Модель мыши для микроваскулярной эмболии для двухфотонной микроскопии in vivo с использованием флуоресцентных полистироловых микросфер

Краткое содержание

Этот протокол содержит подробное описание пошагового подхода к модели мыши с хроническим окном черепа и микроваскулярной эмболии, оптимизированной для in vivo двухфотонной микроскопии с использованием флуоресцентных полистироловых микросфер.

Аннотация

Микроваскулярные окклюзии в мозге относительно распространены, но остаются в значительной степени недостаточно изученными. Частота событий, долгосрочные последствия и потенциальные механизмы очистки в целом неизвестны. Современные модели, используемые для изучения этих событий, такие как фототромбоз и инъекции микроэмболов, имеют свои преимущества и ограничения. В этом исследовании был разработан подробный протокол, сочетающий приготовление хронического черепного окна с индукцией микрососудистых эмболий мозга через внутриартериальную инъекцию микросфер у мышей. Такая система позволяет проводить долгосрочную in vivo визуализацию микрососудистых органов и микроокклюзии с помощью двухфотонной микроскопии. Микросферы доставляются через катетер, установленный во внешней сонной артерии (ЭКА), который постоянно связывается. Важно, что общая сонная артерия (CCA) и внутренняя сонная артерия (ICA) остаются целыми на протяжении всей процедуры и после процедуры, что минимизирует нарушения кровотока в мозге. Для облегчения немедленной in vivo визуализации и предотвращения кластеризации микросфер или адгезии к концам пипетки и катетеру микросферы суспендированы в смеси FITC-Dexn и 0,1% Tween 20. Техника инъекции была подтверждена с помощью посмертной 3D-визуализации in situ для определения распределения микросфер. Это исследование дополнительно демонстрирует его полезность на примере in vivo двухфотонной микроскопии. Этот подход обеспечивает последовательный и надёжный метод для индуцирования и изучения микрососудистых эмболий, позволяя изучать их динамику воздействия и клиренса с помощью высококачественной in vivo визуализации.

Введение

Ишемический инсульт, вызванный эмболией крупной церебральной артерии, — это острое и часто разрушительное^{событие 1}. Эмболии также могут возникать в более дистальных сосудах. В результате могут развиваться тихие мозговые инфаркты (СБИ); Как следует из названия, они остаются бессимптомными и обычно обнаруживаются случайно во время обследования по не связанным^{причинам 2,3}. СБИ распространены и входят в число наиболее часто наблюдаемых цереброваскулярных состояний при вскрытиях пожилых^{людей 4,5}. Эпидемиологические исследования показали 20% распространённости среди людей без истории инсульта. СБИ способствуют когнитивной дисфункции и деменции, увеличивают общую смертность и являются фактором риска будущего^{инсульта 6,7,8}. Инфаркты обычно имеют всего несколько миллиметров в диаметре и связаны с окклюзией проникающих артерий диаметром примерно 100 мкм. Эти проникающие породы дают начало обширному артериальному и капиллярному слою. Небольшой микротромб, проходящий через проникающие артерии и задерживающийся в нижней микроциркуляции, скорее всего, останется незаметным на^{ангиографии 9}. Тем не менее, многие микротромбы могут выделяться в фибрилляции предсердий, атеросклеротических бляшках, а также из других^{источников — 10, 11, 12, 13, 14}. Помимо микротромбов, другие микрочастицы (МП), включая жировые частицы, клеточные агрегаты и даже микропластик, могут вызывать микроваскулярные эмболии. Несколько исследований показывают наличие пластического MP в крови и мозге, который превышает диаметр капилляра 5 мкм^15,16.

Микроваскулярные окклюзии остаются относительно недостаточно изученными по сравнению с острым инсультом и СБИ. Мало что известно о частоте событий, долгосрочных последствиях и возможных механизмах очистки. Тем не менее, интерес быстро растёт после успешного клинического внедрения механической тромбэктомии при инсульте, когда микрососудистые эмболии могут привести к нарушению микрососудистой реперфузии после, казалось бы, успешной реканализации крупной виновной^{артерии 17}. Кроме того, наблюдается всплеск исследований микропластика, что, возможно, частично влияет на микроваскулярную^{эмболию} 18,19,20.

Микроваскулярные окклюзии в коре мыши можно изучать, среди прочего, с помощью мультифотонной микроскопии с использованием окна черепа. Наиболее часто используемые модели для изучения микроваскулярных окклюзий мозга — это фототромботическая и микросферная модели. Фототромботическая модель использует светочувствительные красители для индуцирования эмболий в отдельных сосудах (обычно некапиллярных) посредством фотоактивации. Однако эта модель не позволяет изучать эмболии на более длительном протяжении из-за активации фибринолитической системы, которая растворяет^{эмболию 21,22}. Кроме того, активация светочувствительного красителя образует синглетные кислородные формы, вызывая повреждение эндотелиального и гематоэнцефалического барьера (BBB^{) 23}. Для исследований эндотелиальной и BBB функции при церебральных эмболиях, а также долгосрочных эффектов на церебральное кровообращение и функцию мозга, поэтому предпочтительнее модель микросферы. Модель инъекции в микросферу использует микросферы, вводящиеся в церебральное кровообращение, для окклюзии микроваскулаторы головного^мозга 9,24,25,26,27,28,29,30. Возможный недостаток этой модели заключается в том, что невозможно предопределить местоположение эмболий, в отличие от фототромботического^{метода 31,32}. Преимущество в том, что микросферы с чётко определённым диаметром могут быть введены, тем самым нацеливаясь на (микро-) сосуды с определёнными^{диаметрами 33, 34, 35}.

За годы было разработано множество подходов для введения микросфер в церебральное кровообращение грызунов. Эти протоколы достигают консенсуса при обращении к сонному треугольнику, состоящему из общей сонной артерии (CCA), внутренней сонной артерии (ICA) и наружной сонной артерии (ECA) для инъекции внутриартериальной микросферы. Метод инъекции внутриартериальной микросферы различается между протоколами несколькими параметрами. Во-первых, в исследованиях использовался либо^{шприц 9, 26, 27, 29, 33, 34}, либо катетер^{25, 28, 30, 36}. Во-вторых, существует значительное разнообразие в количестве и размере вводных микросфер. Диаметры микросферы обычно варьируются от 10 до 50 мкм, при этом выбор зависит от размера целевого сосуда. Как правило, чем больше микросферы, тем ниже нужно вводить число один, так как артериолов меньше, чем капилляров 25,26,30.

Достижение регулярного внутриартериального микросферного ввода остаётся сложным. На практике вводится большое количество микросфер, но лишь малая часть достигает церебрального кровообращения. Это особенно проблематично для изучения влияния застрявших микросфер с помощью in vivo двухфотонной микроскопии, поскольку успех этого метода зависит от наличия микросфер во внешних слоях коры мыши в виде через подготовленное окно черепа. Выбор подходящих флуоресцентных красителей для микросфер критически важен, поскольку их сочетание с трансгенными моделями мышей и внутрисосудистым окрашиванием может быть сложно из-за интенсивной флуоресценции микросфер и перекрывающихся эмиссионных спектров.

