Методическая статья

Оценка терапевтических вмешательств в мышиной модели илеита и фиброза, похожего на болезнь Крона, с дефицитом SHIP

DOI:

10.3791/68928

⸱

14 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует, как мышиная модель воспаления и фиброза, похожего на болезнь Крона (БК), с дефицитом домена Src 2 для тестирования новых методов лечения БК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Болезнь Крона (БК) — это хроническое, рецидивирующее воспалительное заболевание, характеризующееся сегментарным, трансмуральным воспалением, которое может поражать любую часть желудочно-кишечного тракта. Отличительной чертой БК является нарушение барьерной функции кишечника, а фиброз кишечника является распространенным осложнением. У мышей с дефицитом SHIP (SHIP-/-) спонтанно развивается дисфункция кишечного барьера, воспаление подвздошной кишки и фиброзная патология, повторяющие ключевые особенности CD-подобного илеита. Мыши SHIP-/- служат ценной моделью для тестирования противовоспалительной и антифибротической терапии при БК.

Здесь мы описываем методы оценки терапевтических вмешательств в этой модели, используя дексаметазон в качестве примера эффективной терапии. Мы предоставляем пошаговый протокол для характеристики заболевания и ответа на лечение, включая in vivo оценку проницаемости кишечника, измеренную с помощью ФИТК-декстрана, а также общее патологическое исследование и подробный гистологические анализы. Гистологические оценки включают окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) при воспалении, трихромное окрашивание Массона при фиброзе и окрашивание Alcian blue/Periodic Acid-Schiff (PAS) при гиперплазии и гипертрофии бокаловидных клеток. Кроме того, для оценки воспалительного состояния количественно оцениваются цитокины и маркеры воспаления в подвздошной ткани. Вместе эти методы обеспечивают всестороннюю основу для оценки эффективности лечения на мышиной модели CD-подобного илеита SHIP-/-. Этот протокол широко применим к исследователям, изучающим воспаление кишечника, заживление слизистых оболочек и фиброз кишечника.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двумя основными типами воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) являются болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), оба из которых характеризуются хроническим воспалением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которое может иметь рецидивирующе-ремиттирующее или прогрессирующее течение1. Несмотря на то, что ВЗК исторически считалась болезнью западных стран, ее заболеваемость быстро растет в развивающихся странах Южной Америки, Азии и Африки2. В то же время распространенность продолжает расти в Северной Америке, Европе и Австралии: в период с 1990 по 2019 гг. было зарегистрировано почти 50% увеличение как заболеваемости, так и распространенности, что подчеркивает растущее глобальное бремя для здоровья от ВЗК 2,3. Несмотря на значительные исследовательские усилия, основная причина ВЗК остается неизвестной. Современные данные свидетельствуют о сложном взаимодействии между генетической восприимчивостью, дисфункцией иммунной системы и триггерами окружающей среды, включая изменения в микробиоме 4,5.

Существуют ключевые различия между CD и UC. При ЯК воспаление ограничено толстой кишкой и характеризуется непрерывным вовлечением, ограниченным слоем слизистой оболочки 6,7. Напротив, БК характеризуется прерывистым и трансмуральным воспалением, которое может поражать любую часть желудочно-кишечного тракта, чаще всего в терминальной части подвздошной кишки 6,7. Отличительным осложнением БК является фиброз кишечника, который способствует образованию стриктур и кишечной непроходимости8. Фиброз характеризуется избыточным отложением компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген, и утолщением мышечных слоев кишечника 9,10. Примерно у 30% людей с БК развивается стриктурирующая болезнь в течение 10 летпосле постановки диагноза. В настоящее время не существует методов лечения, непосредственно нацеленных на фиброз, что является неудовлетворенной клинической потребностью, которая может быть удовлетворена с помощью подходящих доклинических моделей для изучения этого осложнения 9,12.

Чтобы лучше понять патогенез ВЗК и облегчить разработку новых методов лечения,было создано множество мышиных моделей. Несмотря на то, что существует большое количество моделей колита, лишь немногие из них повторяют воспаление подвздошной кишки и CD-ассоциированный фиброз12. К их числу относятся описанные здесь 5'-инозитолфосфатаза дефицитные 5'-инозитолфосфатаза (SHIP-/-) гомологии Src 2, а также мыши SAMP1/YitFc и мыши TnfΔARE. Эти модели в совокупности отражают сложность БК человека, поскольку каждая из них управляется различными клеточными и молекулярными механизмами. Заболевание у мышей SAMP1/YitFc является результатом полигенной предрасположенности, влияющей на функцию эпителиального барьера и иммунную регуляцию13,14, в то время как мыши TnfΔARE несут делецию богатых AU элементов в мРНК TNF, что приводит к повышению стабильности мРНК и избыточной продукции TNF15,16. Несмотря на свою ценность, эти модели имеют ограничения. Модель SAMP1/YitFc страдает от низкой эффективности разведения, что создает проблемы в создании достаточного размера когорты для исследований17. Кроме того, модель TnfΔARE требует до 24 недель для развития заметной фиброзной патологии, что делает проведение интервенционных исследований дорогостоящим и сложным16.

SHIP является негативным регулятором сигнального пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и преимущественно экспрессируется в кроветворных клетках. Он функционирует, удаляя 5'-фосфатную группу из фосфатидилинозитола 3,4,5-трифосфата, тем самым ослабляя передачу сигналов PI3K18. Мыши SHIP-/- имеют ряд преимуществ для доклинических исследований. Эти мыши относительно легко размножаются и проявляют признаки фиброза уже в возрасте 8 недель в возрасте19 лет. Ускоренное фиброзное ремоделирование в этой модели, вероятно, обусловлено усилением воспалительных реакций из-за нерегулируемого пути PI3K, что приводит к гиперактивации иммунных клеток и последующему быстрому ремоделированию тканей. Самое главное, что мы и группа Керра независимо друг от друга показали, что у мышей SHIP-/- развивается илеит с особенностями, которые очень напоминают человеческий CD19,20. Подтверждая актуальность этой модели, подгруппа лиц с БК имела сниженную активность SHIP как в биопсии подвздошной кишки, так и в PBMC21. Более того, пациенты с низкой активностью SHIP, как правило, имеют более тяжелое течение заболевания, часто требующее нескольких операций22.

