Методическая статья

Аэробные испытания материалов на биоразложение с использованием натурального морского инокулюма морской воды и респирометра замкнутого цикла

DOI:

10.3791/68950

⸱

24 октября 2025 г.

 ,  ,  , 
1School for Marine Science and Technology, University of Massachusetts, 2Francis College of Engineering, University of Massachusetts

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает стандартную операционную процедуру тестирования потенциально биоразлагаемых материалов, как синтетических, так и природных в аэробных условиях с использованием природного инокулята морской воды и автоматизированной системы респирометрии с замкнутым контуром.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Правильная оценка биоразлагаемых материалов зависит от широкого внедрения стандартных методов испытаний. Несмотря на существование таких методов, возможности тестирования остаются ограниченными, что обусловлено стоимостью и временем начала создания новых лабораторий. Этот модифицированный протокол скрининга основан на стандарте ASTM International D6691-24a, Стандартном методе испытаний для определения аэробной биодеградации пластиковых материалов в морской среде определенным микробным консорциумом или природным инокулюмом морской воды. Он оценивает биоразложение материалов в морской среде, сравнивая результаты с положительными и отрицательными контрольными показателями, и использует натуральный инокулюм морской воды с добавлением аммония и фосфата для предотвращения ограничения питательных веществ. Материалы подвергаются воздействию этой обогащенной питательными веществами морской воды и инкубируются при 30 °C. Респирометр Micro-Oxymax измеряет выработку биогаза (углекислого газа, CO2) с течением времени. Степень минерализации (биодеградации) определяется путем расчета доли углерода материального происхождения, преобразованного в биогаз-углерод. Процент производстваCO2 , выраженный в виде доли измеренного или теоретического содержания углерода, указывается как функция времени. Система респирометрии с замкнутым контуром включает в себя ряд корпусов реакторов, подготовленных в трех экземплярах для каждого материала, отрицательный контроль (только инокулятив морской воды) и положительный контроль (тонкослойная хроматография целлюлозы). Этот метод важен для оценки материалов в морской среде и направлен на предотвращение глобального загрязнения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пластиковые отходы представляют угрозу для морских экосистем и здоровья человека1. Растущая обеспокоенность по поводу загрязнения пластиком, а также морским мусором из любых материалов в океане подчеркивает необходимость устойчивых решений, таких как улучшенное управление отходами с истекшим сроком службы и биоразлагаемые материалы, которые легко разлагаются в морской среде. В отличие от традиционных синтетических пластиков, которые сохраняются в течение десятилетий или столетий и генерируют микропластик, накапливающийся в пищевых сетях 2,3,4, биоразлагаемые материалы, органические компоненты углерода, могут метаболизироваться доCO2 и метана (CH4) или ассимилироваться в микробную биомассу5. Таким образом, понимание биоразложения материалов в морской воде является ключом к количественной оценке и смягчению воздействия морского мусора на окружающую среду.

Биодеградация в морской среде контролируется взаимодействием пространственно-временных переменных, включая доступность света и питательных веществ, давление, температуру, микробный видовой состав, а также физико-химическую природу и структуру полимера, которые определяют скорость, степень и механизм деградации. Эти переменные представляют собой серьезную проблему для лабораторных исследований биоразложения, имитирующих морскую среду. В этой стандартной операционной процедуре (СОП) в качестве инокулюма используется природная морская вода, улавливающая присутствующее микробное сообщество in situ, и регистрируются соответствующие переменные, включая растворенные в морской воде питательные вещества, твердые частицы углерода и азота, хлорофилл, соленость, pH и температуру. Этот контролируемый лабораторный подход оптимизирует условия для стимулирования минерализации и позволяет проводить прямые измерения биоразложения, которые невозможны in situ. ASTM International D6691-24a, Стандартный метод испытаний для определения аэробной биодеградации пластиковых материалов в морской среде определенным микробным консорциумом или природным инокулюмом морской воды (далее ASTM D6691), и эта СОП были разработаны в качестве быстрого и надежного инструмента скрининга для оценки биоразлагаемости материалов 7,8,9,10.

В соответствии со стандартом ASTM D6691, скрининговым тестом на биоразлагаемость присущего полимеру, этот протокол оценивает биоразложение материалов при оптимальных условиях, 30 °C, максимальной площади поверхности измельченного образца и избытке неорганических питательных веществ (азот, 130 мг/л; фосфор, 23 мг/л)9, чтобы способствовать минерализации и предотвратить ограничение питательных веществ. В то время как скрининговые тесты дают ценную первоначальную информацию, для всесторонней оценки в естественных морских условиях могут потребоваться дальнейшие испытания, такие как прибрежные и глубоководные причалы, которые измеряют потерю веса в зависимости от времени. Поскольку эти испытания прибрежных и глубоководных швартовных устройств оценивают биодеградацию на основе потери веса в зависимости от времени10,11, исследователи должны сначала провести этот скрининговый тест, который непосредственно измеряет микробный метаболизм, прежде чем приступать к эксперименту по прибрежной и глубоководной швартовке in situ, который также является более дорогостоящим.