Микроваскулярные окклюзии изучаются в моделях грызунов, а синергетические эффекты множественных микросфер ранее были продемонстрированы в экс-виво мозгах^{грызунов,} а также при видимом экстравазировании таких частиц — процессе, называемом^{ангиофагия} 33,35,37,38. Для их исследования in vivo были разработаны методы многофотонной микроскопии у мышей с краниальными окнами. Цель текущего исследования — разработать и представить подробный протокол внутриартериальной инъекции микросфер мышам, который оптимизирует изучение их влияния на мозговую ткань и их судьбу. Главное преимущество этого протокола — повышенная эффективность доставки, минимизация потери микросферы и увеличение вероятности их присутствия в области средней церебральной артерии (MCA) в области изображения окна черепа. Оптимизированный протокол инъекции микросферы оценивается с использованием in vivo двухфотонной микроскопии и посмертного in situ 3D-визуализации с использованием специализированного крио-микротома³⁹.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, следовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных. Центральный комитет по экспериментам на животных Нидерландов дал полное одобрение (AVD11400202316817).

ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались самцы и самки мышей возрастом от 2 месяцев до 1 года. По прибытии животных акклиматизировали в течение 7 дней перед любой экспериментальной процедурой. Животных содержали максимум 4 в клетке, обеспечивали едой и водой ad libitum, и содержались по 12-часовому циклу светло-тёмно. Мыши NG2-DsRed и TIE2-GFP были приобретены (см. таблицу материалов для подробностей) и разведены на собственном месте.

1. Имплант окна черепа

1. Анестезия и предоперационный уход
   1. Добавьте 0,06 мг/мл Карпрофена в питьевую воду за день до начала операции на черепном окне.
   2. Взвесьте мышь и введите 5 мг/кг карпрофена и 2 мг/кг дексаметазона подкожно за 30 минут до операции.
   3. Подготовьте хирургическую зону, разместив грелку с системой обратной связи на стереотаксической раме и накрыв её стерильной тканью.
   4. Разложите все стерильные хирургические инструменты на второй стерильной ткани.
   5. Анестезируйте мышь в индукционной камере с помощью 1 л/мин воздушной смеси (30% кислорода и 70% медицинского воздуха) и 3-4% изофлурана, затем поддерживайте анестезию с помощью 1,5-2% изофлурана с помощью маски для лица.
   6. Закрепите мышь в стереотактической раме и вставьте термометр на грелку прямо, используя смазку. Нанесите глазную мазь для предотвращения высыхания и установите грелку на 37 °C.
   7. Введите подкожно 1,5 мг/кг ропивакаина на линии хирургического разреза за 5 минут до операции.
   8. Очистите кожу над черепом от шеи до чуть ниже глаз бетадином с помощью хлопкового наконечника.
2. Хирургическая подготовка для фиксации головы и окна
   1. Используя стерильные щипцы и хирургические ножницы, сделайте начальный разрез на коже над задним черепом. Протяните разрез от лямбда-шва вдоль средней линии до лобных швов непосредственно перед брегмой (рисунок 1A). Аккуратно уберите и удалите кожу, чтобы полностью обнажить височные мышцы с обеих сторон.
   2. Нанесите примерно 0,1 мл 1% лидокаина на череп, чтобы минимизировать кровотечение.
   3. Удалите надственную область и поцарапайте все области черепа, где будет закреплена головная перекладина, хирургическим лезвием. Сделайте царапины перпендикулярными по черепу, чтобы обеспечить прочное прилипление головной планки.
   4. Очистите оставшуюся кровь ватным наконечником и высушите череп с помощью сжатого воздуха.
3. Фиксация головной планки
   1. Приготовьте смесь зубного клея в холодной керамической ёмкости температурой 4 °C, добавив 100 мкл мономера к 0,1 г полимера и смешав. Добавьте 1 каплю катализатора в смесь, чтобы инициировать быстрое затвердевание клея.
   2. Нанесите клей на нижнюю часть головной планки. Слегка наклоните планку головы к левой боковой стороне от сагиттального синуса и надавите на череп. Нанесите дополнительный клей на края головной планки, чтобы герметизировать все отверстия. Это обеспечивает прочную адгезию.
   3. Сделайте зубную цементную смесь, смешав 100 мкл зубного цементного раствора с порошком 0,1 г. Нанесите цемент со всех сторон головной планки, предотвращая попадание цемента на череп в зоне бурения. Добавьте дополнительный слой зубного цемента поверх головной планки, чтобы образовать скважину, позволяющую наносить жидкости на окно черепа (рисунок 1B).
   4. Дайте клею и цементу высохнуть минимум 10 минут.
   5. Подтвердите прочность прилипления головной планки, аккуратно придавливая череп, где будет проводиться краниотомия. Головная перекладина правильно приклеена, когда череп не двигается, и между зубным цементом и черепом жидкость не появляется.
4. Краниотомия
   1. Прикрепите мышь к держателю изображения с помощью головной планки или оставьте её в стереотаксической рамке, чтобы надёжно закрепить голову животного во время краниотомии.
   2. Отметьте мишень для сверления краниотомии (диаметром 4 мм) на черепе с помощью маркера с тонкой точкой. Найдите МКА, видимую через череп, чтобы убедиться, что окно черепа расположено оптимально, охватывая как можно большую часть МКА. Чтобы подтвердить правильный размер и расположение мишени для бурения, поднимите стекло крышки над отмеченной областью и регулируйте размер мишени по мере необходимости.
   3. Начните сверлить по кругу на отметках, не давя на череп, чтобы предотвратить образование тепла (рисунок 1C). Охлаждайте череп, нанося физиологический раствор каждые 30 секунд. Во время охлаждения очистите и охладите сверлиль, погрузив её в воду, а затем высушите бумажным полотенцем. Регулярно удаляйте всю костную пыль с помощью сжатого воздуха. Проверьте размер краниотомии, установив крышное стекло на череп и при необходимости скорректируя сверление.
   4. Продолжайте сверлить по кругу, пока кость не станет достаточно истонченой. Трещины появятся в зоне бурения, когда череп почти проколот. Убедитесь, что кость достаточно истончена, добавив физиологический раствор для смягчения разреженного черепа и аккуратно прижимая середину черепной кости в области сверления. Область сверления достаточно тонкая, если череп равномерно опускается с всех сторон зоны сверления под лёгким давлением. Продолжайте бурение до достижения этого момента. Не просверливайте череп; Это может привести к повреждению твердой мозговой орудости и мозговой ткани. Если твердая твердость повреждена или происходит кровотечение, держите место для сверления влажной жидкостью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед удалением черепа убедитесь, что вся костная пыль удалена из зоны сверления. Остаточные костные частицы на твердой ободке могут потенциально инициировать рост костей под окном.
   5. Тщательно очистите всю костную пыль с помощью ЦСФ и сжатого воздуха. Наносите aCSF на просверленную область, пока череп полностью не погрузится под воду. Используя иглу 27 (0,4 мм x 16 мм) или 30 калибра (0,3 мм x 13 мм), аккуратно проколите истончённый череп горизонтально (~180°), чтобы избежать повреждения твердой мозкости и мозга. Аккуратно поднимите кость вверх, пока она не отсоединится, прилагая минимальное усилие. Если кость не отсоединяется легко, продолжайте сверление. Удалять оторванный череп щипцем, оставляя мозг погруженным в ЦСФ (рисунок 1D).
   6. Промыйте мозг с помощью ЦСЖ, затем положите стерильную, впитывающую гемостатическую губку из свинины из желатина, пропитанную в ЦСФ, чтобы остановить локальное кровотечение на 2 минуты. Аккуратно снимите губку, чтобы мозг был погружён в жидкость в ЦСФ. Продолжайте промывать с помощью ЦСФ, чтобы в мозге не осталось костной пыли или крови. Если кровотечение продолжается, положите на мозг свежую стерильную, впитывающую гемостатическую губку, пропитанную ЦСЖ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительные кровотечения часто встречаются при удалении костей. Убедитесь, что кровотечение остановилось перед установкой стекла, так как остаточное прокачивание может снизить прозрачность окна.
5. Размещение крышного стекла
   1. Поглощайте ЦСФ, покрывающий мозг хлопковой кончиком, оставляя лишь тонкий слой. Положите стекло на мозг и аккуратно прижмите его к отверстию черепа с помощью согнутых микрощипцев. Убедитесь, что стекло немного ниже уровня черепа и расположено параллельно головной перекладине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стекло должно плотно прижиматься к мозгу, чтобы предотвратить образование полости и сохранить качество окна. Держание стекла крышки параллельно головной планке обеспечивает его перпендикулярность объективу микроскопа, улучшая качество изображения.
   2. Прикрепите стекло к черепу и головной планке эпоксидным клеем, прикрепляя его по бокам, крепко удерживая стекло параллельно головной планке.
   3. Запечатайте все края стекла клеем, чтобы предотвратить контакт мозга. Во время нанесения держите одну каплю ЦСФ на мозге, чтобы клей не просачивался под окном или не контактировал с твердой мозговой мозговой поверхностью (рисунок 1E).
   4. Дайте клею затвердеть на 5 минут.