У мышей SHIP-/- начинает развиваться спонтанное, прерывистое воспаление кишечника, локализованное в дистальном отделе подвздошной кишки, уже в возрасте 4 недель, причем воспаление присутствует у всех мышей к 6 неделям в возрасте20 лет. К 8-недельному возрасту у мышей устанавливается фиброзная патология, характеризующаяся утолщением наружной мускулатуры и обширным накоплением коллагена в подслизистой оболочке и между мышечными слоями19. Воспаление в этой модели обусловлено интерлейкином-1β, полученным из макрофагов (IL-1β)21. Как истощение макрофагов с помощью клодронатсодержащих липосом, так и фармакологическая блокада передачи сигналов IL-1 антагонистом рецепторов IL-1 (анакинрой) улучшали воспаление кишечника у мышей SHIP-/-21. В дополнение к илеиту, у мышей SHIP-/- наблюдается воспаление легких, которое мы использовали для оценки побочных эффектов терапии, разработанной для локализованной кишечной доставки23. Другие исследователи сообщили, что ингибирование каспазы-8 с помощью Z-IETD-FMK значительно снижает воспаление подвздошной кишки и легких у мышей SHIP-/-24, что еще больше подтверждает патологию легких в качестве дополнительного признака для оценки системного воспалительного контроля.

В этом методологическом документе мы пересматриваем нашу недавно опубликованную работу по успешному лечению дексаметазоном23 и подробно описываем ключевые технические процедуры, а также дополнительные соображения по использованию мышиных моделей в фармакологических испытаниях. В частности, мы выделяем стандартные параметры для оценки эффективности препарата в моделях ВЗК, включая оценку проницаемости кишечника, общей патологии, гистопатологии, а также провоспалительных медиаторов и эффекторов, и обсуждаем, как интегрировать эти данные для получения выводов об общей терапевтической эффективности.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования с участием животных должны проводиться в соответствии с этическими протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях, а также в соответствии с Руководящими принципами по уходу за животными Национальных исследовательских советов. Все процедуры для животных в этом протоколе соответствовали этическим принципам Канадского совета по уходу за животными и были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Британской Колумбии (протокол A21-0212).

Примечание: Для оценки терапевтического влияния препарата на патологию кишечника мышей SHIP-/- включите SHIP+/+ в качестве здоровой контрольной группы для сравнения. Для терапевтического вмешательства следует начинать лечение в возрасте 6 недель, когда заболевание полностью установлено в модели. В данном случае мыши SHIP+/+ и SHIP-/- ежедневно получали пероральный зонд дексаметазона в дозе 3 мг/кг в 0,5% β-циклодекстрине (носитель) или только носитель в течение 2 недель в объеме 10 мкл/г.

1. Анализ ФИТК-декстрана для измерения проницаемости эпителиального барьера

  1. Быстрые мыши за 4 ч до проведения анализа.
  2. Растворить 4 кДа ФИТК-декстрана в стерильном 1x PBS до конечной концентрации 80 мг/мл.
  3. Подготовьте достаточно для 150 μL на одну мышь, плюс 50 μL дополнительно для стандартной кривой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму воздействие света на раствор FITC-декстрана и образцы плазмы на протяжении всей процедуры.
  4. Аккуратно застегните (загривок) каждую мышь и введите 150 мкл раствора ФИТК-декстрана через зонд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите таймер сразу после введения первого зонда. Подождите 10-15 минут между каждой последующей мышью, чтобы дать достаточно времени для эвтаназии и последующих процедур в шахматном порядке, сводя к минимуму вариативность из-за разницы во времени.
  5. Держать мышей без еды в течение 4 ч.
  6. Усыпляйте мышей с использованием 5% изофлурана (ингаляционный анестетик, вводимый с 1,5 л кислорода/мин) с последующим введением углекислого газа в соответствии со стандартной институциональной процедурой. Соберите кровь с помощью пункции сердца с помощью игл 25 G и шприцев объемом 1 мл.
  7. Немедленно добавьте 10 мкл раствора кислоты-цитрата-декстрозы на каждые 100 мкл собранной крови в качестве антикоагулянта. Тщательно перемешайте методом инверсии.
  8. Центрифугируйте при давлении 1500 x g в течение 10 мин при 4 °C и осторожно перенесите плазму (надосадочную жидкость) в помеченные микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл. Храните образцы на льду и в защищенном от света месте до анализа.
  9. Разбавьте каждый образец плазмы в соотношении 1:2 и 1:10 с помощью 1x PBS.
  10. Добавляйте по 100 мкл каждого разведения в непрозрачный 96-луночный планшет в двух экземплярах.
  11. Выполняйте последовательные разведения 1:2 исходного запаса FITC-декстрана в концентрации 80 мг/мл с использованием 1x PBS для достижения следующих концентраций: 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 и 0 нг/мл. Добавьте по 100 мкл каждой концентрации в 96-луночный планшет в двух экземплярах.
  12. Измеряйте флуоресценцию при возбуждении 485 нм и излучении 535 нм с помощью считывателя микропланшетов.

2. Оценка общей патологии

  1. После забора крови для анализа ФИТК-декстрана тщательно иссекайте всю тонкую кишку.
  2. Аккуратно удалите весь прикрепленный жир и соединительную ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при обращении с тканью, так как пораженные участки могут быть хрупкими и склонными к разрыву.
  3. Положите кишку на лист чистой белой бумаги для оптимального контраста. Визуально осмотрите ткани на наличие макроскопических признаков заболевания. Воспаление обычно локализуется в дистальном отделе 10 см тонкой кишки у мышей SHIP-/-.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые макроскопические особенности для оценки включают изменения цвета, при этом участки демонстрируют видимое покраснение или гиперемию по сравнению с соседними нормально выглядящими тканями. Кроме того, осмотрите ткани на предмет утолщения, так как пораженные участки могут казаться опухшими, отечными или ригидными при легкой пальпации. Обратите внимание на наличие крови, которая может проявляться в виде видимых геморрагических пятен, темно-красного обесцвечивания или прилипшей крови.
  4. Выровняйте кишечник рядом с линейкой для шкалы и сделайте фотографию, чтобы задокументировать грубые патологические находки.

