Микрофлюидный чип для построения моделей аксональных травм и обеспечения мультиомиксного анализа

Краткое содержание

Этот протокол описывает микрофлюидную систему, моделирующую динамику метаболизма нейронов после аксонального повреждения, что позволяет визуализировать, мультиомиксный анализ и механистические исследования внутреннего метаболического ремоделирования.

Аннотация

Нейроны поляризуются, образуя дендриты и аксоны, обеспечивая межклеточную коммуникацию. Аксональное повреждение нарушает эти связи и передает сигналы о повреждении в сому, что часто приводит к дегенерации нейронов. Таким образом, поддержание гомеостаза аксонов имеет важное значение для содействия местной регенерации аксонов и защиты от нейродегенерации. Этот процесс опирается на клеточный метаболизм для обеспечения энергией и биосинтетическими предшественниками и поддерживается механизмами, которые регулируют метаболический баланс и выводят побочные продукты. Тем не менее, метаболизм нейронов разделен между сомой и аксоном и в дальнейшем подвержен влиянию окружающей микросреды in vivo , такой как метаболическая активность, полученная от астроцитов (например, челнок лактата астроцитарного нейрона). Эти факторы усложняют исследование внутренних метаболических механизмов нейронов. Чтобы решить эти проблемы, мы разработали микрофлюидную платформу для культивирования первичных корковых нейронов in vitro , которая сохраняет ключевые метаболические характеристики, наблюдаемые in vivo, включая физиологический гликолитический поток и митохондриальное дыхание. Эта система обеспечивает упрощенную модель для исследования внутреннего метаболического ремоделирования в нейронах после аксонального повреждения. Обычные микрофлюидные чипы поддерживают модели аксонального повреждения in vitro и совместимы с визуализацией живых клеток, иммунофлуоресцентным окрашиванием и лечением гипоксии. Для проведения крупномасштабных транскриптомных и метаболомных анализов с участием миллионов клеток мы разработали и изготовили высокопроизводительные микрофлюидные чипы с оптимизированными операционными протоколами. Аппарат отличается поочередно расположенными камерами сомы и аксонов, соединенными микроканалами, а травмирование аксонов индуцируется за счет вакуумной аспирации жидкости из аксонного отсека. Эта платформа позволяет быстро оценивать динамику метаболитов и ферментов, повышая точность и воспроизводимость мультиомиксных исследований.

Введение

Нейроны образуют два различных типа выступов со специализированными функциями, аксоны и дендриты, посредством поляризации в процессе развития ^1,2. Регенерация нервов относится к процессу восстановления аксонов после повреждения нервной системы³, с исследовательским акцентом на восстановление центральной нервной системы (ЦНС). В отличие от периферической нервной системы, ЦНС имеет ограниченную регенеративную способность ^4,5,6, что часто приводит к стойким функциональным нарушениям или постоянной инвалидности у пациентов с травмами спинного мозга или черепно-мозговыми травмами ^7,8. Таким образом, разработка стратегий для улучшения восстановления ЦНС и выяснение механизмов, лежащих в основе регенерации аксонов, имеют решающее значение.

Микрофлюидные устройства, функционирующие как интегрированные, экономически эффективные и высокопроизводительные системы культивирования in vitro, продемонстрировали замечательные преимущества в исследованиях клеток и нейронов в последние годы ^9,10. По сравнению с традиционными методами, микрофлюидная технология позволяет точно регулировать напряжение сдвига жидкости, градиенты концентрации и пространственные структуры, тем самым точно моделируя аутентичные физиологические и патологические микросреды, способствуя росту, миграции, дифференцировке и взаимодействию клеток 11,12,13,14. Основанные на микрофлюидике модели повреждения аксонов in vitro позволяют проводить компартментализацию тел и процессов нейронных клеток за счет пространственной поляризации, обеспечивая незаменимый инструмент для изучения внутренней регенеративной способности нейронов и их метаболической адаптации после травмы^15,1, ^6,17,18. Это дает критически важное представление о том, как нейроны реагируют на травмы, регулируют метаболические^{процессы и} способствуют регенерации аксонов²⁰. Тем не менее, существующие микрофлюидные платформы для аксонального повреждения и метаболических исследований по-прежнему сталкиваются с проблемами, включая низкий выход нейрональных клеток, сниженную точность метаболических измерений и отсутствие стандартизированных операционных процедур.