Стандартный метод испытаний ASTM D6691 описывает процедуры оценки аэробной биодеградации неплавающих пластиковых материалов в морской среде. Этот стандарт, наряду со стандартами спецификаций, такими как ASTM D7081 (Стандартная спецификация для неплавающих биоразлагаемых пластиков в морской среде; сосредоточенная на биоразлагаемости в водной среде, в настоящее время исключенная из ASTM и повторно голосующаяся), обеспечивает основу для сертификации экспериментальных полимеров как морских биоразлагаемых 9,12. В целом, спецификация — это согласованный стандарт ASTM International, который устанавливает требования, которым должен соответствовать материал, продукт или система. Он гарантирует, что материалы, предназначенные для биоразложения в морской среде, делают это в приемлемые сроки и не выделяют потенциально токсичные добавки, такие как красители или пластификаторы.

Основываясь на стандарте ASTM D6691, этот протокол количественно оценивает скорость и степень аэробного биоразложения материалов (экспериментального субстрата) в природной морской воде и расширяет положительные контрольные материалы (т.е. целлюлозу, крафт-бумагу, хитин/хитозан), которые исторически показали свою биоразлагаемость в морской среде 7,9,10. Цель этого метода состоит в том, чтобы провести скрининг материалов в оптимизированных условиях, чтобы увидеть, разлагаются ли материалы в морской среде. В инокулюменте используется природное микробное сообщество, присутствующее в морской воде, собранное в соответствии с конкретными рекомендациями, изложенными в ASTM. В этих рекомендациях подчеркивается необходимость использования морской воды с соленостью около 32, собранной в местах, свободных от загрязняющих веществ, таких как сточные воды, сброс химикатов или разливы нефти. В испытании используется автоматический респирометр с замкнутым контуром с корпусами реактора объемом 250 мл, поддерживаемыми при температуре 30 °C, каждый из которых содержит 75 мл морской воды и ~20 мг экспериментального или контрольного субстрата8. Минерализация (биоразложение) выражается в процентном соотношении чистого углеродного биогаза (CO2-C) по отношению к исходной добавленной массе углерода. Этот метод не учитывает ассимиляцию углерода в микробную биомассу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сбор и характеристика морской воды

  1. Определите место сбора морской воды, на которое не влияют сточные воды, химикаты, нефтяные пятна или сильное воздействие пресной воды.
  2. В месте сбора данных указывается источник данных (местоположение, широта и долгота, глубина сбора, общая глубина и температура), дата сбора проб и наблюдаемые условия воды.
  3. Собирайте и объединяйте пробы морской воды с разных глубин, с разных мест и с разных мест отбора проб, чтобы создать разнообразный состав микробного сообщества.
  4. В 20-литровой машине, выщелоченной кислотой, соберите от 10 до 20 литров морской воды с помощью большой бутылки Нискина и отвезите обратно в лабораторию.
  5. Из коробки переложите 1 л цельной пробы морской воды в выщелоченную кислотой бутылку из янтарного полиэтилена высокой плотности (ПНД) объемом 1 л для лабораторного анализа твердых частиц углерода и азота для исходных условий морской воды. Из образца объемом 1 л отфильтруйте (0,2 мкм; ацетат целлюлозы с низким содержанием азота) и соберите подобразец объемом 60 мл в полиэтиленовую бутылку, выщелоченную кислотой, для анализа растворенных неорганических и органических компонентов азота (N) и фосфора (P).
  6. Пометьте подобразцы именем проекта, идентификатором образца и датой. Измеряют концентрации NH4+ методом индофенола (4500-NH3)13,14 и уровни PO43- методом одного раствора (4500-P E)13,15. Количественное определение содержания азота и углерода в твердых частицах с использованием метода элементного анализа16. Измеряйте концентрации хлорофилла-а в соответствии с протоколами, изложенными в Parsons et al.17(10150 A, 10150 C)13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ качества воды, связанный с питательными веществами, не является обязательным. Этот протокол предполагает, что анализы проводятся сторонней лабораторией.
  7. Неплотно закройте отверстие для поддержания аэробных условий и храните морскую воду при температуре 30 °C в темноте до 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Морская вода также может аэрироваться с помощью воздушного насоса и системы барботеров.