3. Гистологическое исследование

  1. Удалите содержимое кишечника, осторожно промывая просвет с помощью шприца 1x PBS. Не прикладывайте слишком большого усилия к ткани, так как это может исказить ворсинки и архитектуру крипты.
  2. Определите и соберите примерно 1 см дистального отдела подвздошной кишки, который является наиболее репрезентативным для грубой патологии. Включите видимые пораженные участки, если таковые имеются. Для сравнения (SHIP+/+ и SHIP-/-) убедитесь, что ткани собраны из совпадающих анатомических мест.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для первоначальной оценки эффективности лечения рекомендуется подготовить подвздошную кишку в виде швейцарского рулона. Этот метод обеспечивает глобальную визуализацию заболевания и снижает систематическую ошибку выборки.
  3. Положите ткань на плоскую поверхность в гистологическую кассету, поместив ее между губками, чтобы предотвратить сворачивание.
  4. Для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и трихромным окрашиванием по Массону фиксируйте ткань в 10% нейтральном буферизованном формалине в течение ночи при температуре 4 °C, используя по меньшей мере в 10-20 раз больший объем ткани (около 5 мл на кассету) и гарантируя, что все кассеты полностью погружены в воду. Переведите кассеты на 70% этанол для хранения, сохраняя их полностью погруженными до обработки.
    Примечание: 10% формалин, фиксатор, содержащий 3,7% формальдегида, является мощным респираторным раздражителем, кожным сенсибилизатором и классифицируется как канцероген для человека. Вдыхание, проглатывание или контакт с кожей могут привести к острой токсичности, в то время как хроническое воздействие может увеличить риск развития рака. Все процедуры с использованием формалина должны выполняться в сертифицированном вытяжном шкафу для химических веществ с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, химически стойкие перчатки и средства защиты глаз. Собирайте отходы в контейнеры с четкой маркировкой «Отходы формалина» для надлежащей утилизации в соответствии с протоколами по опасным отходам учреждения. Все материалы, загрязненные формалином (например, наконечники для пипеток, салфетки, перчатки), должны быть обработаны как химически опасные отходы и утилизированы в соответствии с местными процедурами охраны здоровья и безопасности окружающей среды (EHS).
  5. Для окрашивания Alcian blue/PAS зафиксируйте ткань в растворе Карноя (60% этанола, 30% хлороформа и 10% ледяной уксусной кислоты) при температуре 4 °C на ночь, используя примерно 5 мл на кассету или в 10-20 раз больше объема ткани. Переведите кассеты на 100% этанол для хранения до переработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Карноя состоит из 60% этанола, 30% хлороформа и 10% ледяной уксусной кислоты. Эта смесь очень летучая, легковоспламеняющаяся и токсичная. Обрабатывайте раствор Carnoy исключительно в вытяжном шкафу и храните в плотно закрытых контейнерах вдали от источников тепла или возгорания. Отходы Carnoy должны собираться в специальные контейнеры для смешанных органических растворителей и утилизироваться в соответствии с руководящими принципами по опасным отходам учреждения. Все материалы, загрязненные раствором Карноя, должны быть обработаны как химически опасные отходы.
  6. Погрузите ткани в парафин и вырежьте срезы 5 мкм для окрашивания.
  7. Оцените окрашенные H&E срезы подвздошной кишки по 16-балльной шкале в соответствии с критериями, приведенными в таблице 1. Окончательная оценка гистологических повреждений определяется путем усреднения баллов 2 рецензентов, которые не обращали внимания на экспериментальное состояние.
  8. Оцените поперечные сечения Массона, окрашенные трихромом, с помощью 6-балльной шкалы на основе критериев, приведенных в таблице 2. Итоговая оценка фиброза рассчитывается как медиана баллов, присвоенных двумя независимыми рецензентами, не учитывающими условия эксперимента.

4. Оценка цитокинов

  1. После вскрытия и удаления гистологического образца соберите оставшуюся часть дистального отдела 10 см подвздошной кишки.
  2. Промокните ткань насухо и запишите вес. Мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C для дальнейшей обработки.
  3. Когда ткань будет готова к обработке, извлеките ее и всегда держите на льду.
  4. Взвесьте образцы тканей. Приготовьте достаточное количество гомогенизационного буфера для всех образцов, добавив ингибиторы протеазы к 1x PBS (апротинин и лейпептин, каждый в концентрации 10 мкг/мл). Используйте 10 мкл буфера на мг ткани (например, на 100 мг ткани требуется 1 мл буфера).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизационный буфер должен быть приготовлен свежим в день гомогенизации, чтобы обеспечить эффективность ингибиторов протеазы.
  5. Гомогенизируйте ткань подвздошной кишки на всю толщину в ледяном буфере для гомогенизации с помощью настольного гомогенизатора. Убедитесь, что гомогенат однороден и не содержит видимых фрагментов ткани. Тщательно промойте наконечник гомогенизатора PBS между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
  6. Центрифугируйте гомогенаты тканей при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  7. Аликвотируйте осветленные надосадочные жидкости, чтобы избежать циклов замерзания-оттаивания, и храните при температуре -80 °C для будущего анализа.
  8. Проведите иммуноферментный анализ (ИФА) на осветленных надосадочных зонтах для количественного определения интересующих цитокинов в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая плотность на длине волны 450 нм измерялась с помощью микропланшетного ридера Varioskan LUX с программным обеспечением Skanlt RE 7.0.2 с опорной длиной волны 570 нм для коррекции. Для анализа данных использовался Microsoft Excel, а значения поглощения в линейном диапазоне стандартной кривой были интерполированы для определения концентраций цитокинов.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышам SHIP+/+ и SHIP-/- в возрасте 6 недель перорально вводили 0,5% β-циклодекстрина (контроль; n = 6/генотип) или 3 мг/кг дексаметазона (n = 6/генотип) ежедневно в течение 2 недель. Сроки и продолжительность лечения зависят от модели и должны учитывать начало и скорость прогрессирования заболевания, а также то, является ли вмешательство профилактическим или терапевтическим. В экспериментах следует использовать равное количество самцов и самок мышей. Несмотря на то, что мы не выявили различий по признаку пола в естественном течении заболевания у мышей SHIP-/-, различные протоколы лечения могут показывать специфические для пола реакции. В этой модели профилактическое лечение в возрасте 4-6 недель может быть использовано для предотвращения возникновения воспаления и фиброза, в то время как терапевтические схемы, выполняемые в возрасте 6-8, 8-10 или 6-10 недель, могут быть использованы для оценки эффективности лечения установленного заболевания. При выборе оптимального дозирования и времени следует руководствоваться литературой и исследованиями по титрованию. Ранее мы показали, что этот режим дозирования дексаметазона эффективен при введении после развития воспаления подвздошной кишки.