В ответ на эти ограничения в данном исследовании была разработана новая крупномасштабная микрофлюидная платформа, которая обеспечивает стандартизированную высокопроизводительную индукцию аксонального повреждения и обеспечивает достаточный клеточный материал для компартментализированного мультиомического анализа. Эта интегрированная конструкция напрямую противостоит критической неудовлетворенной потребности в исследованиях нервных повреждений. В частности, разработанный нами микрофлюидный чип отличается чередующимся расположением сомальных и аксональных камер, соединенных микроканавками, с аксональной транссекцией, достигаемой за счет контролируемой вакуумной аспирации. Этот подход идеально подходит для исследований, требующих воспроизводимых, высокопроизводительных моделей аксональных повреждений и точного метаболического профилирования, таких как изучение метаболических механизмов, лежащих в основе регенерации аксонов. По сравнению с традиционными методами, этот метод обеспечивает более высокую пропускную способность, большую метаболическую точность и возможность создания стандартизированных моделей травм. Например, предыдущие исследования продемонстрировали важность митохондриального транспорта в регенерации аксонов 20,21,22,23, в то время как наша платформа далее раскрывает роль метаболизма глюкозы в регенерации аксонов после травмы. Этот протокол создает техническую систему для крупномасштабной аксотомии и метаболического анализа, которая является как визуально верифицируемой, так и функционально стандартизированной.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Этического комитета Бэйханского университета и были одобрены комитетом (код утверждения: BM20210060). На рисунке 1 показана временная шкала эксперимента.

1. Проектирование обычного и крупномасштабного микрофлюидного устройства

1. Проектируйте микрофлюидное устройство с помощью AutoCAD для создания двумерных (2D) схем и трехмерных (3D) структурных моделей.
2. Используйте эти конструкции для изготовления мастер-формы на кремниевой пластине с негативной фотолитографией SU-8.
3. Репликация мастер-формы путем литья полидиметилсилоксана (PDMS) в результате получения высокоточного функционального микрофлюидного чипа.
4. Спроектируйте каждый микроканал высотой 5 мкм, позволяя проходить только аксонам при блокировании сом.
5. Сделайте микроканалы шириной 10 мкм, чтобы увеличить аксональную емкость.
6. Спроектируйте камеры так, чтобы они были 120 мкм в высоту и 220 мкм в ширину, обеспечивая достаточное пространство для нейрональной сомы.
7. Используйте эту микрофлюидную платформу для моделирования аксонального повреждения in vivo , контролируя поток жидкости и размещение нейронов.
8. Подготавливайте метаболомные и транскриптомные образцы с помощью устройства для высокоточных манипуляций с клетками, а также обеспечьте высокопроизводительную обработку для повышения точности образцов и биологической валидности.

2. Изготовление обычных и крупномасштабных микрофлюидных устройств

1. Взвесьте основание PDMS и отвердитель в соотношении 10:1 (масса/масса) и поместите их в центрифужную пробирку.
2. Поместите центрифужную трубку, содержащую смесь PDMS, в центробежную мешалку. Центрифугируйте при 2000 × г в течение 4 минут для смешивания, затем снова центрифугируйте при 2000 × г в течение 4 минут для дегазации.
3. Залейте 13-15 г дегазированного PDMS в микрофлюидную форму, убедившись, что дно формы полностью покрыто.
4. Поместите форму в вакуумный эксикатор. Используйте вакуумный насос для откачки воздуха в течение 5-10 минут, чтобы тщательно удалить пузырьки из PDMS.
5. С помощью резиновой груши осторожно постукивайте по поверхности PDMS, чтобы разбить оставшиеся пузырьки на поверхности.
6. Поместите форму в конвекционную печь и выпекайте при температуре 80 °C в течение 100 минут, чтобы отверждение PDMS.
7. Как только PDMS полностью затвердеет, осторожно проведите кончиком скальпеля под край PDMS, чтобы осторожно поднять и отделить его от формы.
8. С помощью биопсийного перфоратора диаметром 2,0-2,5 мм создают отверстия в PDMS для инфузии питательной среды и загрузки клеток.
9. Удалите все поверхностные загрязнения с PDMS с помощью клейкой ленты, затем поместите ее в чистую стеклянную посуду и оберните алюминиевой фольгой для хранения.
10. (Дополнительный) Обработайте поверхность PDMS кислородной плазмой (30 Вт, 20 с), а затем прижмите ее к другой поверхности для необратимого сцепления.
11. Перед началом эксперимента микрофлюидное устройство должно быть автоклавировано при 121 °C и 101 кПа в течение 5 мин для обеспечения стерильности.

