешного пробного запуска. Почти полное покрытие скважины в конце анализа свидетельствует об успешном прохождении. (B) Окрашивание живых/мертвых клеток до и после воздействия исследуемого химического вещества. Живые клетки окрашивали в зеленый цвет с помощью кальцеина-AM, а мертвые клетки окрашивали в красный цвет йодидом пропидия (PI). окрашивали кальцеином-AM (зеленым), а мертвые клетки – йодидом пропидиума (PI, красным). Доля мертвых клеток должна быть меньше должной < 50% от общего количества клеток. Масштабные линейки = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Типичные примеры динамики интенсивности люминесценции. (A) Временная люминесценция изменяет временной ход люминесценции после стимуляции лиганда FGF, измеренный с помощью системы измерения люминесценции в реальном времени. Интенсивность люминесценции контролировали каждые 22 мин в течение 48 ч. Шесть цветных линий представляют собой сигналы из разных скважин. (B) Сравнение ручных измерений люминесценции и измерений люминесценции в реальном времени с вальпроевой кислотой. Нарушение сигнала наблюдалось при использовании обоих методов измерения, в то время как мониторинг в режиме реального времени более четко фиксировал усиленный сигнал на втором пике. Сокращения: RLU = относительная световая единица; VPA = вальпроевая кислота; FGF = фактор роста фибробластов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Тестовая химияСокращениеCas NO.Исследование на животных
(предыдущее исследование)		Исследование in vitro
(данное исследование)		Сумма значений ABCМаксимальная концентрация
(мкг/мл)
полностью транс-ретиноевая кислотаАТРА302-79-4PP65.90.0100
ГидроксимочевинаХУ127-07-1PP63.3149
Метоксиуксусная кислотаМАА625-45-6PP225683
Метилртути хлоридМеРт115-09-3PP77.71.20
Метотрексат гидратMTX133073-73-1PP80.55.00
Салицилат натрияЮАР54-21-7PP38.7666
Вальпроевая кислотаВПА99-66-1PP63.3100
6-Аминоникотинамид6-АН329-89-5PN24.91.00
Борная кислотаБА10043-35-3PN24.2250
5-Бромо-2'-дезоксиуридинБрдУ59-14-3PP83.950.0
5,5-диметил-2,4-оксазолидиндионДМО695-53-4PP50.3840
Хлорид литияLiCl7447-41-8PN29.8250
5-Фторурацил5-ФУ51-21-8PP92.42.65
Моногидрат циклофосфамидаCPA6055-19-2PN19.1400
Иматиниб мезилатIMA220127-57-1PP42.412.5
ЛеналидомидЛЕН191732-72-6PP94.735.0
ПомалидомидПОМ19171-19-8PP50.92.50
ТалидомидТХА50-35-1PP53.312.0
АкриламидAcA79-06-01NN37.1454
D-камфораЭКСЦЕНТРИК464-49-3NN27.550.0
Дифенгидрама гидрохлоридДГМ147-24-0NP68.2262
ДиметилпталатДМП131-11-3NN24.4100
Пенициллин Г натриевая сольПэн69-57-8NN22.11000
Сахарин натрияМЕШОЧЕК82385-42-0NN34.01000
АцетаминофенАПАП103-90-2NN22.320.0
Амоксициллина тригидратАМХ61336-70-7NN28.425.0
ЦиметидинСМ51481-61-9NN25.330.0
ЭритромицинЭРИ114-07-8NN20.015.0
ГидрохлоротиазидХХТЗ58-93-5NN21.920.0
СульфасалазинССЗ599-79-1NN30.8100
ХимическийАУКПорогЧувствительностьСпецифичностьТочность
30 веществ0.81937.90.7780.9170.833

Таблица 1: Химические вещества Devtox и другие вещества, классифицированные в экспериментах на животных, и результаты, оцененные с нарушением сигнала FGF и без него. Сокращения: P = положительный (Devtox); N = отрицательный (не Devtox).

Обсуждение

Эмбрионально-фетальное развитие жестко регулируется сигнальными сетями12. В то время как обратная связь внутри этих сетей обеспечивает устойчивость к внутреннему и внешнему шуму, мы предположили, что химические вещества Devtox могут оказывать эффекты, выходящие за рамки такой буферизации. Здесь мы представляем протокол оценки химических веществ Devtox на основе чрезмерного нарушения передачи сигналов FGF/SRF. Этот подход не предоставляет никакой информации о молекулярных механизмах, ответственных за Devtox, таких как целевые белки химического вещества, и фокусируется только на передаче сигналов FGF/SRF. Тем не менее, удалось эффективно классифицировать химикаты Devtox с точностью 83% и AUC 0,819 (Таблица 1). Вероятно, это связано с тем, что каждый сигнальный путь тесно связан с другими и образует плотные сигнальные сети, и нарушение в этих сетях приводит к нарушению сигнала FGF/SRF.

