Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях Запись пептидергических нейронов гипоталамуса у личинок данио-рерио с помощью целцелого клеточного патча

788 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68943

⸱

22 августа 2025 г.

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Shanghai University, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен протокол регистрации in vivo электрической активности пептидергических нейронов гипоталамуса с использованием цельноклеточной электрофизиологии у интактных личинок данио-рерио.

Аннотация

Гипоталамус — это древняя область мозга, которая регулирует различные аспекты физиологии и поведения, включая сон и бодрствование, аппетит, энергетический гомеостаз, тревогу, депрессию и социальное взаимодействие. Определенные популяции нейронов в гипоталамусе оказывают свое воздействие посредством высвобождения нейротрансмиттеров и нейропептидов. Запись патч-зажима для целых клеток является незаменимым подходом для изучения роли этих факторов в синаптической передаче и функционировании мозга. Тем не менее, получить доступ к нейронам гипоталамуса для электрофизиологических записей у интактных млекопитающих сложно из-за их расположения глубоко в мозге. В результате наше понимание внутренних свойств и физиологических функций нейронов гипоталамуса ограничено. Личинки данио-рерио являются полезной альтернативной моделью для изучения нейронов гипоталамуса благодаря своему прозрачному и маленькому, но хорошо сохранившемуся позвоночному мозгу. Здесь мы представляем протокол для записи in vivo целоклеточного патча нейронов гипоталамуса у интактных личинок рыбок данио. Используя эту технику, мы можем записывать пептидергические нейроны в гипоталамусе, изучать реакцию этих нейронов на сенсорные стимулы и исследовать их влияние на нижестоящие нейроны. Таким образом, этот экспериментальный метод обеспечивает полезный подход к изучению физиологических функций нейропептидергических нейронов гипоталамуса у интактных животных.

Введение

В качестве популярной модели позвоночных животных, данио-рерио (Danio rerio) широко используются в исследованиях в области нейробиологии и имеют ряд преимуществ:1. Их набор генов и архитектура мозга высоко консервативны у млекопитающих, и они обладают богатым поведенческим репертуаром, что делает их полезными для изучения генетических и нейронных механизмов, лежащих в основе таких поведенческих процессов, как сон, тревога, депрессия и социальное взаимодействие.. Их небольшие размеры и низкие затраты на обслуживание делают их идеальными для высокопроизводительного скрининга генов или лекарств, направленных на лечение психоневрологических заболеваний 7,8. Наконец, оптическая прозрачность личинок данио-рерио в сочетании с передовыми методами светового микроскопа и наличием нескольких флуоресцентных репортеров делает их особенно подходящими для мониторинга нейронной и астроглиальной активности при клеточном разрешении по всему мозгу 9,10,11.

Гипоталамус рыбок данио, расположенный глубоко в вентральном промежуточном мозге, анатомически и молекулярно консервативен с гипоталамусом млекопитающих, но на 2-3 порядка меньше, что обеспечивает более простую систему для изучения функции гипоталамуса12. Нейроны гипоталамуса образуют обширные синаптические связи с многочисленными областями мозга, включая таламус, ствол мозга, гипофиз и конечный мозг, через которые они регулируют физиологический гомеостаз, нейроэндокринную сигнализацию и вегетативное поведение13,14. Такая модуляция поведения и физиологии в значительной степени зависит от нейропептидов, которые представляют собой короткоцепочечные аминокислоты, которые действуют путем связывания с рецепторами, связанными с G-белком (GPCR)15. В отличие от быстродействующего высвобождения аминокислотных нейромедиаторов в синапсе, нейропептиды могут диффундировать на большие расстояния посредством объемной передачи и опосредуть медленные модулирующие эффекты на синаптическую передачу ивозбудимость нейронов.

Недавние исследования на рыбках данио раскрыли различные функции нейропептидов гипоталамуса с помощью междисциплинарных подходов, таких как визуализация кальция всего мозга, секвенирование РНК отдельных клеток, высокопроизводительный поведенческий анализ и картирование нейронных цепей 4,12,17,18. Эти новые методы изменили нашу способность характеризовать клеточное разнообразие в больших масштабах, связывать молекулярные механизмы с функциями нейропептидов на уровне цепей и картировать нейронные цепи, лежащие в основе конкретного поведения. Тем не менее, эти подходы остаются ограниченными в своей способности разрешать быструю физиологическую динамику и точные синаптические механизмы, лежащие в основе функции нейропептида.