3. Подготовка корковых нейронов

1. Обезболите 3 послеродовых крыс Спрэга-Доули (СД) (в течение 12 ч после рождения), поместив их на лед на 5 минут, а затем быстро обезглавьте.
2. Рассеките моторную область коры головного мозга и поместите ткань в предварительно охлажденный буфер для диссекции (например, 2 мл HBSS без кальция и магния).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры диссекции тканей выполняйте на льду с использованием предварительно охлажденных растворов.
3. Измельчите салфетку примерно на^{1 мм 3} части с помощью стерильных ножниц и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
4. Дайте постоять 5 минут, а затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить остатки крови и буфер.
5. Добавьте предварительно подогретый раствор папаина (1 мг/мл) в 5 мл HBSS с кальцием и магнием, нагретым до 37 °C.
6. Инкубировать в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2 в течение 40 минут, осторожно переворачивая трубку 3 раза каждые 10 минут.
7. После разложения осторожно разотрите суспензию 100 раз с помощью пипетки объемом 200 μл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков воздуха для предотвращения клеточного стресса.
8. Центрифугируйте при 300 × г в течение 3 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
9. Добавьте терминирующий раствор, содержащий 1 мг/мл ингибитора протеазы (например, 600 мкл флакона ингибитора системы диссоциации папаина в 5 мл HBSS с кальцием и магнием) для ресуспендирования клеток.
10. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр 40 мкм и соберите фильтрат в новую центрифужную пробирку.
11. Центрифугируйте фильтрат при концентрации 200 × г в течение 10 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
12. Ресуспендируйте гранулу в 500 мкл полной питательной среды для нейронов, содержащей 2% B27 и 1% GlutaMAX.
13. Посчитайте клетки (примерно 3 миллиона/крыса) и отрегулируйте плотность до 1 ×^{10 6} клеток/мл для последующего использования.

4. Покрытие

ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте покровные листы или чашки для культивирования раствором поли-D-лизина (PDL) для улучшения адгезии нейронов и создания оптимальной среды для роста нейронов.

1. Нанесение покрытия на покровные стекла
   1. Поместите покровное стекло, предназначенное для обычных микрофлюидных устройств (Φ25 мм, толщина 0,17 мм), в чашку для культивирования 35 мм и добавьте 2 мл 0,1 мг/мл раствора PDL.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 6 ч или на ночь.
   3. После инкубации осторожно извлеките раствор PDL для повторного использования или правильной утилизации.
   4. Добавьте в форму 2 мл стерильной сверхчистой воды и поверните ее 50 раз по часовой стрелке, а затем 50 раз против часовой стрелки (для нескольких блюд вращайте их одновременно в большой чашке).
   5. Отсасывайте воду с помощью вакуумного насоса, подключенного к стерильному наконечнику для пипетки, собирая отходы в контейнер для жидких отходов.
   6. Повторите процедуру стирки (шаги 4.1.4-4.1.5) в общей сложности три раза.
   7. Перед использованием дайте покровным стеклам высохнуть на воздухе в шкафу для биобезопасности.
2. Покрытие чаши для культуры
   1. Добавьте соответствующее количество раствора PDL 0,1 мг/мл в чашку для культивирования или планшет для лунок (например, добавьте 2 мл в чашку диаметром 35 мм для обычной микрофлюидики и 5 мл в чашку диаметром 10 см для крупномасштабной микрофлюидики).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шкаф биобезопасности находится в правильном рабочем состоянии с помощью стерильного потока воздуха, чтобы предотвратить загрязнение.
   2. Убедитесь, что раствор полностью покрывает дно, и инкубируйте его при температуре 37 °C в течение 6 часов или в течение ночи.
   3. После извлечения раствора PDL трижды промойте чашку для культивирования соответствующим количеством стерильной сверхчистой воды, как описано в шаге 4.1.4.
   4. Удалите остатки сверхчистой воды и высушите чашку для культуры на воздухе в колпаке с ламинарным потоком для последующего использования.

5. Приготовление нейронной среды

1. Подготовьте готовую среду для рутинного культивирования нейронов.
   1. Извлеките поршень из одноразового шприца объемом 50 мл. Поместите шприц резиновой головкой вверх на чистую скамью в шкафу биобезопасности.
   2. Добавьте в шприц последовательно 500 мкл пенициллина стрептомицина (PS), 1 мл B27, 125 мкл GlutaMAX и 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS). Меняйте наконечник дозатора для каждого компонента, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте каждый компонент в указанном порядке для обеспечения согласованности.
   3. Возьмите новую стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Обозначьте его как «Нейробазал-А (НБА) + 2% B27 + 0,25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте NBA, если не эмбриональные нейроны; использовать нейробазальное (NB) для эмбриональных нейронов.
   4. Прикрепите к концу шприца фильтр длиной 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фильтр плотно присоединен к шприцу, чтобы предотвратить утечку.
   5. С помощью NBA наполните шприц жидкостью до 50 мл, включая объем добавок. Установите на место поршень.
   6. Медленно нажимайте на поршень со скоростью примерно 2 мл/с, чтобы отфильтровать жидкость в пробирку с маркировкой для центрифуги.
   7. Затяните крышку центрифужной пробирки. Переверните трубку 3-5 раз, чтобы перемешать среду.
2. Полная среда, содержащая [^U-13C₆]-глюкозу (для анализа метаболического потока): Для анализа метаболического потока метаболизма глюкозы в поврежденных нейронах используйте НБА без сахара для приготовления полной среды, содержащей [^U-13C₆]-глюкозу.
   1. Используйте не содержащую глюкозу NBA в качестве базового раствора и добавьте [^U-13C₆]-глюкозу до конечной концентрации 25 мМ перед фильтрацией (если [^U-13C₆]-глюкоза твердая, рассчитайте и взвесьте ее заранее). Следуйте той же последовательности добавления других компонентов, а также этапов фильтрации и смешивания, как описано в разделе 5.1.