Рисунок 1: Обзор протокола краниотомии. Подробные примеры фотографий и схемы ключевых этапов краниотомии и операции по установке головы. (A) Снятие кожи (шаг 2.2). (B) Крепление головы (шаг 2.3). (C) Сверление краниотомии 4 мм (шаг 2.4.3). (D) Удаление черепа (шаг 1.4.5). (E) Размещение стекла крышки (шаг 1.4.7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Послеоперационный уход
   1. Вводите 5 мг/кг Карпрофена подкожно.
   2. Переместите животное в клетку с температурой 37 °C на 30 минут. Затем вернуть её в домашнюю клетку с 0,06 мг/мл Карпрофена в питьевой воде до 2 дней после операции.
   3. Давайте еду, замоченную в 0,06 мг/мл Карпрофена, пока животное не вернётся к своему дооперационному весу.
   4. Дайте животному восстановиться не менее 7 дней перед проведением модели операции по микрососудистой эмболии.

2. Модель мышей с микрососудистой эмболией

1. Сборка катетера
   1. Вставьте кончик микрокатетера длиной 20 см (ID 0.23114 OD 0.27432 мм) в прозрачный катетер (ID 0.31 OD 0.64 мм) и запечатайте соединение эпоксидным клеем и лентой. Подтвердите, что общая длина катетера достаточна, чтобы удерживать не менее 160 мкл.
   2. Введите иглу люэр-лок диаметром 27 (0,1 мм x 16 мм) в противоположный конец прозрачного катетера. Запечатайте конец эпоксидным клеем и скотчем.
   3. Наполните шприц объёмом 1 мл физиологическим раствором и подключите его к замку катетера. Промите 0,7 мл физиологического раствора, чтобы не осталось протечек или пузырьков воздуха.
   4. Наполните катетер 80 мкл физиологического раствора и отметьте достигнутый уровень в катетере.
2. Анестезия и предоперационный уход
   1. Обеспечьте мыши питьевой водой с содержанием 0,06 мг/мл карпрофена за день до операции по микрососудистой эмболии.
   2. Положите грелку с системой обратной связи под стерильную ткань и установите температуру на 37 °C.
   3. Положите все стерильные хирургические инструменты на вторую стерильную ткань.
   4. Взвесьте мышь и введите 5 мг/кг Карпрофена подкожно за 30 минут до операции.
   5. Анестезия мыши с использованием 3-4% изофлурана в индукционной камере с газовым потоком 1 л/мин, состоящим из 30% кислорода и 70% хирургического воздуха.
   6. Перенесите мышь на операционный стол и поддерживайте анестезию с помощью маски для лица, выдавая 1,5–2% изофлурана при 1 л/мин с 30% кислорода и 70% воздуха.
   7. Вставьте смазанный ректальный температурный датчик и нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание.
   8. Разместите шприц объемом 2 мл под шею мыши, лежащей на спине, чтобы облегчить доступ к хирургической области.
   9. Аккуратно закрепите передние лапы к операционному столу скотчем.
   10. Побрить хирургическую зону и нанести бетадин, затем лидокаин.
3. Надрез
   1. Проверьте глубину анестезии с помощью защемления пальца.
   2. Сделайте разрез по средней линии примерно 0,5 см над трахеей ниже нижней челюсти с помощью хирургических ножниц и вскрытия щипцов.
   3. Вскрытие соединительной ткани, поверхностной шейной фасции, с помощью щипцов, связанных с микрошовами, чтобы обнажить подлежащие грудистоподъязычные мышцы.
   4. Разделите левую и правую грудиноподъязычные мышцы, аккуратно разорвав соединительную ткань между ними. Втяните правую омогиоидную мышцу каудально-латерально с помощью тканевого крючка. Убедитесь, что правый сонный треугольник, включая CCA, ICA и ECA, хорошо виден.
4. Хирургическая подготовка CCA, ICA, ECA и задней теменной артерии (PPA)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте захвата и защипывания блуждающего нерва; Двигайте её только аккуратно, чтобы предотвратить негативные последствия для здоровья животного. Не трогайте трахею, так как это может вызвать проблемы с дыханием. Определите затылочную артерию (ОА), которая разветвляется от ИКА посередине между Y-образной бифуркацией ИКА и началом ЭКА, и верхнюю щитовидную артерию (ТА), которая отходит от медиальной стороны ЭКА. Эти артерии хрупкие и с ними следует обращаться с крайней осторожностью.
   1. Удалите всю оставшуюся фасцию и жировую ткань вокруг CCA.
   2. Аккуратно отделяйте CCA от блуждающего нерва.
   3. Наместите две нити 4/0 1.5 вокруг CCA и завяжите их свободно. Убедитесь, что узлы не мешают кровотоку CCA.
   4. Удалите фасцию и жировую ткань из ICA и PPA. Временно перевяжите PPA и все боковые ветви ICA, включая OA, завязывая узел нитью 4/0 1.5.
   5. Удалять фасцию и жировую ткань из ЭКА и ТА. Разместите два свободных узла вокруг ECA и TA с резьбой 4/0 1.5. Разместите самую дистальную нить как можно дальше от Y-образной бифуркации и используйте её для постоянного перевязывания ECA и TA. Оставьте проксимальный узел развязанным.
5. Подготовка раствора микросферы и загрузка катетера
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор FITC-Dexen/микросферы незадолго до инъекции, чтобы минимизировать адгезию микросферы к катетеру.
   1. Гомогенизировать и сониковать микросферы размером 10 мкм (7,2 x 10⁶ микросфер/мл) для получения равномерной суспензии отдельных частиц.
   2. Приготовьте 140 мкл 25 мг/мл 70 кДа FITC-Dexn с 0,1% Tween20, затем добавьте 20 мкл гомогенизированных микросфер для получения 160 мкл смеси FITC-декстран/Tween20/микросферы, содержащей 1,44 × 10⁵ микросфер.
   3. Кратко уберите шприц, подключённый к катетеру, чтобы создать шлюз.
   4. Погрузите наконечник катетера в подготовленную смесь FITC-Dextran/Tween20/микросферы и медленно оттягивайте шприц, пока смесь не попадёт в катетер.
   5. Убедитесь, что в катетере нет воздушных пузырьков. Если она есть, высыпайте смесь в контейнер объёмом 0,5 мл и повторяйте шаги 2.5.3 и 2.5.4.
   6. Поместите шприц с загруженным катетером в насос для шприца. Установите насос на 10 мкл/мин и работайте, пока на кончике катетера не появится небольшая капля микросферной смеси.
6. Введение катетера и инъекция в микросферу