Рекомендуемый график для дня сбора урожая представлен на рисунке 1A. Дексаметазон не вызывал какой-либо патологии кишечника у мышей SHIP+/+ на основании общего обследования. У мышей SHIP-/- наблюдались видимые участки покраснения и утолщения, указывающие на воспаление. Эти грубые патологические признаки отсутствовали у мышей SHIP-/-, получавших дексаметазон (рисунок 1B). Для оценки барьерной функции кишечника измеряли концентрации ФИТК-декстрана в плазме крови после перорального зондирования. Несмотря на то, что SHIP-/- мыши не были статистически значимыми, у них были повышенные концентрации FITC-декстрана в плазме крови по сравнению с контрольной группой SHIP+/+, что свидетельствует о повышенной проницаемости кишечника. Лечение дексаметазоном снизило концентрацию FITC-декстрана у мышей SHIP-/- до концентраций, аналогичных тем, которые наблюдались у мышей SHIP+/+ (рис. 1C).

Гистологическое исследование поперечных срезов кишечника мышей SHIP-/- выявило характерные патологические особенности, включая инфильтрацию иммунных клеток, нарушение архитектуры ворсинок-крипты, гиперплазию/гипертрофию бокаловидных клеток и утолщение мышечного слоя (рис. 2A). Эти характеристики отразились в значительно более высоких показателях гистологических повреждений по сравнению с мышами SHIP+/+ (p = 0,0005, рисунок 2B). У мышей SHIP+/+, получавших дексаметазон, гистологическое повреждение не наблюдалось. В соответствии с улучшениями, наблюдаемыми в общей патологии и барьерной функции, дексаметазон снижал гистопатологию у мышей SHIP-/-, хотя эффект не был статистически значимым (p = 0,0981, рисунок 2A и рисунок 2B). Трихромное окрашивание Массона выявило значительное отложение коллагена в тканях кишечника SHIP-/-, сопровождающееся значительно более высокими показателями фиброза по сравнению с контрольной группой SHIP+/+ (рис. 2C). Дексаметазон эффективно ослаблял фиброзные признаки у мышей SHIP-/-, снижая показатели фиброза до значений, сопоставимых с контрольной группой SHIP+/+ (рис. 2C). Кроме того, окрашивание Alcian blue/PAS подтвердило гиперплазию/гипертрофию бокаловидных клеток у мышей SHIP-/-, которая была уменьшена после лечения дексаметазоном (рис. 2D).

Для оценки концентрации воспалительных цитокинов ИФА проводили ИФА на гомогенатах подвздошной ткани полной толщины (рис. 3A). Концентрации IL-1β были значительно выше у мышей SHIP-/- по сравнению с контрольной группой SHIP+/+ (p = 0,0468), что согласуется с предыдущими результатами, коррелирующими экспрессию IL-1β с тяжестью заболевания в этой модели. Лечение дексаметазоном значительно снижало концентрацию IL-1β у мышей SHIP-/- (p = 0,0023). В соответствии с предыдущими отчетами, концентрации IL-6 или TNF не различались в четырех экспериментальных группах. Мы также измерили концентрации нейтрофиль-ассоциированных белков миелопероксидазы (МПО) и липокалина-2 (LCN-2) в гомогенатах подвздошной кишки полной толщины в качестве дополнительных биохимических маркеров воспаления (рис. 3B). Концентрации как MPO, так и LCN-2 были значительно выше (p = 0,0031 и p = 0,0002 соответственно) у мышей SHIP-/- по сравнению с контрольной группой SHIP+/+, хотя увеличение LCN-2 было в значительной степени обусловлено высокими концентрациями, измеренными у 2 из 6 мышей. Лечение дексаметазоном снижало МПО и незначительно снижало LCN-2, различия не были значимыми. Эти данные свидетельствуют о том, что МПО является полезным маркером воспаления у мышей SHIP-/-, в то время как концентрации LCN-2 не столь стабильны и надежны.

Чтобы исследовать взаимосвязь между воспалительными и фиброзными признаками в мышиной модели SHIP-/-, мы провели корреляционный анализ по методу Спирмана с использованием оценок гистологических повреждений, показателей фиброза и концентраций IL-1β из полнослойной подвздошной ткани (рис. 4). Концентрации IL-1β положительно коррелировали с показателями гистологических повреждений (r = 0,6813), что указывает на то, что усиление воспаления было связано с увеличением повреждения тканей (рис. 4A). Также наблюдалась умеренная корреляция между концентрациями IL-1β и показателями фиброза (r = 0,4117), что свидетельствует о связи между воспалительной продукцией цитокинов и фиброзным ремоделированием (рис. 4B). Кроме того, оценки гистологических повреждений в значительной степени коррелировали с показателями фиброза (r = 0,6241), что позволяет предположить, что структурные повреждения и фиброз прогрессируют параллельно у мышей SHIP-/- (рис. 4C).