6. Подсчет ячеек

1. Тщательно протрите гемоцитометр 75% этанолом. Прежде чем продолжить, убедитесь, что все поверхности полностью высохли.
2. Добавьте 90 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
3. Аккуратно суспендируйте собранную суспензию нейронных клеток, пипетируя вверх и вниз 3-5 раз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
4. С помощью пипетки объемом 10 мкл перенесите 10 мкл суспензии смешанных клеток в центрифужную пробирку, содержащую 90 мкл PBS (разведение 1:10).
5. С помощью пипетки объемом 200 мкл аккуратно перемешайте раствор 10 раз, не допуская образования пузырьков.
6. Замените наконечник пипетки на новый наконечник объемом 10 мкл. Наберите 10 мкл смеси и добавьте ее в камеру для образцов гемоцитометра.
7. Поместите гемоцитометр на предметный столик микроскопа и сфокусируйтесь с помощью объектива 20x. Найдите центральную сетку 4 × 4 и подсчитайте ячейки во всех 16 квадратах, следуя стандартным правилам гемоцитометра.
8. Записывайте общее количество ячеек из всех 16 квадратов. Рассчитайте концентрацию клеток по формуле: (Общее количество × 10) ×^{10 4} ячейки/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда работайте в шкафу биобезопасности с надлежащими средствами индивидуальной защиты.

7. Культивирование корковых нейронов in vitro в обычных или крупномасштабных микрофлюидных устройствах

1. Протокол А (Обычные микрофлюидные устройства).
   1. Убедитесь, что стеклянная поверхность в чашке для культуры диаметром 35 мм полностью сухая.
   2. С помощью стерильных щипцов с тонким наконечником поместите автоклавный микрофлюидный чип в центр стеклянной поверхности микроканалами вниз.
   3. Аккуратно прижмите чип к стеклянной поверхности с помощью наконечника пипетки объемом 200 μл, чтобы обеспечить полное сцепление.
   4. Отметьте левую камеру точкой (·) с помощью перманентного маркера для обозначения отсека сомы.
   5. Аспират 10 мкл нейрональной суспензии (10 млн клеток/мл) с помощью пипетки объемом 10 мкл.
   6. Медленно выдавите суспензию в погрузочное отверстие над отмеченным отсеком сомы.
   7. Убедитесь в правильности поступления жидкости в нижний резервуар левой камеры.
   8. Перенесите чашку для культивирования в увлажненный инкубатор (37 °C, 5%_CO2) на 20 минут.
   9. Выньте чашку с культурой из инкубатора.
   10. С помощью фазово-контрастного микроскопа 20 × подтвердить перфузию сред из сомового компартмента в аксональный через микроканалы.
   11. Добавьте 150 мкл нейрональной базальной среды в верхний порт аксонального компартмента (правая камера), обеспечивая гравитационный поток к нижнему резервуару.
   12. Аналогичным образом добавьте 15 мкл полной нейронной среды в верхний порт сомального компартмента (левая камера).
       Примечание: На этой стадии нейроны должны прилипать заметно, при этом большая часть клеточного мусора вымывается в нижнюю лунку. Не заменяйте среду во время культивирования; Используйте однократное добавление полной нейронной среды, как описано в шаге 5.1.3.
   13. Налейте 20 мл сверхчистой воды в чашку для культуры диаметром 150 мм, чтобы создать камеру влажности. Поместите чашку для культуры диаметром 35 мм внутрь большой чашки.
   14. Перенесите всю систему культивирования в инкубатор и выдерживайте в течение необходимого времени (например, 7 дней).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры культивирования клеток в стерильных условиях в шкафу биобезопасности. Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат и перчатки). Обеззараживание рабочих поверхностей до и после процедур.
2. Протокол B (Крупномасштабные микрофлюидные чипы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный протокол общепринятых спецификаций был соблюден с двумя модификациями.
   1. Для размещения устройства используйте чашку Петри диаметром 10 см.
   2. Выбирайте полноканальный или интервальный посев в зависимости от экспериментальных потребностей, так как каждый метод требует разных протоколов повреждения аксонов.
   3. После завершения посева добавьте 5 мл полной среды для культивирования нейронов в чашку Петри диаметром 10 см для поддержания роста нейронов.
   4. Добавьте 20 мл сверхчистой воды в большую чашку диаметром 150 мм, чтобы создать камеру влажности. Затем поместите 10-сантиметровую тарелку внутрь большой тарелки.
   5. То же, что и шаг 7.1.14.