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков воздуха в сосудистую систему, так как это может вызвать серьёзные побочные эффекты или смерть. Воздушные пузырьки могут возникать из-за неправильной загрузки катетера или протечек в трубке.
   1. Поставьте зажим сосуда на ИКА и затяните один из ранее подготовленных проксимальных узлов вокруг CCA (см. шаг 2.4.3).
   2. С помощью микроножниц сделайте небольшой диагональный разрез в ЭКА примерно в 0,5 мм от нити для перевязки. Убедитесь, что размер разреза немного меньше диаметра катетера.
   3. Впитывайте всю кровь стерильной тканью или тканью, чтобы кровь не продолжала протекать через связки и зажим сосуда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистый треугольник должен оставаться свободным от крови после разреза ЭКА. Остаточная кровь может привести к образованию тромба, что может вызвать крупные ишемические события в мозге при восстановлении сонного кровотока или блокировать ЭКА, предотвращая инъекцию микросферы.
   4. Кратко запустите насос шприца, чтобы получить каплю микросферной смеси на кончике катетера, убедившись, что воздух в кончике катетера не осталось.
   5. Откройте разрез ECA и введите катетер с помощью тонких микрощипцев. Избегайте прикосновения к другим поверхностям при введении, чтобы предотвратить потерю микросферной смеси или поступление воздуха в катетер. Если установка не получится или кончик катетера касается поверхности, повторите шаг 2.6.4 перед повторной попыткой.
   6. Закрепите катетер в ЭКА, затянув проксимальный шов (см. шаг 2.4.5) вокруг ЭКА.
   7. Убедитесь, что внутри сосудистых сосудов нет протечек или пузырьков воздуха, запустив насос с шприцем на 10 мкл/мин. Если присутствует какой-то из них, отсоедините катетер и вернитесь к шагу 2.6.4.
   8. Если не обнаружено утечки или воздушных пузырьков, продолжайте перекачку со скоростью 10 мкл/мин, чтобы постепенно увеличивать давление в катетере и сосудистую систему, пока не будет заметно увеличено артерию. Чтобы соответствовать артериальному давлению животного, установите достаточное давление в катетере и сосудистых сосудах перед повторным открытием ICA и CCA. Когда кровоток в CCA и ICA восстановлен, часть крови может попасть в катетер, но затем она будет повторно введена в ICA. Визуально подтвердите введение микросферной смеси в ЭКА и успешное накопление давления, наблюдая за зелёным красителем FITC, заполняющим артерии. Если этого не соблюдается, остановите работу насоса, удалите катетер и повторите шаги 2.6.4–2.6.8.
   9. Снимите зажим сосуда из ICA, затем увеличьте расход насоса шприца до 20 мкл/мин. Подтвердите успешную инъекцию в микросферу, убедившись, что ICA дистально от бифуркации PPA заполнена красителем FITC. Если подтверждено, переходите к шагу 2.6.11; Если нет, перейдите к шагу 2.6.10.
   10. Остановите насос для шприца и ослабьте связку PPA. Переместите связку PPA дальше дистально от бифуркации ICA-PPA, затем затяните связку. Вернёмся к шагу 2.6.9.
   11. Удалите резьбу, которая связывала CCA, чтобы микросферная смесь могла попасть в ICA.
   12. Устранение неполадок при ретроградном потоке при впрыске микросферной смеси:
       1. Если происходит ретроградный поток микросферной смеси в CCA, уменьшите поток насоса шприца до 10 мкл/мин.
       2. Если ретроградный поток продолжается, аккуратно сжимайте ECA, ICA и CCA с помощью микрощипцев, чтобы не было препятствий потоку из-за тромба.
       3. Визуально подтвердите, что внутри сосудистых сосудов нет воздушной эмболии. Воздушная эмболия может быть распознана как прозрачный срез внутри сосудистой системы.
       4. Если воздушная эмболия присутствует, остановите шприцовый насос и переместите воздушную эмболию к ЭКА, аккуратно сжимая артерию с помощью микрощипцев. Перевяжите CCA и поставьте зажим сосудов на ECA. Удалите катетер и эмболию воздуха и вернитесь к шагу 2.6.4.
       5. Если нет препятствий, но ретроградный поток продолжается, закройте CCA с помощью зажима сосуда и вернитесь к шагу 2.6.10.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Ретроградный поток микросферной смеси в CCA не должен происходить, так как это может указывать на недостаточное повторное открытие ICA, воздушную эмболию или образование тромба, что может негативно повлиять на результат эксперимента.
   13. Прекратите инъекцию микросферы, отключив насос для шприца, когда смесь в катетере достигнет отметки 80 мкл (см. шаг 3.1.4). Всего вводится 80 мкл FITC-Dextran/Tween20 с размером 7,2 x 10⁴ микросфер.
7. Завершение процедуры
   1. Перевяжите CCA с помощью оставшегося подготовленного узла (см. шаг 2.4.3) и закройте ICA зажимом сосуда.
   2. Удалите катетер из ECA, оставив при этом закрепление катетера в ECA в том же положении.
   3. Навсегда перевязать ЭКА, затянув нить, которая закрепляла катетер.
   4. Удалите зажим сосуды и нити вокруг CCA, ICA и PPA, чтобы восстановить кровоток. Увлажните операционную область несколькими каплями физиологического раствора.
   5. Швите кожу спицей с изогнутой игной 3/8 длиной 12 мм и невпитываемым швом 3-0 (USP).
8. Послеоперационный уход
   1. Подкожно вводите 5 мг/кг Карпрофена.
   2. Переместите животное в клетку для восстановления (~33 °C) на 30-60 минут. Вернуть животное в клетку после полного восстановления.
   3. В первые 2 дня замачивайте корм на 10 минут в 0,06 мг/мл карпрофена и давайте его животному и добавляйте в питьевую воду 0,06 мг/мл карпрофена. После этого периода продолжайте замоченный чау без карпрофена, пока животное не вернётся к своему весу до операции.
   4. Следите за животным несколько раз в день в течение первых двух дней, затем 3 раза в неделю. Усыпить животное, если достигнута гуманная конечная точка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие конечные точки определяются в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС Европейского парламента. Кроме того, эвтаназия любого животного, если у него проявляются признаки ишемии, такие как круговое поведение или паралич, поскольку модель микрососудистой эмболии не должна вызывать крупное ишемическое событие.