Метод патч-зажима, разработанный Неером и Сакманом, остается золотым стандартом для исследования физиологии нейронов благодаря своему беспрецедентному временному разрешению и биофизической точности, позволяющей напрямую измерять флуктуации мембранного потенциала, синаптические токии динамику ионных каналов. Этот метод особенно бесценен для изучения нейропептидергических клеток, характерные для которых паттерны взрыва и нейромодулирующие влияния требуют прямых электрофизиологических измерений для полного понимания их роли в поведении и гомеостазе 15,16,23.

Здесь мы разработали оптимизированный протокол, который позволяет надежно записывать целые клетки личиночных пептидергических нейронов гипоталамуса данио-рерио, несмотря на технические проблемы, связанные с глубоким анатомическим расположением этих нейронов. Эта методология обеспечивает прямой доступ к электрической активности этих клеток, позволяя детально исследовать их реакцию на визуальные и слуховые стимулы (рис. 1). Интегрируя электрофизиологию с оптогенетикой, мы можем точно охарактеризовать функциональную связь между цепями гипоталамуса и нижележащими нейронами (рис. 2 и рис. 3), облегчая изучение нейропептидов в физиологическом гомеостазе и поведенческом контроле. Этот подход устраняет критический пробел в исследованиях в области нейробиологии, позволяя одновременно изучать функцию нейронов гипоталамуса на биофизическом, клеточном и кольцевом уровнях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию (IACUC) в Шанхайском университете (протокол для животных YS 2025-169) и IACUC в Калифорнийском технологическом институте (протокол для животных 1836). Данио рерио с 5 по 7 день после оплодотворения (ДПФ) кормили коловратками и использовали для экспериментов. На этой стадии развития пол не определяется. Взрослые рыбки данио на перламутровом фоне [mitfa(w2/w2)]24 использовались для разведения.

1. Решения и рецепты

  1. Готовят среду Е3, содержащую 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2 и 0,33 мМ MgSO4. Отрегулируйте раствор по NaOH до pH 7,2. Хранить при комнатной температуре для использования в течение 1 месяца.
  2. Приготовьте внеклеточный раствор, содержащий 134 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 2,1 мМ CaCl2, 1,2 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES и 10 мМ глюкозу. Осмоляльность внеклеточного раствора составляет ~290 мОсмоль L-1. Отрегулируйте раствор по NaOH до pH 7,8. Хранить при температуре 4 °C для использования в течение 1 месяца.
  3. Приготовьте внутриклеточный раствор, содержащий 100 мМ K-глюконата, 10 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ Mg-АТФ, 0,3 мМ Na-GFP, 10 мМ HEPES и 10 мМ EGTA. Осмоляльность внутриклеточного раствора составляет ~280 мОсмоль L-1. Отрегулируйте раствор с помощью KOH до pH 7,4. Аликвот 100 мкл внутреннего раствора в микрофуговые пробирки и хранить при -20 °C для использования в течение 1 года.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление Mg-АТФ и Na-ГТФ рекомендуется для длительной и стабильной записи. Внутриклеточный раствор необходимо фильтровать через мембрану толщиной 0,22 мкм, которая удаляет твердые частицы и микробные загрязнители, которые могут нарушить формирование уплотнения или привести к засорению пипетки.
  4. α-бунгаротоксин: растворить 1 мг α-бунгаротоксина в 1 мл среды Е3 до конечной концентрации 1 мг/мл. Распределите 20 мкл раствора в микрофуговые пробирки и храните при -20 °C для использования в течение 1 года.
  5. Агароза с низкой температурой плавления: 0,75 г агарозы растворить в 50 мл среды Е3 в стеклянном флаконе до конечной концентрации 1,5%. Нагрейте смесь в микроволновой печи до тех пор, пока агароза не расплавится и раствор не появится прозрачным и однородным. Растопленную агарозу выдержать при температуре 42-45 °C на водяной бане для использования в течение 1 месяца.