8. Создание модели аксонального повреждения in vitro в обычных микрофлюидных устройствах

1. Отметьте левую сторону микрофлюидного устройства как сомальный компартмент (как обозначено знаком «·»), а правую сторону — как аксональный терминальный компартмент.
2. Засейте корковые нейроны в сомальный компартмент.
3. Культивируйте нейроны in vitro до 7-го дня (DIV7), позволяя аксонам простираться по микроканалам к аксональному терминальному компартятту.
4. В DIV7 выполните процедуры по лечению аксонального повреждения в аксональном терминальном отделе, чтобы создать модель аксонального повреждения in vitro .
5. Возьмите соответствующее количество среды NBA и переложите его в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл для последующего использования.
6. Культивируйте корковые нейроны в микрофлюидном устройстве в течение указанного срока. Затем перенесите устройство на чистую скамейку.
7. Используйте безворсовую бумагу для сушки дна чашки для культуры диаметром 35 мм. С помощью пипетки объемом 200 мкл отсасывайте среду из двух правых отверстий микрофлюидного устройства.
8. Подсоедините трубку вакуумного насоса к стерильному наконечнику для пипетки объемом 200 мкл объемом 200 μл, включите вакуумный насос (скорость всасывания 60 л/мин) и направьте наконечник на точку соединения между нижним отверстием концевой камеры аксона и камерой для отсасывания старой среды (в этом месте аксоны ломаются из-за отрицательного давления).
9. Установите на место наконечник пипетки объемом 200 мкл и наберите 150 мкл NBA, медленно добавляя его через нижнее отверстие правой камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если поток жидкости слишком медленный и образуются пузырьки, быстро вытолкните жидкость из наконечника, чтобы быстро заполнить камеру.
10. Чередуйте использование двух правых отверстий для добавления жидкости: после каждого добавления NBA немедленно используйте вакуумный насос для аспирации жидкости из другого отверстия, чтобы разорвать аксоны. Повторите эту операцию 4 раза, и после последней аспирации замените на свежую полноценную нейронную среду.
11. Аспирируйте старую среду из бокового отверстия тела клетки и добавьте свежую полную нейронную среду, содержащую препараты (при необходимости).
12. Поместите микрофлюидное устройство вместе с чашкой для культивирования в чашку для культивирования диаметром 150 мм и продолжайте культивирование в течение указанного времени (например, 24 часа).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для операции по повреждению аксонов требуется среда NBA, так как нейронная полная среда будет производить пузыри, влияющие на эффект разрыва.

9. Масштабное микрофлюидное устройство аксонального повреждения

1. Метод 1: Мануальная аксональная травма.
   1. Засейте нейроны во все камеры микрофлюидного устройства.
   2. Инкубируйте устройство при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2 в течение трех дней, затем извлеките все микрофлюидное устройство.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание механического напряжения или разрыва аксонов, вросших в микроканалы, удалите микрофлюидное устройство в точке DIV3 вместо DIV7. Это особенно важно, если в план эксперимента включена контрольная группа без повреждений.
   3. На этапе DIV7 извлеките из инкубатора чашку для культур, содержащую микрофлюидное устройство, и поместите ее на стерильную стадию.
   4. Подготовьте микроскоп с 20-кратным увеличением и простерилизуйте рабочую зону с помощью 75% этанола.
   5. Возьмите стерильный наконечник для пипетки объемом 10 мкл и определите пучки аксонов в исходных микроканалах под руководством микроскопа.
   6. Выполните продольные царапины вдоль каждого пучка аксонов с помощью наконечника пипетки.
   7. Наблюдайте за обрывом аксона под микроскопом в режиме реального времени после царапины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с живыми нейронами надевайте нитриловые перчатки и работайте в лабораторных условиях, стерилизованных ультрафиолетовым излучением
2. Метод 2: Вакуумное аксональное повреждение.
   1. Засеивают корковые нейроны поочередно в крупноформатном микрофлюидном устройстве.
   2. Включите вакуумный насос и установите его на 60 л/мин.
   3. Подсоедините конец трубки вакуумного насоса к порту аксонной камеры с помощью стерильного наконечника для дозатора.
   4. Полное разрывание аксонов путем применения вакуумного давления с помощью обычных микрофлюидных протоколов.
   5. (Дополнительный) Чтобы целенаправленно собрать поврежденные аксоны, в определенный момент времени после аксотомии быстро отсасывайте содержимое компартмента клеточного тела с помощью вакуумного насоса (со скоростью всасывания 60 л/мин) для удаления клеточных тел, тем самым оставляя только аксоны внутри микроканалов.