2. Подготовка экспериментального субстрата

  1. Добавьте 10-15 г экспериментального субстрата (т.е. натуральные полисахариды, древесина, древесноволокнистые плиты, полимеры), которые могут быть в виде гранул, осколков и формованных кусочков, в 50 мл фрезерную банку из нержавеющей стали со стальным шариком диаметром 20 мм. Перед началом испытания измельчите экспериментальную подложку до равномерного размера частиц (0,10-0,25 мм).
  2. Погрузите банку для помола в жидкий азот и охрупчьте на 15 минут, пока жидкий азот не перестанет кипеть.
    ВНИМАНИЕ: Жидкий азот — это криогенная жидкость, которая может вызвать ожоги, травмы или обморожения. Прочтите и следуйте всем паспортам безопасности перед использованием. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
  3. Закрепите фрезерный стакан в шаровой мельнице и установите параметры прибора на 30 Гц и 2:30 мин, а затем нажмите «Старт». Повторите 4 раза с охлаждением в жидком азоте в течение 30 секунд между испытаниями. Если материал представляет собой полимер с низкой температурой стеклования, при необходимости выполните дополнительные циклы измельчения для получения равномерного распределения частиц по размерам.
  4. Проверьте однородность размеров и охарактеризуйте распределение частиц по размерам с помощью ситового анализа, как описано в ASTM D1921-9618. Соберите стандартные сита, охватывающие ожидаемый диапазон размеров частиц, с наименьшим размером ячеек на дне. Поместите измельченный образец на верхнее сито и закрепите стопку сит в механической встряхивателе. Перемешивайте до тех пор, пока частицы не пройдут через сетку. Соберите и взвесьте оставшийся материал с каждого сита, чтобы рассчитать распределение частиц по размерам. Используйте один и тот же набор сит для разных обработок для обеспечения сопоставимости. Запишите распределение в техническом паспорте.
  5. Определение содержания углерода в сухом весе подобразца измельченного экспериментального субстрата методом элементного анализа16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что элементный анализ проводится сторонней лабораторией.

3. Приготовление дополнительных питательных веществ для морской воды

  1. Наполните мерную колбу объемом 2 л или 4 л наполовину морской водой. Общий необходимый объем зависит от количества корпусов реактора, которые будут использоваться в эксперименте. Каждый корпус реактора будет содержать 75 мл морской воды. Если источник морской воды содержит высокие концентрации твердых органических веществ, просейте морскую воду через ячейку размером 20 мкм, чтобы исключить гетерогенное загрязнение крупными частицами.
  2. С помощью прецизионных весов с точностью до 0,001 г изготовьте весовой поддон и отвесьте 0,5 г/л хлорида аммония (NH4Cl), а затем 0,1 г/л одноосновного фосфата калия (KH2PO4) из расчета на 2 л или 4 л морской воды.
    ВНИМАНИЕ: Хлорид аммония может вызвать повреждение или раздражение глаз. Перед использованием прочтите и соблюдайте все паспорта безопасности и носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте одноосновные отходы хлорида аммония и фосфата калия в специальные контейнеры для опасных отходов в соответствии с институциональными процедурами и местными правилами. Небольшие объемы разбавленных (<1%) растворов NH4Cl и KH2PO4 могут быть пригодны для сброса в дренаж после разбавления большим количеством воды, если это разрешено учреждением и местным органом по очистке сточных вод.
  3. Добавьте неорганические питательные вещества в мерную колбу объемом 2 л или 4 л, доведите до объема с морской водой, добавьте полосу для перемешивания и перемешайте на тарелке для перемешивания, пока все соли не растворятся. Раствор должен быть прозрачным, без видимых частиц.
  4. Подобразец 20-30 мл морской воды с добавлением питательных веществ для измерения pH и солености. Отфильтруйте еще 60 мл через фильтр из ацетата целлюлозы с низким содержанием азота 0,2 мкм в полиэтиленовую бутылку с кислотным выщелачиванием для анализа растворенных неорганических N и P, следуя стандартным методам на шаге 1.5.
  5. Измерьте pH и соленость на настольном метре, следуя инструкциям производителя. Ожидается снижение pH примерно на одну единицу для полноценной морской воды из-за кислотности питательной добавки.

4. Подготовка к инкубации корпуса реактора

  1. Кислотой выщелачивают всю стеклянную посуду, включая 250 мл корпусов реактора для образцов и 75 мл объемной пипетки в 10% соляной кислоте (HCl) в течение 24 ч и 3 раза промывают деионизированной водой.
    ВНИМАНИЕ: HCl может вызвать серьезные ожоги и повреждение глаз. Прочтите и следуйте всем паспортам безопасности перед использованием. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 10% отходов HCl могут быть нейтрализованы бикарбонатом натрия для получения нейтрального раствора перед утилизацией. Выполняйте обезвреживание в соответствии с процедурами утилизации опасных отходов учреждения и применимыми местными нормами.
  2. Выщелоченные кислотой пустые корпуса реактора объемом 250 мл, крышки с портами, уплотнительные кольца с силиконовым уплотнением и завинчивающиеся крышки автоклавируются в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин до дня проведения эксперимента.
  3. Маркируйте флаконы с образцами номером/идентификатором канала, соответствующим сосудам, принимающим пробу или контрольные материалы.
  4. С помощью аналитических весов тарируйте флакон (с крышкой) и отвесьте 20 мг (± 0,1 мг) экспериментального или контрольного вещества, запишите полный считываемый вес и отложите в сторону. Повторите для всех экспериментальных и контрольных реплик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вес точен. Рекомендуется взвешивать все субстраты в один и тот же день и одним и тем же человеком.
  5. Включите инкубатор за день до добавления сосудов и установите температуру 30 °C. Включите репирометр не менее чем за 2 часа до запуска диагностики системы и калибровки датчика в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка корпуса реактора может быть продолжена, как только температура инкубатора достигнет и будет поддерживаться на уровне 30 ± 2 °C.
  6. Подготовьте спецификацию, записав идентификаторы образцов/репликации и соответствующий номер канала. Организуйте корпуса реактора и крышки в сборе (крышка с портами/уплотнительным кольцом) в порядке номера канала/идентификатора (убедитесь, что каждый сосуд имеет четкую маркировку). Проверьте уплотнительные кольца и крышки/порты, чтобы убедиться, что они чистые, сухие и неповрежденные.