При создании репортерных ячеек необходимо решить ряд технических проблем. Nluc примерно в 100 раз ярче, чем обычные люциферазы, полученные из светлячков или Renilla, что позволяет осуществлять непрерывный долгосрочныймониторинг изменений сигнала. Nluc, содержащий последовательность PEST, был использован для более точного захвата динамики сигнальной активности. Последовательность PEST способствует деградации белка. В то время как белок Nluc стабилен с периодом полураспада более 6 часов, метка PEST ускоряет деградацию через убиквитин-протеасомный путь, сокращая его период полувыведения до 10-30 минут. Кроме того, репортерный ген был вброшен в локус AAVS1, геномную «безопасную гавань», гарантируя, что экспрессия не подавляется и что основные гены не нарушаются случайно.

При оценке методов тестирования крайне важно выбрать референтные химические вещества для Devtox и других химических веществ. Мы выбрали референтные химические вещества из списков в международном валидационном исследовании ECVAM, руководствах ICH S5 (включая талидомид) и исследованиях на животных7. Мы перечислили 30 химических веществ, не относящихся к Devtox, но необходимо добавить и протестировать больше химических веществ из надежных источников. Таким образом, пороговое значение ROC (сумма ABC = 37,9), указанное здесь, следует считать предварительным и потребует проверки с помощью более крупного независимого набора соединений для обеспечения статистической надежности. Циклофосфамид (CPA) был одним из трех химических веществ с ложноотрицательными результатами. ХПА гидроксилируется в печени до 4-гидропероксициклофосфамида, а ХПА и продукты его распада являютсятератогенными15. Анализы in vitro, включая наш подход, обычно не учитывают метаболизм и не могут обнаружить химические вещества, которые индуцируют Devtox посредством метаболизма. В этом заключается ограничение предлагаемого подхода. В дополнение к ложноотрицательным результатам, зависящим от метаболизма (например, CPA), мы также наблюдали ложноположительный результат при приеме дифенгидрамина гидрохлорида (ДГМ). Эпидемиологические данные не подтверждают причинно-следственную связь между ДГМ и врожденными пороками развития, однако несколько исследований in vitro классифицировали его как токсикант для развития; Это, вероятно, способствовало его неправильной классификации в нашем анализе. И наоборот, 6-аминоникотинамид (6-AN) не нарушал передачу сигналов FGF/SRF и поэтому был неправильно классифицирован, что позволяет предположить, что его механизм токсичности для развития может протекать по путям, не зафиксированным данным автором. В совокупности эти примеры поддерживают расширение панели анализа за счет включения дополнительных сигнальных путей развития для снижения как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.

Большое влияние на этот анализ оказывают несколько факторов. Одним из таких факторов является подготовка клеток перед анализом. Чтобы свести это к минимуму, клетки поддерживали по 7-дневному графику повторения, чтобы гарантировать, что клетки, используемые в анализе, были собраны в тех же условиях роста. Клетки засеваются в понедельник, проходят в четверг, а часть используется для анализа и засевается для следующего пассажа. Еще одним фактором является плотность клеток в момент воздействия исследуемого химического вещества. Анализ проводился только тогда, когда клетки достигали 100% слияния в день химического воздействия. Краевые эффекты в 96-луночных планшетах хорошо известны. В этом анализе использовались только внутренние 60 лунок 96-луночного планшета, чтобы избежать краевых эффектов. В дополнение к общим соображениям, во время анализа может наблюдаться техническая изменчивость. Распространенной проблемой была непостоянная интенсивность люминесценции среди лунок в контрольной группе носителя, что могло быть результатом неравномерного посева клеток или неоптимального качества клеток. Мы рекомендуем поддерживать конфлюенцию ячеек на уровне около 80%, чтобы свести к минимуму эту изменчивость, и проверять равномерный рост в лунках на следующий день после посева. Регулировка плотности посева iPSC также может повысить воспроизводимость анализов. Кроме того, чрезмерная гибель клеток может привести к неспецифическим флуктуациям люминесценции, не связанным с экспериментальным сигналом. Поэтому оцените морфологию клеток в конце анализа, чтобы убедиться, что клетки находятся в надлежащем состоянии во время измерения. При ручном анализе извлечение планшета из инкубатора в каждый момент времени подвергает клетки кратковременным изменениям температуры и уровняCO2. Чтобы ограничить эти колебания окружающей среды, измерения должны выполняться быстро и последовательно.