10. Гипоксическое лечение обычными или крупномасштабными микрофлюидными устройствами

1. Посев первичных нейронов в микрофлюидное устройство и культивирование до DIV7 в нормоксических условиях (37 °C, 5%_CO2).
2. Поместите микрофлюидное устройство в камеру гипоксического инкубатора и подайте в него газовую смесь, состоящую из 1%_О2, 5%_СО2 и сбалансированного N₂.
3. С помощью ротаметра контролируйте расход газа и установите его на 25 л/мин.
4. Промойте камеру в течение 5 минут, чтобы вытеснить воздух.
5. Зажимая входное отверстие гипоксической камеры, закройте выпускной редукционный клапан.
6. Зажмите выходную трубку гипоксической камеры и, наконец, плотно закройте вентиль газового баллона.
7. Инкубируйте микрофлюидное устройство в гипоксической камере при температуре 3 °C в течение 1 ч.

11. Пробоподготовка нейронов, культивируемых in vitro с использованием крупномасштабных микрофлюидных устройств для омиксного анализа

1. Образец для транскриптомики.
   1. Перенесите микрофлюидное устройство с поврежденными аксонами в колпак для ламинарного потока через 6 ч после завершения травмы аксона.
   2. Выбросив старую среду, промойте нейрональные клетки 2-3 раза стерильным ПБС.
   3. Используйте стандартный набор для экстракции РНК для выделения и очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя.
   4. Выполните секвенирование РНК. Проведение последующего биоинформатического анализа на полученных данных секвенирования.
2. Образец для анализа метаболического потока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для мониторинга изменений метаболического потока глюкозы в нейронах после травмы с использованием крупномасштабного микрофлюидного устройства мы использовали анализ метаболического потока [^U-13C₆]-глюкозы²⁴. Протокол подготовки образцов для анализа ЖХ-МС выглядит следующим образом:
   1. Для экспериментов используйте крысят P0 SD. Препарируйте корковые нейроны и культивируйте их in vitro либо кратковременно (DIV5-DIV7), либо долгосрочно (DIV15-DIV30).
   2. Для молодых (DIV5-DIV7) и зрелых (DIV15-DIV30) нейронов установите группы повреждений и контрольные группы без повреждений.
   3. Замените среду на среду, содержащую 25 мМ [^U-13C₆]-глюкозу (Neurobasal-A без глюкозы, 1% FBS, 2% B27, 25 mM [^U-13C₆]-глюкозу) и инкубируйте в течение 4 ч при 37 °C.
      Примечание: Чтобы избежать нервного стресса и апоптоза, вызванных осмотическими изменениями или изменениями pH во время обмена среды, подготовьте дополнительные нейроны, культивируемые в среде, содержащей 25 мМ [^U-13C₆]-глюкозу во время посева, и используйте эту среду для обмена.
   4. После двух аккуратных промывок 5 мл предварительно подогретого HBSS (содержащего кальций и магний) заморозьте образцы в жидком азоте и храните при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с жидким азотом надевайте нитриловые перчатки и лабораторный халат.

12. Иммунофлуоресцентное окрашивание нейронов на основе обычных и крупномасштабных микрофлюидных устройств

Примечание: При культивировании нейронов in vitro с использованием микрофлюидных устройств необходимо учитывать потенциальное повреждение нейронных аксонов в микроканалах, которое может произойти при разборке этих устройств для фиксации живых клеток.