5. Настройка корпусов реактора

  1. Используйте выщелоченную кислотой 75 мл объемной пипетки объемом 75 мл и моторизованный контроллер пипеток для подачи 75 мл морской воды с добавлением питательных веществ в каждый корпус реактора.
  2. Извлеките по одной одноразовой пипетке морской воды (~3 мл) с каждого судна и положите ее на чистую поверхность рядом с ней. Эта морская вода будет использоваться для промывки измельченных экспериментальных и контрольных субстратов из тарированного флакона (Рисунок 1).
  3. Переложите субстраты в соответствующие сосуды.
  4. Поместите уплотнительное кольцо на край корпуса реактора, затем поместите двухпортовую крышку прямо на уплотнительное кольцо. Закрепите уплотнительное кольцо и крышку на месте с помощью завинчивающейся крышки.
  5. Подгонка корпуса реактора к соответствующим линиям газа/конденсации. Плотно вставьте газопроводы в соответствующие входные/выпускные отверстия в крышке резервуара.
  6. Включите платформу шейкера на 0,05 x g (непрерывный режим). Проведите визуальный осмотр, чтобы убедиться, что все сосуды надежно закреплены, затем закройте дверцу инкубатора.
  7. Запишите температуру инкубатора (считывание и термисторный щуп) и атмосферное давление с помощью барометра.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Установка и подготовка судна. (A) добавление морской воды, (B) добавление образца и (C) добавление уплотнительного кольца, металлической крышки и завинчивающейся крышки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

6. Запуск системы респирометрии

  1. Запустите программное обеспечение на подключенном компьютере. Убедитесь, что система обнаруживает оборудование через соединение RS-232. Если аппаратное обеспечение не найдено, появится уведомление о том, что устройство не подключено, и программу необходимо перезапустить.
  2. В главном меню программного обеспечения выберите пункт Инструменты > Диагностика > Основные операции. Нажмите кнопку Сохранить файл журнала. Нажмите Клапаны и датчики. Программное обеспечение будет указывать PASS или FAIL для каждого теста. Приступайте к двухточечной калибровке датчика CO2 только в том случае, если оба теста пройдены.

7. Калибровка датчика CO2

  1. Подсоедините колонку с натриевой известью к азотному порту на задней панели насоса для отбора проб, чтобы удалить окружающий CO2 для калибровки нуля. Убедитесь, что натриевая известь выглядит мелово-белой и не обесцвечена (например, розовым или фиолетовым).
  2. Выберите Инструменты > калибровке. Нажмите «Начать калибровку» в правом нижнем углу. При появлении запроса отрегулируйте расход пробы до 0,5 л/мин с помощью управления насосом для отбора проб на передней панели. Нажмите OK.
  3. Когда таймер достигнет нуля, нажмите кнопки смещения вверх и вниз на датчике CO2 , чтобы отрегулировать показания на экране до 0,000 (или как можно ближе). Значения станут зелеными, когда окажутся в допустимом диапазоне. Нажмите Next Gas.
  4. При появлении запроса подключите баллон с калибровочным газом к калибровочному порту на задней панели насоса для отбора проб. Отрегулируйте давление калибровочного газа на выходе до 5 фунтов на квадратный дюйм изб. Убедитесь, что избыточный газ проходит через Т-образный фитинг, благодаря чему пользователь может слышать и чувствовать газ рядом с фитингом, прежде чем нажать OK.
  5. Когда таймер достигнет нуля, нажмите кнопки Вверх и Вниз на датчике CO2 , чтобы отрегулировать показания на экране до 2.700 (или как можно ближе). Значения станут зелеными, когда окажутся в допустимом диапазоне. Нажмите Next Gas, чтобы завершить калибровку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации калибровочных газов определяются по сертифицированной первичной стандартной газовой смеси, как указано в сертификате анализа поставщика.