Рисунок 2: Операция по удалению микроваскулярной эмболии. Подробные примеры фотографий и схематические рисунки ключевых этапов операции по удалению микроваскулярной эмболии. (A) Подготовка лигаций CCA (2x), ECA (2x), TA, OA и PPA (шаг 2.4). (B) (Височная) перевязка CCA (1^st) и ECA, затем закрытие OA и PPA и временное закрытие ICA сосудовым клипсом, что позволяет сделать разрез в ECA без кровотечения (шаг 2.6.2). (C) Размещение катетера в рассеченном ЭКА, которые связаны вторым швом (шаг 2.6.7). (D) Открытие проксимального шва вокруг ККА и удаление клипса сосуда из ИКА для восстановления кровотока, затем введение микросферной смеси в ИКА (шаг 2.6.10). CCA = общая сонная артерия; ECA = наружная сонная артерия; TA = щитовидная артерия; OA = затылочная артерия; PPA = Птеригопалатинная артерия; ICA = Внутренняя сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Визуализация in vivo

1. Двухфотонная микроскопия
   1. Поместите животное в держатель для двухфотонной визуализации микроскопа для послеоперационной in vivo визуализации. Поддерживайте лёгкую анестезию с 1,2% изофлураном в смеси 30% кислорода и 70% воздуха 1 л/мин, а также контролируйте частоту и глубину дыхания. См. дополнительную таблицу 1 для подробностей настройки микроскопа.
   2. Определите застрявшие микросферы через окно черепа с помощью объектива 10x (10x/0.30 DRY) и освещения ртутной лампы. Затем переходите на двухфотонную съёмку с объективом погружения в воду 25x (25x/0,95 ВОДЫ). См. дополнительную таблицу 2 для настроек изображения.
   3. Записывайте Z-стеки вокруг интересующей микросферы.

4. Анализ после вскрытия

1. Экспериментальная конечная точка для in-situ визуализации
   1. Когда экспериментальная конечная точка достигнута, усыпить животное путём вывиха шейки матки под > 4% изофлурана в смеси 1 л/мин из 30% кислорода и 70% медицинского воздуха.
2. Визуализация мозга in situ
   1. Извлечь мозг, вложить его в растворитель натрия с 3,0% карбоксиметилцеллюлозы (Sigma), смешанный с 0,1% чёрной чернилой (VWR), и заморозить при −20 °C не менее 24 часов.
   2. Сфотографируйте мозг с помощью индивидуально изготовленной небольшой 3D-флуоресцентной криомикротомной системы (small-3D-FICS), ранее описанной Чучем Р.Н.С. и ^др.40. Настройте систему так, чтобы разрезать мозг вертикально на срезы по 16 мкм и сделать изображение с разрешением 13,66 × 13,66 мкм. См. Дополнительные таблицы 3 и Дополнительные таблицы 4 для настроек изображения и спецификаций системы. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения Articulus⁴¹.
3. In situ целая мышиная визуализация
   1. Снимите с животного кожу, зубы и хвост.
      ПРИМЕЧАНИЕ: удаление хвоста необязательно, но увеличивает скорость съёмки.
   2. Поместить животное в растворитель натрия с 3,0% карбоксиметилцеллюлозы (Sigma), смешанный с 0,1% чёрной чернила (VWR), и заморозить при −20 °C не менее 24 часов.
   3. Сфотографируйте животное с помощью специально изготовленной большой 3D флуоресцентной криомикротомной системы (large-3D-FICS), как описано ^ранее. Установите систему на резку сечений размером 25,9 мкм с разрешением в плоскости 26,09 мкм. См. дополнительные таблицы 5 и дополнительную таблицу 6 для настроек изображения и спецификаций системы. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения Articulus⁴¹.

Результаты

Посмертная ин-ситу визуализация

Успех операции по удалению микроваскулярной эмболии был подтверждён посмертным исследованиями на месте всего тела и мозга через 4 дня после операции по микрососудистой эмболии (рисунок 3A). Сагиттальный срез мыши показывает расположение микросфер в мозге. Рисунок 3B,C показывает пример извлечения мышиного мозга через 1 день после операции по микрососудистой эмболии. Микросферы преимущественно располагались в ипсилатеральном полушарии, в области потока средней и передней артерий головного мозга. Количество микросфер в срезах мозга значительно увеличилось при добавлении Tween20 в смесь (рисунок 3E). Мониторинг веса во время восстановления после операции по микроэмболии показывает, что мыши теряли меньше веса и восстанавливались быстрее после операции при введении микросферной смеси, содержащей Tween20 (рисунок 3F).