1. Используйте вакуумный насос для микроотходов для удаления питательной среды из четырех лунок микрофлюидного устройства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите жидкость в двух камерах на протяжении всего процесса иммунофлуоресцентного окрашивания. Параметры всасывания не должны быть слишком высокими (оптимально 2,5 л/мин), чтобы избежать повреждения или аспирации тел нейрональных клеток и аксонов.
2. Добавьте по 100 мкл 1x PBS в каждую из двух верхних лунок микрофлюидного устройства (PBS будет естественным образом поступать в нижние лунки).
3. Замените наконечник без фильтра в конце вакуумного насоса, аспирируйте PBS из нижних лунок и повторите процесс три раза. На последней итерации аспирируйте все PBS из четырех лунок.
4. Добавьте по 150 мкл 4% раствора параформальдегида (PFA) в каждую из двух верхних лунок и зафиксируйте при комнатной температуре в течение 10-15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте разборки устройства во время фиксации живых клеток, чтобы сохранить структурную целостность нейронов. Такой подход помогает более четко различать расположение нейрональных сом и аксонов.
5. Промойте три раза 1x PBS, затем инкубируйте нейроны блокирующим буфером, содержащим 5% козьей сыворотки, 0,3 М глицина, 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA), PBS и 0,1% (или 0,5%) Triton X-100 в течение 1 часа.
6. Разведите первичное антитело (например, βIII-тубулин, мышь, 1:2000) в блокирующем буфере, добавьте 100 мкл в верхнюю левую лунку и 50 мкл в верхнюю правую лунку и инкубируйте с нейронами в течение ночи при 4°С.
7. После отсасывания первичного антитела промыть три раза 1x PBS, как описано в шагах 12.2-12.3. Затем добавьте вторичное антитело, приготовленное с блокирующим буфером, в верхние лунки микрофлюидного устройства, как описано в шаге 12.6, и инкубируйте в темноте в течение 30 минут (при необходимости накройте алюминиевой фольгой).
8. После трехкратной стирки 1x PBS, прополощите один раз сверхчистой водой. Осторожно используйте изогнутый пинцет, чтобы захватить и извлечь устройство из верхнего правого угла микрофлюидной установки.
9. Добавьте 1 мл PBS в чашку для культур, чтобы отделить большую покровную упаковку от чашки.
10. С помощью пипетки наберите 15 μл монтажной среды и опустите ее на покровную крышку в специально отведенном месте для защитных крышек.
11. Осторожно опустите боковую часть ячейки на монтажный материал, установите покровное стекло и удалите излишки жидкости.
12. Дайте монтажному материалу полностью высохнуть при комнатной температуре.
13. После того, как монтажная среда высохнет при комнатной температуре, используйте конфокальный микроскоп с вращающимся диском для выполнения визуализации.
14. Выберите 20-кратный воздушный объектив, установите время экспозиции 100-200 мс на кадр и установите мощность лазера на 5-10% от максимальной с возбуждением 488 нм для зеленого флуоресцентного белка (GFP) и/или 561 нм для красного флуоресцентного белка (RFP).

13. Визуализация живых клеток в обычных микрофлюидных устройствах

1. Культивируйте корковые нейроны в микрофлюидном устройстве до DIV7.
2. Приготовьте краситель для живых клеток (например, зонд для измерения потенциала митохондриальной мембраны) в соответствии с инструкциями производителя.
3. Разведите краситель в предварительно подогретой (37 °C) среде для поддержания нейронов.
4. Загрузите раствор красителя в соматический отсек микрофлюидного устройства.
5. Инкубировать в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ .
6. Аккуратно промойте отсеки 3 раза 3 мл предварительно подогретого (37 °C) HBSS, содержащего кальций и магний.
7. Добавьте в микрофлюидный чип раствор для визуализации живых клеток, не содержащий фенола, красного цвета.
8. (Дополнительный) Включите GlutaMAX (0,25%) и B27 (2%) для длительной визуализации.
9. Поместите микрофлюидный чип на предметный столик микроскопа так, чтобы соматическая камера находилась слева, а аксональная терминальная камера — справа.
10. Добавьте каплю погружного масла на линзу объектива, следя за тем, чтобы масло соприкасалось с покровным стеклом под сколом.
11. Используйте 40-кратный объектив с экспозицией 150 мс и максимальной мощностью лазера 10-15% для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте эти параметры в зависимости от фотостабильности красителя.

14. Анализ данных

1. Используйте программное обеспечение ImageJ для анализа микроскопических изображений. Оцените качество РНК с помощью биоанализатора. Выполняйте и анализируйте РНК-секвенирование с помощью соответствующей платформы.
2. Для метаболомных исследований извлекайте необработанные масс-спектрометрические данные с помощью программы MRMPROBS (версия 2.60) и собирайте информацию об идентифицированных метаболитах, включая изотопные детали и пиковые площади.
3. Используйте GraphPad Prism (версия 8.4.3) для всех статистических анализов. Представьте данные в виде среднего ± SEM. Используйте непарные двухсторонние t-критерий или тесты Манна-Уитни для сравнения групп и применяйте двусторонний ANOVA для сравнения между несколькими временными точками внутри групп (Значимость: нс, не значимо; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

Результаты

Чтобы создать всестороннюю исследовательскую платформу для изучения механизмов метаболической регуляции в корковых нейронах, мы сначала культивировали корковые нейроны в обычном микрофлюидном устройстве, точно контролируя рост аксонов вдоль микроканалов (рис. 2A). При соответствующей конструкции микроканалы были сконструированы с небольшой высотой (5 мкм) и большей шириной (10 мкм), что позволило каждому каналу разместить больше аксонов, не позволяя клеточным...