8. Настройка эксперимента в программном обеспечении

  1. Выберите Эксперимент > Настройка. Введите номера начальных и конечных каналов из выпадающих меню в зависимости от занятых каналов.
    1. Установите для параметра Порог обновления (%) значение 0,50, для параметра Интервал обновления — значение Н.А., а для параметра Окно обновления (с) — значение Авто.
    2. В разделе «Настройка разного» установите флажок «Датчики продувки»; убедитесь, что не выбраны параметры Автоматическое измерение объема, O2 Положительное потребление и Включить режим открытого потока.
    3. Установите для параметра Интервал выборки (часы) значение 8.00, а для параметра Продолжительность эксперимента (часы) значение N.A. При необходимости установите единицы измерения газа и времени.
    4. Если для коррекции температуры инкубации используется первичный температурный зонд, убедитесь, что не выбран параметр «Вручную вводить температуру камеры». Установите флажок «Режим вентиляции» и убедитесь, что режим «Слив» не выбран.
    5. Убедитесь, что режим анаэробной вентиляции не выбран.
  2. Выберите Настройка камеры. Введите описательные метки каналов (например, NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
  3. Нажмите «Утилиты». Щелкните Ячейки в столбце EN только для занятых каналов. Нажмите Ограничение. Программное обеспечение укажет PASS или FAIL для каждого канала. Приступайте только в том случае, если все тесты на ограничение пройдены.
  4. Нажмите «Объем», чтобы измерить объем свободного пространства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем свободного пространства равен объему воздуха в корпусе реактора для образца и трубках с замкнутым контуром. Убедитесь, что объемы являются разумными для размера судна и длины трубок.
  5. Нажмите кнопку Утечка. Программное обеспечение укажет PASS или FAIL для каждого канала в зависимости от громкости свободного пространства. В случае сбоя канала выполните следующие действия.
    1. Убедитесь, что уплотнительное кольцо чистое, не содержит частиц и волокон и правильно расположено между ободом сосуда и металлической крышкой.
    2. Затяните завинчивающуюся крышку. Проверьте соединение и трубки на входных/выходных портах и фитингах. Обрежьте изношенные или деформированные концы трубок острым лезвием, чтобы обеспечить чистый прямой срез.
    3. Если канал продолжает выходить из строя, замените уплотнительное кольцо на новое, совместимое, указанное производителем.
  6. Нажмите «Объем », чтобы повторно измерить объем свободного пространства. Нажмите кнопку Выйти. Убедитесь, что столбец «Объем» на вкладке «Настройка камеры» заполнен для всех занятых каналов.
  7. В главном меню выберите «Инструменты» > «Сервисное меню». Убедитесь, что первичный температурный щуп, измеряющий температуру инкубатора, находится на уровне 30 °C ± 2 °C и стабилен.
  8. Нажмите кнопку Выполнить. Сохраните файл, используя описательное имя, содержащее дату (например, 030325PositiveControlValidation). Запишите имя файла в техническом описании.
  9. Выберите Эксперимент > Просмотреть > Графики, чтобы просмотреть графики в реальном времени. Производство биогаза проявляется в положительных показателях производстваCO2. Отрицательный контроль может колебаться около нуля; Однако их средний показатель должен быть нулевым или положительным.
  10. Если система включает в себя конденсационные осушители воздуха, ведите ежедневный журнал видимой конденсации в трубках. Осторожно перемешивайте трубки, чтобы предотвратить засорение и при необходимости обеспечить дренаж.
  11. Обновляйте файлы данных (текстовые файлы ASCII) в конце каждого интервала выборки. Данные, включая температуру, % газа (газовый состав), скорость и накопление, могут быть загружены в различные другие программные пакеты во время эксперимента или в его завершении.
    1. Чтобы открыть .dat файлы в таблице, запустите Excel и выберите «Файл > открыть». Перейдите в папку, содержащую файл .dat. В выпадающем меню типа файла выберите «Все файлы » и выберите нужный файл.
    2. Когда мастер импорта текста попытается это сделать, выберите тип файла «С разделителями » и нажмите «Далее».
    3. В разделе «Разделители» установите флажок «Запятая». Убедитесь, что не выбраны другие разделители. В окне предварительного просмотра должны отображаться данные, разделенные на столбцы. Нажмите кнопку Готово, чтобы загрузить данные в таблицу.
    4. Сохраните файл в формате .xlsx или .csv для дальнейшего анализа и архивирования.
  12. Периодически анализируйте данные, чтобы убедиться в согласованности репликаций лечения. Стандартная ошибка повторения лечения должна составлять менее 5% от среднего кумулятивного производстваСО2 . Повторите тесты, не достигнув этого порога.
  13. Нажмите кнопку Стоп, когда инкубация будет завершена.
    1. Инкубация может длиться 10-90 дней. Если исследуемые материалы обладают высокой биоразлагаемостью, прекратите инкубацию, когда совокупная продукцияCO2 выйдет на плато, или продлите ее, если через 90 дней не наблюдается деградации.
    2. Эксперименты завершаются при отсутствии чистой добычи газа в течение как минимум 5 суток как в контрольных, так и в испытательных судах. Отсутствие чистой продукции определяется как изменение процента биоразложения менее чем на 1% в течение 5 дней.
  14. Выключите систему или подготовьтесь к следующему эксперименту.