2. Приготовление и препарирование рыбок данио

  1. Поместите одиночных самцов и самку взрослых рыб, содержащих желаемый трансген, например, Tg(hcrt:RFP) рыбу 25, в брачный аквариум и разделите их прозрачным разделителем на ночь. Утром второго дня снимите разделитель, чтобы дать возможность рыбам размножиться. Соберите оплодотворенные эмбрионы на дне аквариума и верните взрослых рыб в их домашние аквариумы к началу дня.
  2. Вырастите эмбрионы в чашке Петри диаметром 9 см со средой Е3, содержащей 0,0005% метиленового синего. Поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 28,5 °C с циклом «свет:темнота» в 14:10 ч. Меняйте решение E3 каждый день.
    Метиленовый синий в среде Е3 используется для предотвращения роста грибков до 3 дней после оплодотворения (dpf), но его заменяют только средой E3 при 3 dpf, поскольку метиленовый синий может влиять на клеточный метаболизм и функцию митохондрий на более позднихстадиях развития.
  3. Экранируйте личинок рыб под эпифлуоресцентным стереомикроскопом с максимальным увеличением (~115x), начиная примерно с 3 dpf. Поместите отдельных рыб в капли воды (больше размера их тела), чтобы облегчить сортировку. Рыб старше 3 дпф обезболить рыб 3 мл среды Е3, содержащей 0,01% трикаина, для подавления спонтанной двигательной активности. Собирают личинки с яркой экспрессией флуорофоров в гипоталамусе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с трикаином надевайте нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Избыток трикаина должен быть утилизирован как химические отходы в соответствии с протоколами для животных.
  4. После скрининга немедленно промойте трикаин с помощью среды Е3 и поместите этих личинок обратно в инкубатор. Добавьте ~5 мл питательного раствора, содержащего коловраток, в чашку Петри, начиная с 5 dpf до дня эксперимента. Меняйте раствор Е3 и кормите рыб коловратками каждый день.
  5. При 5-7 dpf собирайте личинок рыб, которые выглядят здоровыми и проявляют активную локомоцию. Переложите их в небольшую чашку Петри (3,5 см в диаметре) с помощью стеклянной пипетки.
  6. Удалите воду вокруг рыбы и добавьте 20 мкл 1 мг/мл α-бунгаротоксина в рыбу на ~30 с. Затем промойте препарат, добавив в чашку Петри ~3 мл среды Е3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторный халат при работе с α-бунгаротоксином. Избыток α-бунгаротоксина должен быть утилизирован как химические отходы в соответствии с протоколами для животных.
  7. Накройте чашку Петри алюминиевой фольгой, чтобы рыба оставалась в темноте и постепенно становилась парализованной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: α-бунгаротоксин является блокатором ацетилхолиновых рецепторов, который специфически действует на нервно-мышечное соединение, тем самым парализуя рыб, не влияя на нервную систему. Рыбы все еще могут ощущать раздражители окружающей среды, и функция мозга нормализована после паралича 9,27.
  8. Проверьте наличие паралича через ~15 минут с помощью стереомикроскопа и выберите парализованную рыбу, у которой нормальное сердцебиение и сильная циркуляция крови в мозге и теле.
  9. Переложите рыбу в изготовленную на заказ камеру для записи, которая представляет собой чашку Петри диаметром 35 мм с отверстием диаметром 10 мм в центре и стеклянным покровным стеклом размером 20 x 20 мм, приклеенным на дно, чтобы закрыть отверстие. Удалите воду и добавьте ~200 μл 1,5% легкоплавкой агарозы.
  10. Расположите рыбу спинной стороной вверх в агарозе с помощью щипцов (Дюмон #5). Когда агароза полностью застынет, добавьте внеклеточный раствор, чтобы покрыть агарозу. Для полного застывания агарозы требуется 5-10 минут.
  11. Разрежьте и удалите агарозу над головой рыбы с помощью микроножа. Затем сделайте небольшой разрез на коже над желудочком мозга между тектумом зрительного нерва и мозжечком с помощью стеклянной микропипетки с отверстием наконечника ~1 мкм для пипетки, продвигающейся в мозг на следующем этапе.
  12. Удалите остатки ткани или сгустки крови вокруг отверстия для вскрытия с помощью пипетки из битого стекла.