Рисунок 3: Распределение микросфер у мыши после операции по удалению микрососудистой эмболии. Локальная локализация микросфер размером 10 мкм в мыши, визуализированная с помощью программного обеспечения Articulus⁴¹. (A) Пример сагиттальной плоскости целой мыши, сфотографированной с помощью большого 3D-FICS после операции по микрососудистой эмболии. (B-D) Репрезентативные аксиальные, корональные и сагиттальные изображения мозга мыши, полученные с помощью малых 3D-FICS. (E) Среднее количество обнаруженных микросфер на корональные срезы мозга диаметром 50 мкм примерно при брегме ± 0,5 мм для контрольных и Tween20 условий. Планки обозначают среднее ± стандартное отклонение. Отдельные измерения показаны в виде точек. Статистическое сравнение проводилось с помощью непарного t-теста; p-значение указывается на графике. Выбросы были выявлены и удалены с помощью метода межквартильного диапазона (IQR) (n = 1 для обеих групп), что привело к итоговому размеру группы n = 3 для контрольных групп и n = 14 для Tween20. (F) Нормализованные изменения веса со временем после операции по микрососудистой эмболии в момент времени 0. Веса были нормализованы по исходному уровню каждого животного во время операции. Линии показывают среднее ± SD на группу (Control, n = 4; Tween20, n = 5) с Control синим и Tween20 тёмно-оранжевым. Статистическая значимость между группами в каждый момент времени оценивалась с помощью непарных двухсторонних t-тестов. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Инъекция в микросферу и микроскопия двух фотонов in vivo

Во время инъекции в микросферу катетеры, покрытые 5% BSA, показали множество микросфер, прилипших к поверхности катетера, а проточные микросферы часто сгруппировались, что могло привести к большей окклюзии (см. Дополнительное видео 1). Кроме того, добавление 5% BSA в микросферную смесь для предотвращения адгезии и кластеризации нежелательно из-за возможного иммунного ответа при^{инъекции 43,44}. Чтобы обойти это, в смеси микросферы использовался раствор Tween20 с концентрацией 0,1%, что привело к заметно большему числу микросфер, проходящих через катетер, и к желаемому числу (> 20) микросфер в окне изображения (рисунок 4 и дополнительное видео 2). Рисунок 4A,B показывает обзорное изображение флуоресцентной микроскопии коры мозга через 0,5 часа после операции по микрососудистой эмболии. Каждая белая точка представляет собой микросферу, которая перекрывает капилляр в микрососудистом мозге. Рисунок 4C,D показывает двухфотонную z-стековую проекцию в виде 2D-проекции в качестве примера. Микросферы вызывают церебральные микроваскулярные эмболии с нарушением перфузии, что указывается на отсутствие внутрилюминального красителя ниже по течению микросферы (рисунок 4E и дополнительное видео 3). Кроме того, эти эмболии вызывают нарушение BBB экстравазацией красителя FITC-Dextran (рисунок 4F,G).

Эти результаты соответствуют небольшому числу микросфер, приклеенных к катетеру, и минимальному кластеризации микросфер, наблюдаемой в катетере при введении смеси микросфера-твин. Однако большое количество микросфер всё же скопилось в последние 20 мкл смеси микросферы в катетере, которые не следует вводить для предотвращения возможного возникновения крупного инфаркта (см. Дополнительное видео 4).

Рисунок 4: Двухфотонная микроскопия in vivo застрявших микросфер.Примеры in vivo флуоресцентных и двухфотонных изображений застрявших микросфер в коре мыши. (A) Флуоресцентный обзор через черепное окно микросфер ложи. (B) Флуоресцентное изображение выбранной ROI. (C,D) Двухфотонные микроскопические изображения запертых микросфер в микроциркуляции мозга с выбранной ROI для детальной визуализации. Z-стековые изображения изображаются в 2D путём вычисления стандартного отклонения интенсивности пикселей вдоль Z-стека. (E-G) Репрезентативные изображения двухфотонной микроскопии in vivo с тремя церебральными микрососудистыми эмболиями. Красные стрелки выделяют участки экстравазации FITC-Dextran, что указывает на нарушение BBB и утечку красителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительная таблица 1: Технические характеристики системы двухфотонного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Настройки двухфотонного микроскопа для FITC-декстран и микросферной визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 3: Малые 3D-флуоресцентные настройки криомикротомной системы для изображения мозга мышей с помощью синих микросфер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 4: Спецификации системы криомикротома для малых 3D-флуоресцентных моделей для изображения мозга мышей с помощью синих микросфер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 5: Большие 3D-флуоресцентные настройки криомикротомной системы для полноценной мыши с красными микросферами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 6: Спецификации системы криомикротомов для крупных 3D-флуоресцентных изображений для целой мыши с красными микросферами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительное видео 1: катетер с 5% покрытым BSA, с адгезией микросферы к стенке катетера и кластерированием микросферы в смеси микросферы FITC-Dextran со скоростью 25 мг/мл во время инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 2: катетер с 0,1% покрытым Tween20 с некоторой адгезией микросферы к стенке катетера, но без микроскопирования в 25 мг/мл FITC-Dexn с 0,1% смесью Tween20 с микросферами во время инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 3: 3D-сегментация микроваскулярных окклюзий микросферами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео 4: Конечный объём инъекции микросферы с высокой концентрацией микросферы в 25 мг/мл FITC-Dexn с 0,1% смесью Tween20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительный файл 1: Микросферное присоединение к валидации наконечников пипеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Иммуногистохимическая оценка покрытия CD45 через 1, 7 и 28 дней после операции с микроэмболией, сравнивающая ипсилатеральное и контралатеральное полушария. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Для моделирования микроваскулярных эмболий был описан протокол введения микросфер в церебральный кровообращение мышей, который позволяет изучать микроэмболию с помощью in vivo двухфотонной микроскопии. Этот метод оптимизировал захват микросферы в мозге, при этом несколько микросфер были захвачены в первых 500 мкм ипсилатеральной коры, что позволило эффективно проводить двухфотонную визуализацию.

Высокий уровень микросфер в корковой области мозга имеет решающее значение для in vivo двухфотонной визуализации. Потеря микросфер была минимизирована во время приготовления микросферы путём покрытия кончиков пипетки 5% BSA или 0,1% Tween20, что уменьшило адгезию микросферы (см. Дополнительный файл 1). Хотя точное количество прилипших микросфер невозможно было количественно определить, измерения средней интенсивности показали влияние покрытий. Кроме того, Tween20, по-видимому, предотвращал скопление микросфер в катетере, что привело к визуально большему числу отдельных микросфер, проходящих через катетер, хотя это не является количественно измеренным. Это снижает риск окклюзии крупных сосудов и потенциального образования крупных ишемических и гипоксических областей, что нежелательно с учётом цели моделирования микрососудистых эмболизаций. Кроме того, мыши проявляли меньшую потерю веса и быстрее восстанавливались до дооперационного веса при введении микросферной смеси с низкими концентрациями Tween20. Tween20 — это распространённый^{дисперсант} 45,46,47, поэтому низкие концентрации, используемые в данном исследовании, не ожидаются вызывать токсичность или негативное влияние на целостность BBB. Кроме того, наши данные показывают, что утечка BBB происходит только рядом с (или после её прохождения) микросферы, а не систематически, при этом не вызывает значительного увеличения общего покрытия лейкоцитами (см. дополнительный файл 2), что поддерживает использование 0,1% Tween20. В целом, добавление Tween20 способствует снижению скопления микросфер и увеличению доставки микросфер в церебральный кровообращение, что подтверждается подсчётом микросфер в срезах мозга, а также обеспечивает достаточное количество микросфер, видимых для двухфотонной микроскопии. Хотя использование Tween20 увеличивает количество микросфер, задерживающихся в мозге, вариабельность при инъекции микросферы сохраняется. Несколько факторов могут способствовать этой вариации. Во-первых, образование тромба внутри катетера или сосудистых органов может привести к прилипию микросфер к тромбу. Во-вторых, наличие пузырьков воздуха может мешать плавной подаче воздуха. Наконец, неполное восстановление кровотока в CCA или ICA может изменить гемодинамику, потенциально способствуя прилипию микросферы к стенке сосудов или группированию внутри просвета. К сожалению, эти отклонения не могут быть обнаружены во время процедуры инъекции.