9. Разбор эксперимента

  1. Запись температуры инкубатора (показания термисторного зонда и инкубатора). Отсоедините трубки от корпусов реактора от респирометра и взвесьте каждый корпус реактора с помощью прецизионных весов. Запишите вес, чтобы определить, произошла ли потеря веса/воды в течение инкубационного периода.
  2. Подобразец 20-30 мл морской воды из каждого корпуса реактора для измерения pH и солености и сравнения этих значений с значениями, зарегистрированными на шаге 3.4, для проверки стабильности во время инкубации. Отфильтруйте еще 60 мл через фильтр с низким содержанием азота и ацетата целлюлозы 0,2 мкм в полиэтиленовую бутылку с кислотным выщелачиванием для анализа растворенных неорганических N и P в соответствии со стандартными методами, описанными на шаге 1.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточные пробы морской воды могут быть отфильтрованы для удаления остатков пластика, разбавлены для снижения концентрации питательных веществ и утилизированы путем сброса сточных вод в соответствии с институциональными и местными нормами.
  3. Промойте сосуды, уплотнительные кольца, металлические крышки и завинчивающиеся крышки водопроводной водой. Поместите стеклянную посуду в ванну с кислотой 10% HCl не менее чем на 24 часа. Автоклав и хранить накрытым алюминиевой фольгой для следующей инкубации

10. Расчет процента биоразложения

  1. Рассчитайте общее содержание углерода в экспериментальном/контрольном субстрате следующим образом:
    figure-protocol-2
    где % C (содержание углерода) определяется с помощью элементного анализа.
    Примечание: Общий углерод в экспериментальных и контрольных субстратах может претерпевать следующие биохимические преобразования в ходе аэробной инкубации:
    C + O2 → CO2
    Каждый ммоль (12 мг) органического углерода из экспериментального/контрольного субстрата может быть преобразован в 1 ммоль газообразногоCO2. Один ммоль полученного газа занимает 22,4 мл при стандартной температуре и давлении (STP).
  2. Рассчитайте процент биоразложения следующим образом:
    figure-protocol-3
    где Cg = количество газообразного углерода, полученного из экспериментального/контрольного субстрата и отрицательного контроля (только инокулюм морской воды), ммоль, а Ci = количество углерода в добавленном экспериментальном субстрате, ммоль.
  3. Рассчитайте стандартную ошибку se процента биоразложения следующим образом:
    figure-protocol-4
    где n1 и n2 = количество повторяющихся экспериментальных/контрольных субстратов и корпусов реактора с отрицательным контролем, соответственно, и s = стандартное отклонение общего количества производимого газообразного углерода.
  4. Рассчитайте 95% доверительные пределы (CL) следующим образом:
    figure-protocol-5
    где t = значение t-распределения для 95% вероятности с (n1 + n2 − 2) степенями свободы, таким образом, n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. Окончание протокола

  1. После завершения расчетов и анализа данных обобщите результаты в итоговом отчете или внесите их в общую базу данных в соответствии с проектными или институциональными планами управления данными. Убедитесь, что все материалы утилизированы в соответствии с рекомендациями учреждения по утилизации опасных отходов, а все оборудование очищено и помещено на хранение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлены результаты испытаний на биодеградацию морской среды. Биоразложение оценивалось для каждого образца путем измерения доли углерода, преобразованного в углекислый газ. Графики кумулятивной, скоростной и процентной биодеградации обычно демонстрируют фазу запаздывания, за которой следует фаза роста и, в конечном итоге, плато. Время и величина этих фаз зависят от материала образца, условий эксперимента и состава инокулюма морской воды.