3 Запись патч-зажима для целых клеток

  1. Подготовьте записывающие микропипетки с отверстием наконечника ~1 мкм и сопротивлением ~20 МОм с использованием боросиликатных капилляров в день эксперимента. Храните вынутые микропипетки в контейнере и используйте их в тот же день, чтобы предотвратить загрязнение.
  2. Включите компьютер, ПЗС-камеру, монитор, усилитель, дигитайзер, микроманипулятор и сопутствующее программное обеспечение. Усилитель и дигитайзер должны быть включены перед открытием программного обеспечения.
  3. Осторожно переместите рыбу в электрофизиологическую установку, где будет проведен эксперимент с зажимом пластыря.
  4. Перфузируйте рыб кислородосодержащим внеклеточным раствором со скоростью ~2 мл в минуту с помощью перистальтического насоса для поддержания здоровья рыб и жизнеспособности клеток.
  5. Переместите записывающую камеру с помощью транслятора X-Y (изготовленного на заказ), чтобы центрировать рыбу в поле зрения объектива 4x под вертикальным микроскопом.
  6. Переключитесь на 60-кратный объектив и переместите транслятор, чтобы визуализировать целевую область гипоталамуса. Отрегулируйте дифференциальный интерференционный контраст Номарского (DIC) с инфракрасным светом 900 нм, чтобы получить наилучшую визуализацию ячеек.
  7. Включите источник света, возбуждающий флуоресценцию (например, ртутную лампу) и используйте его для визуализации флуоресцентных нейронов в гипоталамусе. Найдите здоровые нейроны, которые демонстрируют яркую флуоресценцию и четкие клеточные границы, что часто указывает на хорошее клеточное здоровье и способствует высококачественной электрофизиологической записи.
  8. Медленно заполните записывающую микропипетку внутриклеточным раствором с помощью тонкого наконечника микрозагрузчика.
  9. Прикрепите электрод к днищу усилителя и затяните ручку, чтобы предотвратить утечку воздуха. Подайте небольшое положительное давление (~150-200 мБар) на внутреннюю часть микропипетки через трубку, соединенную с держателем, что предотвращает попадание загрязнений на границе раздела воздух-раствор на наконечник электрода.
  10. Опустите микропипетку в раствор для ванны с помощью микроманипулятора в быстром режиме и расположите наконечник микропипетки над рассеченным отверстием под объективом 4x.
  11. Переключите микроманипулятор в медленный режим, а объектив измените на 60-кратный. Медленно проведите кончик стеклянной пипетки через отверстие для рассечения и вдоль желудочка между двумя тектальными полушариями.
  12. Подведите наконечник пипетки к целевой флуоресцентной ячейке, видимой с помощью DIC и флуоресценции. Как только кончик пипетки соприкасается с клеточной мембраной, образуется небольшое углубление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации глубоких тканей, таких как гипоталамус, используется 900 нм IR-DIC вместе с поляризатором и фильтрами анализатора, которые точно настроены для IR-DIC.
  13. Быстрое сброс положительного давления при соприкосновении наконечника с ячейкой позволяет ячейке образовывать уплотнение с пипеткой. Одновременно с этим подайте кратковременное отрицательное давление через трубку, подключенную к держателю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение сопротивления в программном обеспечении должно быстро увеличиться до > 1 ГОм, что указывает на образование высокопрочного уплотнения. Когда флуоресцентная гипоталамическая клетка успешно регистрируется, на кончике регистрирующей микропипетки должна быть флуоресцентная клеточная мембрана.
  14. Зажмите ячейку на -60 мВ и подождите 1-2 минуты, пока базовый уровень и сопротивление доступа не стабилизируются. Подайте короткий электрический импульс или легкое отсасывание ртом, чтобы разорвать клеточную мембрану под наконечником микропипетки.
  15. Компенсация емкостного тока и последовательного сопротивления в конфигурации электрофизиологического программного обеспечения. Отбросьте данные, если последовательное сопротивление превышает 100 МОм и изменяется > 20% при записи.
  16. Подайте импульс напряжения 1 с -10 мВ в режиме напряжения для контроля собственного сопротивления мембраны до и после экспериментов. Выбросьте ячейку, если сопротивление мембраны или мембранный потенциал сильно варьируются.
  17. Первая запись в режиме напряжения-клещи (VC), когда ячейка удерживается на отрицательном значении. После установления стабильной записи при необходимости переключитесь в режим токовых клещей (IC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гига-уплотнение может быть нестабильным вскоре после разрыва, поэтому зажим ячейки при напряжении -60 мВ в режиме VC в течение нескольких минут в начале эксперимента может обеспечить лучшие клеточные условия.
  18. Проведите анализ электрофизиологических данных и обнаружение спайков в автономном режиме с помощью MATLAB после завершения эксперимента.
  19. После экспериментов усыпьте личинок рыб с использованием 1,5% гипохлорита натрия (NaClO) и утилизируйте их в соответствии с протоколами ухода за животными в учреждениях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этой рукописи мы представляем усовершенствованную технику записи in vivo цельноклеточного патч-clamp для исследования нейронов гипоталамуса у интактных рыбок данио, уделяя особое внимание гипокретиновым (Hcrt) нейронам.