figure-results-1
Рисунок 1: Дексаметазон снижает грубую кишечную патологию и проницаемость у мышей SHIP-/-. Мышам SHIP+/+ и SHIP-/- ежедневно перорально вводили либо 0,5% β-циклодекстрина в качестве контрольного средства (VC), либо дексаметазон (Dex; 3 мг/кг) в возрасте от 6 до 8 недель. (A) Рекомендуемый график эксперимента. (B) Была оценена общая морфология слепой кишки и дистального отдела подвздошной кишки, и показаны репрезентативные изображения (n = 4-6 мышей в группе). Звездочками обозначены участки пятнистой покраснения и утолщения, наблюдаемые при грубом осмотре. Изображения предназначены для того, чтобы служить репрезентативными примерами общей патологии и не предназначены для количественного анализа. (C) Для оценки проницаемости кишечника мышей голодали в течение 4 ч и вводили 80 мг/мл FITC-декстрана. После дополнительных 4 часов натощак кровь собирали с помощью пункции сердца и измеряли концентрацию FITC-декстрана в плазме. Данные представлены в виде среднего SD±SD. Серая полоса представляет собой диапазон концентраций FITC-декстрана в плазме, обычно наблюдаемых у здоровых мышей C57BL/6 через четыре часа после зонда25. Статистическая значимость определялась с помощью критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Дексаметазон снижает показатели гистологических повреждений, уровень коллагена, толщину мышц, а также гиперплазию и гипертрофию бокаловидных клеток в дистальном отделе подвздошной кишки мышей SHIP-/-. Мышам SHIP+/+ и SHIP-/- ежедневно перорально вводили либо 0,5% β-циклодекстрина в качестве контрольного средства (VC), либо дексаметазон (Dex; 3 мг/кг) в возрасте от 6 до 8 недель. (A) Окрашенные H&E поперечные срезы подвздошной кишки мышей были сфотографированы с 10-кратным увеличением; масштабные полосы = 200 мкм. (B) Оценки гистологических повреждений для мышей SHIP+/+ и SHIP-/- выражены как медиана ± IQR. (C) Несъемные поперечные срезы подвздошной кишки окрашивали трихромом Массона для лечения фиброза; Коллаген окрашен в синий цвет. Изображения были сделаны с 10-кратным увеличением; масштабные линейки = 200 μм. Показатели фиброза у мышей SHIP+/+ и SHIP-/- выражались как медиана ± IQR. (D) Неподвижные поперечные срезы подвздошной кишки были окрашены альцианским синим/PAS. Изображения были сфотографированы с увеличением 10×; масштабные линейки = 200 μм. Все секции репрезентативны из числа n = 6 мышей в группе (кроме SHIP+/+ Dex и SHIP-/- Dex, n = 5). Статистическая значимость оценки гистологических повреждений была определена с помощью теста Краскела-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Дексаметазон снижает концентрацию IL-1β в гомогенатах подвздошной кишки полной толщины мышей SHIP-/-. Мышам SHIP+/+ и SHIP-/- ежедневно перорально вводили либо 0,5% β-циклодекстрина в качестве контрольного средства (VC), либо дексаметазон (Dex; 3 мг/кг) в возрасте от 6 до 8 недель. (A) Концентрации IL-1β, TNF и IL-6 были измерены в гомогенатах подвздошной кишки полной толщины. (B) Концентрации миелопероксидазы (МПО) и липокалина-2 (LCN-2) определяли в гомогенатах подвздошной ткани на всю толщину. Данные представлены в виде среднего ± SD. Статистический анализ проводился с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Концентрации IL-1β положительно коррелируют с гистологическими повреждениями, а фиброз и фиброз коррелируют с оценкой гистологических повреждений у мышей SHIP-/-. Корреляционный анализ Спирмена был проведен для оценки взаимосвязи между оценкой гистологических повреждений, оценкой фиброза и концентрациями IL-1β в полнотолщинной подвздошной ткани мышей SHIP-/-. Наблюдалась значимая положительная корреляция между (A) оценкой гистологических повреждений и концентрациями IL-1β (r = 0,6813), (B) оценкой фиброза и концентрациями IL-1β (r = 0,4117), а также (C) оценкой гистологических повреждений и оценкой фиброза (r = 0,6241). Каждая точка данных представляет отдельную мышь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Компонент уронаСчёт
Потеря архитектуры крипты0 = нет
1 = <25% потерь
2 = 25-50% потерь
3 = 50-75% потерь
4 = >75% потерь
Инфильтрация иммунных клеток0 = нет
1 = случайные иммунные клетки in lamina propria
2 = увеличение количества иммунных клеток в собственной пластинке
3 = сливающиеся иммунные клетки в собственной пластинке и прорывающейся слизистой оболочке
4 = инфильтрация иммунных клеток по всему разрезу
Бокаловидная гиперплазия и гипертрофия0 = нет
1 = увеличение количества и размера бокаловидных ячеек на <50%
2 = увеличение количества и размера бокаловидных ячеек на >50%
Изъязвление0 = нет
1 = промежуточное изъязвление
2 = значительное изъязвление
Отёк0 = нет
1 = <50% сечения
2 = >50% сечения
Утолщение мышц0 = нет
1 = промежуточное сгущение
2 = значительное утолщение

Таблица 1: Оценка гистологических повреждений. Гистологическое повреждение поперечных срезов подвздошной кишки у мышей SHIP+/+ и SHIP-/- с окрашиванием H&E оценивается на основе ключевых особенностей илеита, характеризующих мышиную модель SHIP-/-, включая потерю архитектуры (0-4), инфильтрацию иммунных клеток (0-4), гиперплазию и гипертрофию бокаловидных клеток (0-2), изъязвления (0-2), отек (0-2) и утолщение мышц (0-2).