Этот анализ может быть выполнен вручную или с помощью измерительной системы в режиме реального времени. Ручной подход не требует специализированного оборудования, но система измерений в режиме реального времени позволяет более точно определять динамику сигнала. Несмотря на то, что данные ручных измерений не были идентифицированы, система измерений в реальном времени четко зафиксировала два пика сигнала люминесценции. При ручных измерениях 12-часовой разрыв в сборе данных произошел в ночное время, что могло привести к недооценке или потере второго пика. Эти два пика могут быть вызваны отрицательной обратной связью от передачи сигналов FGF и наличием термически стабильного лиганда FGF. Примечательно, что нарушение сигнала FGF химическим веществом иногда оказывалось сильнее на втором пике, чем на первом (рис. 3B).

Этот протокол представляет собой многообещающий подход к химическому скринингу Devtox с использованием репортерного анализа человека на основе iPSC для количественной оценки нарушения сигнала FGF. За последние несколько десятилетий было разработано несколько альтернативных тестов in vitro для определения токсичности для развития, в том числе тест эмбриональных стволовых клеток мыши (mEST)16, тест эмбриональных стволовых клеток на основе Hand1 (Hand1-EST)17 и ReProGlo18. По сравнению с этими традиционными анализами, этот метод продемонстрировал превосходную прогностическую точность. В последние годы в рамках международных усилий по созданию систем тестирования без участия животных были внедрены альтернативные стратегии, такие как использование человеческих эмбриональных стволовых клеток или эмбрионов рыбок данио. Эти подходы также показали высокую прогностическую точность для оценки токсичности для развития. Для дальнейшего улучшения результатов этого анализа может быть полезно включить дополнительные сигнальные пути, участвующие в эмбриональном развитии. Существует несколько других основных сигнальных путей в морфогенезе развития, таких как Wnt/β-катенин, BMP/SMAD и Hedgehog/GLI19. Различные комбинации репортерных клеток, используемые для оценки этих сигнальных путей, могут обеспечить более всестороннюю оценку различных химических веществ. Влияние стадии дифференцировки iPS-клеток, например, самой ранней стадии, когда формируются три зародышевых слоя, на чувствительность обнаружения этого анализа будет темой наших будущих исследований. В будущих исследованиях также может быть изучена межвидовая валидация с использованием систем стволовых клеток грызунов или кроликов, чтобы обеспечить прямое сравнение с наборами данных in vivo у этих видов, в то время как наше основное внимание по-прежнему сосредоточено на человеческих iPS-клетках для максимизации актуальности для человека.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана JSPS, Япония [гранты KAKENHI No 23K25021 и 25K03278]; MHLW, Япония [номера грантов по программам 23KD1003 и 24KD1003]; KISTEC, Япония; и AMED, Япония [номера грантов JP23mk0101252 и 25mk0121314].

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифугная трубка объёмом 1,5 млFastGeneFG-MCT015CТестовая химическая подготовка
Центрифугная трубка объёмом 15 млВИОЛАМО1-3500-21Клеточная культура
8-полосная ПЦР-трубкаУотсон137-333CТестовая химическая подготовка
96 скважина белая/прозрачная нижняя плита, поверхность TCТермо Фишер Сайентифик165306Культура клеток и измерения люминесценции
Black Microplate Flat Bottom 96WellАСОНЕ3-3321-04Для измерения люминесценции в анализах цитотоксичности
Дыши ЛЕГЧЕТОХОBERM-2000Газопропускная герметизационная плёнка
Анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-GloPromegaG7572Анализ на цитотоксичность
Центрифуга 5702 RЭппендорфЦентрифугирование
ClipTip 300, фильтрованный, стерильный, стойкаТермо Фишер Сайентифик94420513
ClipTip 50, фильтрованный, стерильный, стойкаТермо Фишер Сайентифик94420253
Countess 3 FL Автоматический счётчик ячеекИнвитрогенПодсчёт клеток
Слайды камеры для подсчёта ячеек графиниИнвитрогенC10312Подсчёт клеток
Культура, конечно, DMSO FUJIFILM Вако031-24051Растворитель для химических веществ
CultureSure Y-27632FUJIFILM Вако036-24023Ингибитор ROCK для посева iPSC
DMEM/F12 HEPES, без фенолового красногоТермо Фишер Сайентифик11039-021Покрытие для культуры клеток iPS
F1-ClipTip Многоканальные пипетты, 30–300 и микро; LТермо Фишер Сайентифик4661180N
F1-ClipTip Многоканальные пипеты, 5–50 и микро; LТермо Фишер Сайентифик4661160N
Фильтрующий чипУотсон
Матрица базальной мембраны Geltrex LDEV без LDEVТермо Фишер СайентификA1413202Покрытие для культуры клеток iPS
HIENAI Mat 01RCOSMO BIOHMAT01RДля поддержания стабильности температуры пластины при обработке клеточной культуры
HIENAI Tube Heater GX01COSMO BIOTWGX013Для поддержания среднего тепла во время экспериментального обращения
Человеческий термостабильный bFGF рекомбинантный белокТермо Фишер СайентификPHG0367Стимуляция FGF для репортерского анализа
Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPS)201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324)Банк RIKEN BRC Cell
Микропластиночный шейкерTAITEC0089532-000Встряхивание пластин для теста цитотоцитности
Многопластиночный считывательПеркинЭлмерARVO X4Измерение люминесценции
Субстрат живых клеток Nano-Glo эндуразинPromegaN2571Люминесцентная подложка
PBS (-) FUJIFILM Вако166-23555Клеточная куляра
ПарафилимAS One65-1681-93Хранится для покрытия
ПипеттоЭппендорф
WSL-1563 KronosHTATTO3510140Система измерения люминесценции в реальном времени 
РезервуарBMBioBM-0850-1
STEMdif APEL2 Medium Технологии STEMCELLST-05275Пробирная среда
Среда StemFlexТермо Фишер СайентификA3349401Среда обслуживания
Стерильная вода, без эндотоксиновFUJIFILM Вако196-15645Контроль влажности для культуры клеток iPS
Пластина для культивирования тканей VTC-P6ВИОЛАМО2-8588-01Клеточная культура
TrypL Select Enzyme (1 раз), без фенол-красногоТермо Фишер Сайентифик12563011Клеточная культура
Вальпроевая кислотаFUJIFILM Вако227-01071Тестовое химическое вещество