Как показано на рисунке 1, наша методология позволяет проводить прямые электрофизиологические записи от этих нейронов глубоко в мозге у интактного животного (рисунок 1A), преодолевая ограничения традиционных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь протокол позволяет записывать пептидергические нейроны в гипоталамусе личинки данио-рерио, одной из самых глубоких и технически сложных областей мозга. Из-за сложности, присущей этому препарату, успешная запись с помощью патч-клэмпа требует тщательного внимания к нескольким критическим параметрам, а именно качеству пипетки, технике подхода, чистоте раствора и здоровью тканей. Эти факторы в совокупности определяют вероятность достижения и поддержания стабильных записей гиг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов и нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Даниэля Вагенаара за его помощь в разработке устройств для оптогенетических экспериментов. Эта работа была поддержана грантами R35 NS122172 и R34 NS126800 от Национальных институтов здравоохранения для D.A.P., а также Шанхайской программой привлечения зарубежных талантов для R.Z.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
УсилительАксон700В
Капилляры из боросиликатного стеклаСаттерБФ100-58-10
ПЗС-камераDage-MTIИК-1000
Компьютеры для электрофизиологической регистрацииЛощинаТочность 3660
ДиджидатаАксон1440А
Клетка ФарадеяЗаказной
ЩипцыФ.С.Т.Дюмон #5
ИнкубаторЛонройГЗП-150Б
Мембранный фильтрМиллипора СигмаSLGV004SL
Микро ножФ.С.Т.10318-14
ОбъективныйОлимпMplan 5X/0.1; UMPlanFI/IR 60X/0,9 Вт
Перистальтический насосДлиннееБТ100-1Л
Держатель для пипетокНарисигэН-7для вскрытия
СъемникИнструмент Саттера-97
Стереомикроскоп для флуоресцентного скрининга и диссекцииОлимпСЗХ16
СтимуляторА.М..ИМастер8
Трехмерный микроманипуляторИнструмент СаттераМПК-325
Вертикальный инфракрасный ДИК микроскопОлимпBX51WI
Стол для виброизолятораТМС61-541-06
ВидеомониторСАНСПОСП-717
Водяная баняИхэнГВС-12
Транслятор X-YЗаказной