Компонент фиброзаСчёт
Избыток коллагена0 = Нормальная архитектура; без избытка коллагена
1 = Умеренное увеличение коллагена; ограничивается подслизистой оболочкой или субсерозой
2 = Умеренное расширение коллагена в подслизистую оболочку и частичную собственную мускулатуру с дезорганизованными пучками
3 = Обширный, плотный коллаген, замещающий нормальную структуру, включающий подслизистую оболочку и мышцы (трансмуральный)
Фиброзно-мышечная гиперплазия/мускуляризация/мышечная облитерация подслизистой оболочки0 = Нет, нормальное содержание подслизистой оболочки мышц
1 = Умеренное увеличение мышечной массы
2 = Большое количество мышц в подслизистой оболочке, влияет на морфологию, но нормальную структуру
3= Мышца уничтожила все подслизистое пространство

Таблица 2: Оценка фиброза. Фиброз на срезах подвздошной кишки у мышей SHIP+/+ и SHIP-/- окрашенных трихромом Массона оценивали на основе ключевых особенностей фиброза кишечника, наблюдаемых в модели SHIP-/-, включая чрезмерное отложение коллагена (0-3) и фиброзно-мышечную гиперплазию или мышечную облитерацию подслизистой оболочки (0-3). Коллаген оценивается по степени и архитектурным нарушениям, в то время как мышечные изменения оцениваются на основе степени инфильтрации мышц и деформации подслизистой структуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описаны процедуры оценки илеита и фиброза кишечника у мышей SHIP-/-, мышиной модели CD-подобного воспаления кишечника с сопутствующей фиброзной патологией. Мышиная модель SHIP-/- повторяет особенности БК, которые обычно не наблюдаются в других мышиных моделях воспаления кишечника, в частности, локализацию подвздошной кишки, очаговое и трансмуральное воспаление и фиброзную патологию19,26. В сочетании с простотой разведения и коротким временем до проявления заболевания, модель SHIP-/- хорошо позиционируется как мощный инструмент для трансляционных исследований при CD19.

В этом исследовании статистическая значимость анализа FITC-декстрана и гистологической оценки оценивалась с помощью критерия Краскела-Уоллиса, поскольку эти наборы данных не соответствовали предположениям о нормальности, необходимым для одностороннего ANOVA, а гистологические оценки представляют собой прерывистые, непараметрические переменные. Несмотря на то, что наш анализ не выявил статистически значимых различий между группами, получавшими дексаметазон, и группами, получавшими носитель, мы наблюдали четкие тенденции. Дексаметазон снижал кишечную проницаемость и гистопатологию мышей SHIP-/-, и эти эффекты могли достичь значимости при больших размерах выборки.

При выполнении этого протокола может возникнуть ряд технических проблем. Что касается работы с тканями, то подвздошная кишка SHIP-/- требует бережных манипуляций во время диссекции, так как она склонна к разрыву. Это особенно важно при подготовке тканей к грубой визуализации. Фиксация тканей является еще одним важным фактором для гистологического анализа. Фиксированная формалином ткань подходит как для H&E, так и для трихромного окрашивания по Массону, но несовместима с окрашиванием Alcian Blue/PAS. Напротив, несъемная ткань Карноя подходит для окрашивания H&E и Alcian Blue/PAS, но не для трихрома Массона. Фиксация Карноя приводит к интенсивному и диффузному окрашиванию темно-синим цветом, которое затемняет визуализацию коллагена и мышечного слоя. Для анализа цитокинов необходимо обрабатывать образцы на льду, так как цитокины очень чувствительны к деградации. Крайне важно, чтобы осветленные тканевые гомогенаты были аликвотированы сразу после обработки. Повторяющиеся циклы замораживания-размораживания могут существенно нарушить целостность цитокинов и подорвать любые потенциальные различия между генотипами и/или группами лечения. Наконец, чтобы обеспечить точную количественную оценку, мы рекомендуем выполнять многократное разведение каждого образца, чтобы подтвердить, что показания находятся в пределах линейного диапазона стандартной кривой анализа, и свести к минимуму потенциальное вмешательство со стороны сложного тканевого матрикса. Решение этих технических вопросов имеет важное значение для получения воспроизводимых и интерпретируемых результатов, но биологическая изменчивость, присущая мышам SHIP-/- мышей, также должна быть тщательно изучена.

Существует несколько критических аспектов мышей SHIP-/-, которые также следует принимать во внимание и тщательно контролировать, чтобы обеспечить воспроизводимость и свести к минимуму смешивающие переменные. Микробиом кишечника оказывает глубокое влияние на развитие заболевания и терапевтические реакции в моделях ВЗК у мышей27,28. Наша предыдущая работа показала, что воспаление кишечника у мышей SHIP-/- зависит от микробиоты и может быть улучшено с помощьюантибиотиков. Таким образом, для снижения вариабельности, обусловленной микробиомом, следует использовать контроль однопометников, а группы обработки должны быть сбалансированы для происхождения клеток30. Кроме того, важен тщательный подбор пола. Несмотря на то, что у мышей SHIP-/- не наблюдалось различий по признаку пола в пенетрантности или тяжести заболевания, другие модели илеита, такие как SAMP1/YitFc, демонстрируют более раннее начало и повышенную тяжесть заболевания у самок 14,31. Поскольку половые гормоны также могут модулировать микробный состав32, соответствие пола имеет решающее значение для минимизации потенциальных искажающих факторов в исследованиях лечения. Кроме того, оцениваемые отдельные методы лечения могут иметь различную эффективность у самцов и самок мышей. Хотя наши текущие результаты не выявляют различий в заболевании или терапевтическом ответе на дексаметазон, сопоставление пола должно проводиться во всех исследованиях лечения.

В дополнение к соображениям микробиома и пола, описанным выше, важно включить мышей SHIP+/+ в исследования лечения для оценки эффектов носителя и терапевтических агентов при отсутствии воспаления кишечника. Это гарантирует, что ни препарат, ни способ его доставки не вызывают и не способствуют патологии в здоровом кишечнике, тем самым улучшая интерпретацию терапевтической эффективности и безопасности.