Обсуждение

Создание передовых моделей in vitro для изучения повреждения и регенерации аксонов имеет важное значение для раскрытия молекулярных и метаболических механизмов, участвующих в восстановлении нейронов^16,19. В этом исследовании мы представляем стандартизированный рабочий процесс, который объединяет микрофлюидные устройства, крупномасштабные нейронные культуры и точные протоколы повреждения аксонов, что позволяет проводить н...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Нейробазал - среда А	Gibco	10888022	Питательная среда
Alexa Fluor 488 козий антимышь	Инвитроген	А-21042	Иммунофлюоресценция
Аналитические весы	Шанхай Шуньюй Хэнпин Научный инструмент Ко., Лтд.	ФА1004	Точное взвешивание реагентов/образцов
B27 (50x)	Gibco	17504044	Питательная среда
Анализ белка BCA	Бостер	АР1189	Концентрации белка
Биоанализатор	Agilent	https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Бычий сывороточный альбумин	Генвью	ФА016	Иммунофлюоресценция
Центробежная мешалка-мешалка	ДУМАТЬ	АРЕ-310	Смешивание PDMS и дегазации
Анализатор CLARIOstarPlus-ACU	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus	концентрации белка
CO2 инкубатор	Thermo Fisher Scientific (Asheville) LLC	3111	Инкубация клеточных культур при 37°С; С, 5% CO?
Коррозионностойкий мембранный вакуумный насос	Шанхай Лишэнь Бангси Инструмент Технолоджи Ко., Лтд.	ЛК-85DLC	Аспирация отработанной жидкости и отсасывание для аксотомии
D-ГЛЮКОЗА (U-13C6, 99%)	Кембриджская изотопная лаборатория	КЛМ-1396	Метаболический поток
ДНКаза I	Рош	11284932001	Культура нейронов
Платформа Dr.TOM2	Геномика BGI		Выполнение и анализ РНК-секвенирования
Электрический сушильный шкаф с горячим воздухом	БИОМ Хуахонг Бонн / Хуайин Боси	DHG-9070А	Отверждение PDMS
Электронные весы	Шанхай Хуачао Индастриал Ко., Лтд.	НС313	Регулярное взвешивание материалов
Водная монтажная среда Fluoromount	Сигма-Олдрич	Ф4680	Иммунофлюоресценция
ГлутаМАКС	Gibco	35050061	Питательная среда
Глицин	Соларбио	Г8200	Иммунофлюоресценция
HBSS	Gibco	14025092	Культура нейронов
HBSS, без кальция, без магния	Gibco	14175095	Культура нейронов
Паровой стерилизатор высокого давления	STIK Instrument (Shanghai) Co., Ltd.	HMJ-54A	Стерилизация лабораторного оборудования и сред
Гипоксическая камера	Технологии стволовых клеток	27310	Лечение гипоксией
ИзображениеJ	НИЗ		Используется для анализа микроскопических изображений
Микроскоп Leica	Leica Microsystems CMS GmbH	DMIL LED Fluo	Наблюдение в реальном времени и флуоресценция
Решение для визуализации живых клеток	Инвитроген	A14291DJ	Визуализация живых клеток
Медицинский низкотемпературный бокс для хранения (-80 °°; C)	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	ДВ-86Л388Дж	Длительное хранение проб при -80 °°; C
Настольный мини вакуумный насос	Хаймэнь Цилинь-Белл Инструментостроительная Компания Ко., Лтд.	GL-805	Малые вакуумные установки
MitoTracker Orange CMTMRos	Инвитроген	М7510	Окрашивание потенциала митохондриальной мембраны
Программа MRMPROBS		Версия 2.60	Для извлечения исходных данных масс-спектрометрии
Нейробазальная среда	Gibco	21103049	Питательная среда
Нейробазал-А без глюкозы	Gibco	A2477501	Питательная среда
Папаин	Уортингтон	LS003127	Культура нейронов
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	П6148	Фиксация клеток
ПДМС	Dow Corning	ДК184	Изготовление устройств
Флакон с ингибитором набора PDS	Уортингтон	LK003182	Культура нейронов
Пенициллин стрептомицин	Gibco	15140122	Питательная среда
Фосфатно-солевой буфер	Биошарп	БЛ302А	Разбавьте вещества и очистите контейнеры с камерами
Плазменный очиститель	Гаррик Плазма	ОДК-32Г-2	Активация
Поли-D-лизин	Сигма-Олдрич	П6407	Культура нейронов
Призма	ГрафПад	Версия 8.4.3	Статистический анализ
Охлаждаемая центрифуга	Eppendorf AG (Германия)	5430Р	Отделение проб при контролируемых температурах
Набор для экстракции общей РНК RNArep Pure Cell/Bacterial	Тяньген	ДП430	Транскриптомика
Ротаметр	Дуайер	РМА-23-ССВ	Контролируйте низкий расход кислорода
Стереомикроскоп	Корпорация Olympus	SZ2-ILST	Наблюдение и вскрытие образца
Орбитальный шейкер Стюарта	Килин-Белл	ТС-200	Смешивание клеточных культур/растворов с регулируемой скоростью
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич	Х100	Иммунофлюоресценция
ULVAC Пластинчато-роторный вакуумный насос	ULVAC (Ningbo) Co., Ltd.	ГЛД-Н202	Создание вакуума для фильтрации/сушки
&бета; III-тубулин	Компания Promega	Г7121	Иммунофлюоресценция