Ссылки

  1. Bradbury, J. Small fish, big science. PLoS Biology. 2, e148(2004).
  2. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
  3. Oikonomou, G., Prober, D. A. Attacking sleep from a new angle: Contributions from zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 44, 80-88 (2017).
  4. Lovett-Barron, M., et al. Multiple convergent hypothalamus-brainstem circuits drive defensive behavior. Nat Neurosci. 23, 959-967 (2020).
  5. Wagle, M., et al. Brain-wide perception of the emotional valence of light is regulated by distinct hypothalamic neurons. Mol Psychiatry. 27, 3777-3793 (2022).
  6. Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39(2015).
  7. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14, 721-731 (2015).
  8. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. 4, 35-44 (2005).
  9. Ahrens, M. B., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485, 471-477 (2012).
  10. Mu, Y., et al. Glia Accumulate Evidence that Actions Are Futile and Suppress Unsuccessful Behavior. Cell. 178, 27-43 (2019).
  11. Yang, E., et al. A brainstem integrator for self-location memory and positional homeostasis in zebrafish. Cell. 185, 5011-5027.e20 (2022).
  12. Machluf, Y., Gutnick, A., Levkowitz, G. Development of the zebrafish hypothalamus: Hypothalamic neuronal specification. Ann N Y Acad Sci. 1220, 93-105 (2011).
  13. Tessmar-Raible, K., et al. Conserved sensory-neurosecretory cell types in annelid and fish forebrain: Insights into hypothalamus evolution. Cell. 129, 1389-1400 (2007).
  14. Bonnavion, P., et al. Hubs and spokes of the lateral hypothalamus: Cell types, circuits, and behaviour: LHA cell types and circuits. J Physiol. 594, 6443-6462 (2016).
  15. van den Pol, A. N. Neuropeptide transmission in brain circuits. Neuron. 76, 98-115 (2012).
  16. Watts, A. G. Neuropeptides and the integration of motor responses to dehydration. Annu Rev Neurosci. 24, 357-384 (2001).
  17. Lovett-Barron, M., et al. Ancestral circuits for the coordinated modulation of brain state. Cell. 171, 1411-1423.e17 (2017).
  18. Chiu, C. N., et al. A zebrafish genetic screen identifies neuromedin U as a regulator of sleep/wake states. Neuron. 89, 842-856 (2016).
  19. Chowdhury, S., et al. Brainstem neuropeptidergic neurons link a neurohumoral axis to satiation. Cell. 188, 1563-1579 (2025).
  20. Herget, U., Ryu, S. Coexpression analysis of nine neuropeptides in the neurosecretory preoptic area of larval zebrafish. Front Neuroanat. 9, 1-11 (2015).
  21. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  22. Zhang, R., Du, J. In vivo whole-cell patch-clamp recording in the zebrafish brain. , Springer. New York. (2016).
  23. Barrios, J. P., et al. Hypothalamic dopamine neurons control sensorimotor behavior by modulating brainstem premotor nuclei in zebrafish. Curr Biol. 30, 4606-4618 (2020).
  24. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  25. Liu, J., et al. Evolutionarily conserved regulation of hypocretin neuron specification by Lhx9. Development. 142, 1113-1124 (2015).
  26. Nipu, N., et al. Methylene blue at recommended concentrations alters metabolism in early zebrafish development. Commun Biol. 8, 1-11 (2025).
  27. Du, W., et al. The locus coeruleus modulates intravenous general anesthesia of zebrafish via a cooperative mechanism. Cell Rep. 24, 3146-3155.e3 (2018).
  28. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, 1-22 (2015).
  29. Lin, J. Y., et al. ReaChR: A red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nat Neurosci. 16, 1499-1508 (2013).
  30. Zhang, R., Wei, H., Xia, Y., Du, J. Development of light response and GABAergic excitation-to-inhibition switch in zebrafish retinal ganglion cells: Functional development of zebrafish retinal ganglion cells. J Physiol. 588, 2557-2569 (2010).
  31. Zhang, R., Du, W., Prober, D. A., Du, J. Müller Glial cells participate in retinal waves via glutamate transporters and AMPA receptors. Cell Rep. 27, 2871-2880.e2 (2019).
  32. Kole, M. H. P., Stuart, G. J. Signal processing in the axon initial segment. Neuron. 73, 235-247 (2012).
  33. Petersen, C. C. H. Whole-cell recording of neuronal membrane potential during behavior. Neuron. 95, 1266-1281 (2017).
  34. Jin, K., et al. Brain-wide cell-type-specific transcriptomic signatures of healthy ageing in mice. Nature. 638, 182-196 (2025).
  35. Scala, F., et al. Phenotypic variation of transcriptomic cell types in mouse motor cortex. Nature. 598, 144-150 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivo
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.