Полистироловые микросферы плотнее воды, что приводит к неравномерному распределению после загрузки смеси микросферы в катетер. Большинство микросфер оседают возле стенки катетера, где трение жидкости замедляет их движение относительно более быстрого центрального потока. В итоге это приводит к накоплению микросфер внутри последних 20 мкл катетера. Введение этой концентрированной части следует избегать, так как она может вызвать крупные эмболы и ишемические явления. Чтобы избежать этого, объем микросферной смеси должен быть подготовлен при вдвое большем объёма для инъекции.

Операция по удалению микроваскулярной эмболии требует значительной подготовки и точности. Одним из самых технически сложных этапов является наложение шва на PPA, OA и боковые ветви ICA для обеспечения точной подачи микросферной смеси в круг Уиллиса и территорию MCA. Этот этап осложняется близкой близостью блуждающего нерва рядом с CCA, малым диаметром сосудов и ограниченным хирургическим пространством, что затрудняет расположение швов без повреждения нервов или сосудистых повреждений.

Хотя зажим сосудов может рассматриваться как альтернатива временному перевязыванию ППА с помощью шва, он несёт дополнительные риски. Зажимы могут непреднамеренно отсоединяться, что приводит к повторному открытию сосудов. Кроме того, использование второго клипа на PPA рядом с существующим на ICA увеличивает вероятность отрыва клипа ICA из-за ограниченного пространства. Если это произойдёт, это вызовет значительное кровотечение и без немедленного вмешательства может привести к досрочному прекращению эксперимента. Поэтому закрытие PPA с помощью сосудового клипса не рекомендуется.

В текущем протоколе используется катетер вместо^{шприца 33} для инъекции в микросферу. Такой подход обеспечивает лучший контроль над скоростью и объёмом инъекции, а также позволяет вводить микросферы более удаленно (например, внутри метода визуализации, такой как микроскоп или МРТ-сканер).

Выбор ECA вместо CCA в качестве входной точки позволяет CCA оставаться полностью открытым во время инъекции, что способствует поддержанию более физиологической перфузии мозга на протяжении всей операции. Кроме того, инъекция микросфер через ЭКА вместо CCA имеет и другие^{преимущества 48}: i) сокращается общее время работы во время реперфузии; ii) снижение риска кровотечения во время инъекции и после завершения операции; iii) при методе входа в CCA образуется нестабильный стеноз и тромбоз в CCA после удаления^{иглы 49}. Это вызывает нарушения кровотока, а также риск образования микротромбов, которые могут попасть в мозг. Кроме того, вход через CCA связан с большим риском постоянного закрытия CCA, что может привести к неоптимальной реперфузии мозга в период выживаемости после операции, усугубляющейся высокой вариацией круга Уиллиса у^{мышей 50,51}

Хотя протокол полностью оптимизирован, у него есть некоторые ограничения. Во-первых, наблюдение о том, что микросферы движутся медленнее вдоль стенок катетера и распределяются неравномерно во время инъекции, свидетельствует о том, что в ИКА поступает меньше микросфер, чем ожидалось. Несмотря на использование Tween-20 для снижения прилипания, некоторые микросферы всё равно прилипают к кончикам пипетки, трубке Эппендорфа и катетеру. Следовательно, фактическое количество вводных микросфер, вероятно, меньше, чем рассчитанные 7,2 x 10⁴ частиц на мышь. Тем не менее, в церебральный кровообращение достигает достаточного количества микросфер, что позволяет проводить визуализацию с помощью двухфотонной микроскопии. Протокол впрыска и состав смеси оптимизированы для микросфер полистирола с размером 10 мкм. Если материалы (наконечники, трубки, катетеры) или размер микросфер изменяются, следует переоценить как раствор, так и процедуру инъекции. Во-вторых, исследования, изучающие лучший метод окклюзии крупных сосудов через внутрилюминальную окклюзию МКА, показали, что вход в сосудистую систему посредством постоянной связки ЭКА приводит к ишемии жевательных и глотающих^{мышц 52}. Это может привести к снижению потребления пищи мышами, а значит, к чрезмерной потере веса, нарушению моторной функции и увеличению неврологического дефицита. Однако это утверждение было опровергнуто^{другими 48}. В этом исследовании мониторинг веса показал ожидаемое снижение после операции, но быстрое восстановление до дооперационных весов в течение нескольких дней, что свидетельствует о том, что мыши восстанавливаются и едят и пьют нормально после постоянной перевязки ЭКА. Хотя вес животных отслеживался, это лишь косвенное свидетельство о их благополучии и не полностью исключает функциональные нарушения, такие как локальные жевательные или моторные нарушения. Прямых оценок функционального восстановления не проводилось, что является ограничением данного исследования. Другое исследование сравнило вход в сосудистую систему через CCA или ECA и показало, что вход через CCA может привести к нарушению реперфузии мозгового кровообращения, пришло к выводу, что метод ввода ECA предпочтительен⁵³. В-третьих, правильное и надёжное размещение катетера без появления пузырьков воздуха, тромбов или утечки, а также без препятствий кровотоку в CCA и ICA требует значительной практики. Наконец, в отличие от других методов микроокклюзии, таких как фототромбоз с помощью инъекции^{Rose-Bengal 22}, невозможно предсказать, где микросферы в конечном итоге окажутся в кровообращении.

В данном исследовании намеренно не включены отрицательные (фиктивные) или положительные (фототромбозные) контрольные группы, поскольку они не дадут дополнительной ценности для основной цели. Успех этой модели определяется числом микросфер, расположенных в микроциркуляции мозга, особенно в области окна черепа, что позволяет осуществлять микроскопию высокого разрешения in vivo . Фиктивная процедура по определению не даёт микросфер в целевой области и, следовательно, не даёт релевантного сравнения для конечной точки in vivo визуализации. Аналогично, включение модели фототромбоза решило бы принципиально иной патофизиологический механизм и, следовательно, выходит за рамки данной работы, которая сосредоточена на характеристике модели микроваскулярной эмболии, а не на сравнении методологий. Более широкие гистологические анализы эмболий и их потенциального влияния на BBB или локальную нейронную ткань не проводились, поскольку исследование было направлено на приоритет 3D-визуализации in vivo вместо валидации на уровне ткани.