Морская вода, соб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективность положительного контроля определяет достоверность теста. Требуется не менее 70% биоразложения легко разлагаемого в море положительного контрольного субстрата (например, аналитической целлюлозы, крафт-бумаги и т.д.) на основе его теоретического максимального выхода газа. Этот эталон подтверждает благоприятные условия и достаточную микробную активность в естественной морской воде во время инкубации. Недостижение этого порогового значения указывает на потенциальную проблему с п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Columbus Instruments и Лабораторию биоразлагаемости в Школе морских наук и технологий Массачусетского университета в Дартмуте за техническую поддержку и доступ к объектам. Финансирование системы микро-оксимаксной респирометрии Columbus Instruments и запуска лаборатории было предоставлено компаниями PrimaLoft и Massachusetts Technology Collaborative.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.2 и микро; M, целлюлозно-ацетатный фильтр 47 ммГеотехнический геофильтр83100056Фильтруйте морскую воду
100 мл Объёмная пипетаThermo Fisher Scientific, Fisherbrand13-650-2UКласс A; вымывается кислотой и промывается деионизированной водой
Стеклянные стаканы объёмом 100-600 млThermo Fisher Scientific, Fisherbrand50-194-5690Класс A; вымывается кислотой и промывается деионизированной водой
Фрезерные шары диаметром 20 ммРетч53680062Нержавеющая сталь. Используется с фрезерной банкой для криогенного помолования полимера
Мельные банки объемом 50 млРетч14620216Нержавеющая сталь. Используется с мельничными шарами Mixer Mill 400 и 20 мм для криогенного помола полимера
75 мл Объёмная пипетаThermo Fisher Scientific, Fisherbrand13-650-2TКласс A; вымывается кислотой и промывается деионизированной водой
Система воздушного насоса и пузырьковТетра77846Аэрируйте морскую воду во время прединкубационного равновесия
Алюминиевая фольгаФишербранд01-213-100Крышка для автоклава и чистого хранения
Хлорид аммония (NH4Cl)Thermo Fisher Scientific, Fisher ChemicalA661-500Всплеск питательных веществ в морской воде
Аналитический балансМеттлерAT201Для взвешивания экспериментальных и контрольных субстратов
АвтоклавТуттнауэрMFI-TTN-3870EAДля стерилизации сосудов и сборок крышек
Базовый Micro-Oxymax 120VAC ОдноканальныйColumbus Instruments0135-8000Используется для хранения положительных регуляторов и полимера
Калибровочный газAirgasX03NI92P3000001Первичные стандартные газовые смеси; 2,7% углекислого газа, 4,5% метана, баланс азота
Монитор компьютераDell210-BMKKDell Pro 24 Plus USB-C Hub Monitor. Используется вместе с компьютером для запуска программного обеспечения Micro-Oxymax
Криогенные перчаткиThermo Fisher Scientific, Tempshield, криогенные перчатки11-394-306Используется для работы с жидким азотом
Циферблатный термометрThermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac13-201-433Откалиброванный термометр для температуры морской воды во время сбора
Одноразовые пипеткиThermo Fisher Scientific, Fisherbrand13-711-7MПромывайте бока сосуда, чтобы освободить материал
Корпус ENC52 с контролем температуры и освещенияColumbus Instruments4740-4054Поддержание температуры и освещения
Щипцы для фляжкиThermo Fisher Scientific, FisherbrandS07387Используется для обработки мельничных банки в жидком азоте
Фляжки, 250 млDWK Life Sciences14395-250Реакторные резервуары
Флаконы из стеклянной скорлупы с закрышками типа plugThermo Fisher Scientific, Fisherbrand03-339-26DХранение образцов
Портативный глубиномер H22PXВест Марин, Норкросс Марин6849368Определить глубину участка сбора морской воды
Портативный GPS 73Garmin10-01504-00Используется для определения местоположения места сбора морской воды
HDPE PanThermo Scientific, Nalgene13-359-26Используется для выщелачивания стеклянной посуды кислотой  в растворе 10% HCl
Соляная кислота (раствор кислой воды)Thermo Fisher Scientific, Fisher ChemicalA144-212Сертифицированный ACS Plus — 36,5–38,0%. Проверка датчиков CO2 и кислотное выщелачивание стеклянной посуды
Ламинарная вытяжкаАвиационная наукаFLOW-48-AМинимизировать воздушные загрязнения при подготовке образца
Большой Нискин; Только бутылка Beta Plus — 8,2 л горизонтально, ПВХНаука прежде всего3-1980-H65Для сбора морской воды с причала или лодки
Поддон с жидким азотомThermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 211-999-063Удерживать жидкий азот и bbsp;
Контейнер для передачи жидкого азота, 10 лThermo ScientificTY509X2Храните и отпускайте жидкий азот для криомилляции
Жидкий азот, промышленного класса, 22 PSIAirgasNI 180LT22Используется для ломкости и измельчения полимеров
Механический шейкер ситаГумболт, Грейнджер5DPL6Анализ решета для распределения размеров частиц
Микрооксимакс  Коламбус Инструменттс7395-113-D64Кремниевое герметичное уплотнительное кольцо, металлический порт с тремя фитингами и винтовая крышка GL45;
Интерфейс расширения Micro-Oxymax с 10 каналамиColumbus Instruments0135-8101Компонент системы респирометрии
Респирометр Micro-Oxymax (3% CO<суб>2 сенсор)Columbus Instruments0135-8403Недисперсионный инфракрасный
Смесительный завод 400Ретч207450001Смесительный завод 400. Используется для криогенного помола полимера
Моторизованный контроллер пипетокЭппендорф4430000018Передача морской воды в реакторные сосуды
Бутылка Amber HDPE Lab Quality Narrow-Mouth, 1 лThermo Scientific, Nalgene02-923-5Дискретный образец цельноводной морской воды
Нейлоновая сетка 20 MicronELKO Filtering Co.41718Используется для просеивания сырой морской воды с целью удаления крупных гетерогенных частиц
Открытый орбитальный шейкерТермо Фишер СайентификSK4000Поддерживать орбитальное движение реакторных сосудов во время инкубации
Компьютер с малым форм-фактором OptiPlex 5090DellC0SL03Настольный компьютер, использовавший программное обеспечение Micro-Oxymax 
pH/Cond MeterМеттлер Толедо, SevenExcellence S470-Basic30046252Настольный измеритель pH/проводимости для измерения начального и конечного инокуля морской воды
Полиэтиленовая бутылка, 60 млQorpakPLC-03564Дискретный фильтрованный образец морской воды
Монобазовый фосфат калия (KH2(PO4))Thermo Fisher Scientific, биореагенты FisherBP362-500Всплеск питательных веществ в морской воде
Точная балансировкаСарториусPractum2102-1SВзвесить таре и целый вес сосудов
Раунд Карбой, 20 LТермо Фишер Сайентифик02961AКислотно вымываемый для хранения морской воды
Защитные очкиThermo Fisher Scientific, Fisherbrand19-181-513
СкупулаТермо Фишер Сайентифик, Фишербранд, Скупула01-257-567Лабораторная скупула из нержавеющей стали
СитаAdvantech, Grainger40PR18-40PR55Решета из нержавеющей стали. Количество решет и размеры зависят от материала, который исследуем.
Целлюлоза сигмацелл, тип 101Сигма-Олдрич435236-250GПорошок, положительный контрольный субстрат
Бикарбонат натрияThermo Fisher Scientific, Fisher ChemicalS233-500Проверка датчика CO2
Сульфит натрия, безводный, 98%Термо Фишер Сайентифик, Термо Сайентифик ХимикалAAA1793336Проверка датчика CO2
Термометр/термисторный зондФишербранд15-079-700Проверьте температуру инкубатора
Трассируемый барометр с точным циферблатомФишербранд14-648-51Зафиксировать атмосферное давление в начале эксперимента
Среднеподвижный водород Victor, двухступенчатый регулятор метана, CGA - 350AirGasVIC0781-3559Регулятор калибровочного газа и bbsp;
Объёмные колбы, 2 лThermo Fisher Scientific, FisherbrandFB4002000Класс A; Кислота вымывалась и промывала деионизированной водой. Используется для приготовления питательной морской воды с шипами.
ВзвешиваниеТермо Фишер Сайентифик02-202-101Полиэтилен