Ссылки

  1. Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
  2. DeSesso, J. M. Future of developmental toxicity testing. Curr Opin Toxicol. 3, 1-5 (2017).
  3. Teixidó, E., Krupp, E., Amberg, A., Czich, A., Scholz, S. Species-specific developmental toxicity in rats and rabbits: Generation of a reference compound list for development of alternative testing approaches. Reprod Toxicol. 76, 93-102 (2018).
  4. Vargesson, N. Thalidomide-induced teratogenesis: History and mechanisms. Birth Defects Res C Embryo Today. 105 (2), 140-156 (2015).
  5. van der Laan, J. W., Chapin, R. E., Haenen, B., Jacobs, A. C., Piersma, A. Testing strategies for embryo-fetal toxicity of human pharmaceuticals. Animal models vs. in vitro approaches: A workshop report. Regul Toxicol Pharmacol. 63 (1), 115-123 (2012).
  6. Kanno, S., et al. Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs. STAR Protoc. 3 (2), 101439(2022).
  7. Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., Fukuda, J. Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals. J Biosci Bioeng. 133 (3), 291-299 (2022).
  8. Kanno, S., et al. Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption. iScience. 25 (2), 103770(2022).
  9. Miano, J. M. Role of serum response factor in the pathogenesis of disease. Lab Invest. 90 (9), 1274-1284 (2010).
  10. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  11. Paradis, F. -H., Hales, B. F. Exposure to valproic acid inhibits chondrogenesis and osteogenesis in mid-organogenesis mouse limbs. Toxicol Sci. 131 (1), 234-241 (2013).
  12. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Curr Top Dev Biol. 149, 341-372 (2022).
  13. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  14. DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
  15. Hales, B. F. Comparison of the mutagenicity and teratogenicity of cyclophosphamide and its active metabolites, 4-hydroxycyclophosphamide, phosphoramide mustard, and acrolein. Cancer Res. 42 (8), 3016-3021 (1982).
  16. Genschow, E., et al. The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: Results of the definitive phase and evaluation of prediction models. Altern Lab Anim. 30 (2), 151-176 (2002).
  17. Suzuki, N., Ando, S., Yamashita, N., Horie, N., Saito, K. Evaluation of novel high-throughput embryonic stem cell tests with new molecular markers for screening embryotoxic chemicals in vitro. Toxicol Sci. 124 (2), 460-471 (2011).
  18. Uibel, F., et al. ReProGlo: A new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals. Reprod Toxicol. 30 (1), 103-112 (2010).
  19. Sanz-Ezquerro, J. J., Münsterberg, A. E., Stricker, S. Editorial: Signaling pathways in embryonic development. Front Cell Dev Biol. 5, 76(2017).

Перепечатки и разрешения

Теги

Измерение люминесценциианализ жизнеспособности клетоктестирование химической токсичностисерийное разведениефазово-контрастная микроскопия
Анализ токсичности для развития, основанный на мониторинге в режиме реального времени нарушения сигнала фактора роста фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.