Подробный хирургический протокол как для модели подготовки окна к черепу, так и микрососудистой эмболии, способствует надежному и воспроизводимому исследованию микрососудистых изменений, связанных с микрососудистой эмболией и возникновением тихих инфарктов мозга по всему ипсилатеральному полушарию. Оптимизированная подготовка и введение микросферной смеси дополнительно повышают согласованность и достоверность этого экспериментального подхода.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Игла 27-го калибра (0,1x16 мм)	Тэрумо	-	Игла 27-го калибра (Шаг 2.1.2.)
Программное обеспечение Articulus	-	-	Программное обеспечение для 3D-анализа (шаги 4.2.2 и 4.3.3)
Бетадин 30 мл (100 мг/мл)	Mylan	8712207037612	Бетадин/йод (Шаг 1.1.8 и 2.2.10.)
C& Мономер B	Sun Medical	7111	Компонент суперклея (Шаг 1.3.1).
Хирургические лезвия из углеродистой стали (No 15)	Свонн-Мортон	205	Лезвие для царапания черепа (Шаг 1.2.4).
Карпрофен (50 мг/мл)	Зоетис	-	Обезболивающие препараты (шаги 1.1, 1.6, 2.2 и 2.8)
Катализатор	Sun Medical	7110	Компонент суперклея (Шаг 1.3.1).
Катетер (ID 0,31 OD 0,64 мм)	Фройденберг	228-0661	Прозрачный катетер (шаг 2.1.1.)
Тканевой крюк из Costom	-	-	Тканевой крюк (Шаг 2.3.4.)
Хлопковые кончики	-	-	Хлопковый наконечник (шаги 1.1.8, 1.2.4 и 1.5.1.)
Стекло на обложке	Инструменты Warner	64-0724	Стекло черепного окна (Шаг 1.4.2.)
Индивидуальная головка мыши	-	-	Головная панель для держателя для изображения (шаг 1.3.2).
Индивидуальный держатель для изображения мыши	-	-	Держатель для мыши для визуализации (шаг 1.4.1 и 3.1.1.)
Изготовленная на заказ стереотактический корпус	-	-	Стереотактическая рамка (Шаг 1.1.7.)
Жидкость из стоматологического камента	Кульцер	64707937	Компонент зубного цемента (Шаг 1.3.3.)
Порошок для стоматологического кладения	Кульцер	64707945	Компонент зубного цемента (Шаг 1.3.3.)
Стоматологическая дрель и bbsp;	Саэсин	L-206	Упражнение (Шаг 1.4.3.)
Дексаметазон (4 мг/мл)	Centrafarm	-	Предоперационный прием медикаментов (Шаг1.1.4.)
Диспартирующие щипцы	Браун-Эскулап	BD023R	Щипцы (шаг 1.2.2 и 2.3.2.)
Сверловое сверло PK/100,5 (0,5 мм)	Тонкие науки	19007-05	Сверло (Шаг 1.4.3.)
Дюратеарс (3,5 г)	Alcon	-	Глазная мазь (шаг 1.1.8. & 2.2.7.)
Эпоксидный клей (1 г)	Паттекс	9H PSMG3X	Эпоксидный клей (шаг 1.5.2 и 2.1.1.)
Тонкие микрощипцы прямые	Тонкие научные инструменты	Dumont #5	Мелкие микрощипцы (шаг 2.6.6.)
FITC-Dextran (70 KDa)	Сигма-Олдрич	FD70S	Раствор FITC-Dextran (Шаг 2.5.2.)
Изофлуран (1000 мг/г)	Laboratorios Karizoo S.A.	118938	Анестезия (Шаг 1.1.6 и 2.2.5.)
крупный 3D-флуоресцентный криомикротом и bbsp;	Изготовление на заказ	-	large-3D-FICS (шаг 4.3.3)
Лидокаин (100 мг/мл)	Аспен	-	Местный анестезия (шаги 1.2.3 и 2.2.10)
Микроножницы Vannas 3-3/8 дюйма	Браун-Эскулап	OC498R	Микроножницы (шаг 2.6.2)
Щипцы для завязывания микрошовов с круглой рукояткой	Браун-Эскулап	FD280R	Микрофорцепс (Шаг 2.3.3.)
Щипцы для завязывания микрошовов с изогнутой круглой ручкой	Браун-Эскулап	FD281R	Микрофорцепс согнут (Шаг 1.5.1 и 2.3.3.)
Микрососудистый клип	Браун-Эскулап	FD562R	Зажим сосуда (Шаг 2.6.1.)
Микрокатетер (ID 0,23114 мм, OD 0,27432 мм)	Микролюмен		Микрокатетер (Шаг 2.1.1.)
Грелка для мыши и ректальный зонд	Штёльтинг	53800R	Грелка (шаг 1.1.2 и 2.2.2.)
Мыши NG2-DsRed	Лаборатория Джексона, Бар-Харбор, США, склад No 008241
Монолаурат полиэтиленгликоля сорбитан	Сигма-Олдрич	9005-64-5	Tween20 (Шаг 2.5.2.)
Полистироловые флюорсферы синий (365/415)	Инвитроген	F8829	Синие микросферы (Шаг 2.5.1.)
Полистироловые фторсферы красные (580/605)	Инвитроген	F8834	Красная микросфера (Шаг 2.5.1.)
Клетка для восстановления	-	-	Клетка для восстановления (шаги 1.6.2 и 2.8.2.)
Обратное вырезание иглы 3/8 (12 мм) с швом	Ббраун	0762067	Швы (шаг 2.7.5)
Ropivacaï NE (2 мг/мл)	-	-	Медикаменты  (Шаг 1.1.5.)
небольшой 3D-флуоресцентный криомикротом;	Изготовление на заказ		Small-3D-FICS (Шаг 4.2.2)
Спонгостан	Ethicon	MS0005	Спонгостан (Шаг 1.4.6.)
Хирургический микроскоп	Euromex Microscopen B.V.	NZ.1903-B	Микроскоп для операции (Шаг 1.2. 2.1.1.)
Хирургические ножницы	Браун-Эскулап	BC303R	Хирургические ножницы (Шаг 1.2.2 и 2.3.2.)
Насос для шприцев (для шприцев объемом 1 мл)	Аппарат Хаварда	70-2208	Шприцовый насос объёмом 1 мл (Шаг 2.5.6.)
Резьба, 100 м,   4/0 1.5	Ббраун	F1134035	Нити 4/0.15 (Шаг 2.4.3.)
Мыши TIE2-GFP	Лаборатория Джексона, Бар-Харбор, США, запас No 003658
Ультрачистый пыленосец	Торлабы	CA6-EU	Сжатый воздух (Шаг 1.2.5.)
Universal Polymer Clear	Sun Medical	T058E	Компонент суперклея (Шаг 1.3.1).