Время проведения лечебного вмешательства также имеет важное значение и должно быть изменено в соответствии с экспериментальными целями, поскольку существуют значительные различия как в воспалении, так и в фиброзе у мышей в возрасте 4, 8 и 12 недель в возрасте19,26 лет. У мышей SHIP-/- воспаление кишечника развивается уже в возрасте 4 недель, причем у всех мышей воспаление проявляется к 6 неделям, а маркеры фиброзной патологии могут быть измерены уже в возрасте 6 недель и хорошо устанавливаются к 8 неделям в возрасте19,26 лет. Таким образом, лечение, направленное на воспаление подвздошной кишки, должно начинаться в возрасте 6 недель. Антифиброзные вмешательства могут быть начаты профилактически через 6 недель или терапевтически через 8-10 недель. Тем не менее, начало и тяжесть заболевания могут варьироваться в зависимости от микробной среды, которая различается в зависимости от учреждения. Исследователи должны сначала определить кинетику заболевания в своей колонии, прежде чем внедрять протоколы лечения. Кроме того, у мышей SHIP-/- может наблюдаться снижение веса до 17% к 4-5 неделям, а к 8-10 неделям33 - еще на 5%. Животные, демонстрирующие значительную потерю веса, должны быть исключены из исследований, так как это отражает тяжелое проявление заболевания и может ухудшить результаты лечения, связанные с кишечной патологией.

Важным фактором при анализе прогрессирования заболевания в модели SHIP-/- является выбор соответствующих маркеров воспаления. Основываясь на нашем обширном опыте работы с мышами SHIP-/-, профилирование цитокинов обычно сосредоточено на конкретных медиаторах, таких как IL-1β, который, как известно, активируется во время прогрессирования заболевания. Тем не менее, для первоначальной характеристики воспалительных реакций или при оценке новых терапевтических стратегий рекомендуется проводить мультиплексный анализ цитокинов. Такой непредвзятый подход позволяет более широко профилировать воспалительную среду и может выявить неожиданные мишени, имеющие отношение к патогенезу заболевания или ответу на лечение.

Модель мыши SHIP-/- обладает практическими преимуществами, обеспечивающими воспроизводимость и эффективность. У мышей SHIP-/- развивается спонтанное и последовательное воспаление подвздошной кишки и фиброз без необходимости использования экзогенных триггеров. Это устраняет вариабельность, связанную с приготовлением реагентов и нестандартизированными протоколами дозирования при индуцировании воспаления кишечника. Заболевание начинается быстро, воспаление становится очевидным к 4-6 неделям, а фиброз — к 8 неделям, что делает модель эффективной как с точки зрения времени, так и с точки зрения затрат. Кроме того, мышей SHIP-/- легко разводить и содержать, генотипирование не вызывает сложностей, и не требуется никаких специализированных стратегий разведения. Это упрощает управление колонией, снижает техническую нагрузку и снижает риск внесения непреднамеренной генетической изменчивости 19,21,26. Заболевание можно надежно оценить с помощью широко доступных методов в большинстве исследовательских учреждений, включая анализ FITC-декстрана, H&E и трихромное окрашивание по Массону, а также ИФА. Эти комбинированные функции способствуют эффективному планированию исследований, снижению финансовых и технических барьеров и согласованному сбору данных между лабораториями.

В то время как модель SHIP-/- обладает уникальными преимуществами, модель также имеет ограничения. Как и все доклинические модели, она не может полностью воспроизвести сложную, многофакторную природу ВЗК человека, на которую влияют генетические, иммунные факторыи факторы окружающей среды. Модели DSS и TNBS остаются широко популярными благодаря своей простоте и экономичности. В сочетании с генетическими модификациями эти химические модели могут служить эффективными инструментами для понимания специфического вклада геновв барьерную функцию. Тем не менее, их основная польза заключается в моделировании острого повреждения эпителия; они не в состоянии охватить хроническую иммуноопосредованную патологию, характеризующую БК, и механизм повреждения эпителия, вызванного химическими агентами, которые не имеют прямого клиническогозначения. Исключительная зависимость от одной модели может привести к неполной и/или вводящей в заблуждение оценке терапевтического потенциала, поэтому рекомендуется использовать несколько моделей, чтобы убедиться в эффективности лечения.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается Учреждением по уходу за животными в Научно-исследовательском институте детской больницы Британской Колумбии и финансированием Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады через Канадскую сеть гликомики (GlycoNet, Сеть центров передового опыта) и Канадские институты исследований в области здравоохранения (MOP-133607-LS). К.С. и В.М. являются получателями докторских стипендий TRIANGLE (программа TRaIning a New generation of Researchers in Gastroenterology and LivEr).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,7 мл Snap Cap Microtube ДиамедSPE155-N
1x DPBS (без хлорида кальция, без хлорида магния)GibcoССЫЛКИ 14190-144
25G x figure-materials-1” иглы BDССЫЛКА 305122Для кардиологической пункции
26G x figure-materials-2” ИглыBDССЫЛКА 305110Промывка кишечника
Уксусная кислотаСигма-ОлдричA6283Гистология
Кислотный раствор цитратной декстрозы (38 мМ лимонной кислоты, 107 мМ цитра натрия, 136 мМ декстрозы)Миллипор СигмаC3821
Игла для кормления животных, нестерильная, многоразовая, тип 304SSMillipore Sigma CAD7900 Для гаважа<бр/> Прямо<брит/> Размер: 24G,
Lxdiam. 1 дюйм. x 1,25 мм, шар
АпротининCayman Chemical9087-70-1Буфер гомогенизации
BD Luer-Lok Шприц стерильный, одноразовый, 5 млBDССЫЛКА 309646Промывка кишечника
BD OptEIA Мышь IL-6 ELISA комплектBD Biosciences555240
BD OptEIA Mouse TNF ELISA Set IIBD Biosciences558534
BD® Шприц Luer Slip Tip стерильный, одноразовый, 1 млBDССЫЛКА 309659
Квадратные биопсийные пенопластовые подушечки, 30,2 x 25,4 x 2 мм H.Simport ScientificССЫЛКА M476-1Гистология
Буферизованный формальд-фреш (низкий запах 10% формалина)Фишер КемикалSF93-4Гистология
Прозрачные плоскодонные иммунно-нестерильные пластины с 96 лункамиThermo Scientific439454
Eppendorf 5415R Рефрижераторный центрифуга Marshall ScientificEP-5415R
Безводный этиловый спиртGreenfield GlobalP016EAANГистология
Кассета Fisherbrand TRU-FLOWFisher Scientific15-200-403Гистология
FITC-декстран, 3-5 кДа (1 г)Миллипор СигмаFD4-1G
CAS номер: 60842-46-8
ЛеупептинМиллипор Сигма103476-89-7Буфер гомогенизации
Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA R& D SystemsDY401
Многоэкранная пластина на 96 лунок и твёрдое дноМиллипор СигмаMSSWNFX40Белый, нестерильный, не обработанный
Хлороформ OmniPurМиллипор Сигма3150Гистология
Гомогенизатор Polytron PT-MR2100Kinematica AG632081
Varioskan Lux Multimode Microplate ReaderThermo ScientificVL0L00D0

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, B., Gardet, A., Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 474 (7351), 307-317 (2011).
  2. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  3. Wang, R., Li, Z., Liu, S., Zhang, D. Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019. BMJ Open. 13 (1), e065186(2023).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Guan, Q. A comprehensive review and update on the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Immunol Res. 2019, 7247238(2019).
  6. Chang, J. T. Pathophysiology of inflammatory bowel diseases. N Engl J Med. 383 (27), 2652-2664 (2020).
  7. Graham, D. B., Xavier, R. J. Pathway paradigms revealed from the genetics of inflammatory bowel disease. Nature. 578 (7796), 527-539 (2020).
  8. Li, J., et al. Pathogenesis of fibrostenosing Crohn's disease. Transl Res. 209, 39-54 (2019).
  9. Rieder, F., Mukherjee, P. K., Massey, W. J., Wang, Y., Fiocchi, C. Fibrosis in IBD: from pathogenesis to therapeutic targets. Gut. 73 (5), 854-866 (2024).
  10. D'Alessio, S., et al. Revisiting fibrosis in inflammatory bowel disease: the gut thickens. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 169-184 (2022).
  11. Louis, E., et al. Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease. Gut. 49 (6), 777-782 (2001).
  12. Iliopoulou, L., Kollias, G. Harnessing murine models of Crohn's disease ileitis to advance concepts of pathophysiology and treatment. Mucosal Immunol. 15 (1), 10-26 (2022).
  13. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124 (4), 972-982 (2003).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  16. Steiner, C. A., et al. The TNFΔARE mouse as a model of intestinal fibrosis. Am J Pathol. 193 (8), 1013-1028 (2023).
  17. Li, J., et al. Mouse models of intestinal fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 385-403 (2021).
  18. Pauls, S. D., Marshall, A. J. Regulation of immune cell signaling by SHIP1: a phosphatase, scaffold protein, and potential therapeutic target. Eur J Immunol. 47 (6), 932-945 (2017).
  19. McLarren, K. W., et al. SHIP-deficient mice develop spontaneous intestinal inflammation and arginase-dependent fibrosis. Am J Pathol. 179 (1), 180-188 (2011).
  20. Kerr, W. G., Park, M. Y., Maubert, M., Engelman, R. W. SHIP deficiency causes Crohn's disease-like ileitis. Gut. 60 (2), 177-188 (2011).
  21. Ngoh, E. N., et al. Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 150 (2), 465-476 (2016).
  22. Fernandes, S., et al. SHIP1 deficiency in inflammatory bowel disease is associated with severe Crohn's disease and peripheral T cell reduction. Front Immunol. 9, 9(2018).
  23. Ma, W. J., et al. Bespoke plant glycoconjugates for gut microbiota-mediated drug targeting. Science. 388 (6706), 1410-1416 (2025).
  24. Park, M. Y., et al. Impaired T-cell survival promotes mucosal inflammatory disease in SHIP1-deficient mice. Mucosal Immunol. 7 (6), 1429-1439 (2014).
  25. Tsai, K., et al. Highly sensitive, flow cytometry-based measurement of intestinal permeability in models of experimental colitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 425-438 (2023).
  26. Lo, Y., Sauve, J. P., Menzies, S. C., Steiner, T. S., Sly, L. M. Phosphatidylinositol 3-kinase p110δ drives intestinal fibrosis in SHIP deficiency. Mucosal Immunol. 12 (5), 1187-1200 (2019).
  27. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66 (11), 5224-5231 (1998).
  28. Taurog, J. D., et al. The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J Exp Med. 180 (6), 2359-2364 (1994).
  29. Dobranowski, P. A., Tang, C., Sauvé, J. P., Menzies, S. C., Sly, L. M. Compositional changes to the ileal microbiome precede the onset of spontaneous ileitis in SHIP-deficient mice. Gut Microbes. 10 (5), 578-598 (2019).
  30. Robertson, S. J., et al. Comparison of co-housing and littermate methods for microbiota standardization in mouse models. Cell Rep. 27 (6), 1910-1919.e2 (2019).
  31. Goodman, W. A., et al. Loss of estrogen-mediated immunoprotection underlies female gender bias in experimental Crohn's-like ileitis. Mucosal Immunol. 7 (5), 1255-1265 (2014).
  32. Org, E., et al. Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice. Gut Microbes. 7 (4), 313-322 (2016).
  33. Helgason, C. D., et al. Targeted disruption of SHIP leads to hemopoietic perturbations, lung pathology, and a shortened life span. Genes Dev. 12 (11), 1610-1620 (1998).
  34. Boyapati, R., Satsangi, J., Ho, G. T. Pathogenesis of Crohn's disease. F1000Prime Rep. 7, 44(2015).
  35. Mizoguchi, E., Low, D., Ezaki, Y., Okada, T. Recent updates on the basic mechanisms and pathogenesis of inflammatory bowel diseases in experimental animal models. Intest Res. 18 (2), 151-167 (2020).
  36. Koboziev, I., Karlsson, F., Zhang, S., Grisham, M. B. Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies. Inflamm Bowel Dis. 17 (6), 1229-1245 (2011).
  37. Raftery, A. L., Pattaroni, C., Harris, N. L., Tsantikos, E., Hibbs, M. L. Environmental and inflammatory factors influencing concurrent gut and lung inflammation. Inflamm Res. 73 (12), 2123-2139 (2024).
  38. Maxwell, M. J., et al. Genetic segregation of inflammatory lung disease and autoimmune disease severity in SHIP-1-/- mice. J Immunol. 186 (12), 7164-7175 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SHIPFITC

Похожие статьи