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Avio, C. G., Gorbi, S., Regoli, F. Plastics and microplastics in the oceans: From emerging pollutants to emerged threat. Marine Environ Res. 128, 2-11 (2017).
  2. Cole, M., Lindeque, P., Halsband, C., Galloway, T. S. Microplastics as contaminants in the marine environment: a review. Marine Poll Bullet. 62 (12), 2588-2597 (2011).
  3. Andrady, A. L. Plastics and Environmental Sustainability. , John Wiley and Sons. (2015).
  4. Rosato, A., et al. Bacterial colonization dynamics of different microplastic types in an anoxic salt marsh sediment and impact of adsorbed polychlorinated biphenyls on the plastisphere. Environ Poll. 315, 120411(2022).
  5. Flury, M., Narayan, R. Biodegradable plastic as an integral part of the solution to plastic waste pollution of the environment. Curr Opin Green Sustain Chem. 30, 100490(2021).
  6. Chamas, A., et al. Degradation rates of plastics in the environment. ACS Sustain Chem Eng. 8 (9), 3494-3511 (2020).
  7. Allen, A. L., Mayer, J., Stote, R., Kaplan, D. L. Simulated marine respirometry of biodegradable polymers. J Environ Poly Degradat. 2, 237-244 (1994).
  8. Briassoulis, D., Pikasi, A., Papardaki, N. G., Mistriotis, A. Biodegradation of plastics in the pelagic environment of the coastal zone - Proposed test method under controlled laboratory conditions. Sci Tot Environ. 912, 168889(2024).
  9. Standard Test Method for Determining Aerobic Biodegradation of Plastic Materials in the Marine Environment by a Defined Microbial Consortium or Natural Sea Water Inoculum ASTM D6691-24a, ASTM International. , ASTM International. (2024).
  10. Ratto, J. A., Russo, J., Allen, A., Hebert, J., Wirsen, C. Biodegradable polymers in the marine environment: A tiered approach to assessing microbial degradability. Biopol Polysacch Agroprot ACS Symp Series. 786, 316-336 (2001).
  11. Standard Test Method for Weight Attrition of Plastic Materials in the Marine Environment by Open System Aquarium Incubations, ASTM-D7473-12. , ASTM International. (2012).
  12. Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment ASTM D7081-05 (withdrawn 2014). , ASTM International. (2005).
  13. American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 24th, Washington, DC. (2023).
  14. Scheiner, D. Determination of ammonia and Kjeldahl nitrogen by indophenol method. Water Res. 10 (1), 31-36 (1976).
  15. Murphy, J., Riley, J. P. A single-solution method for the determination of soluble phosphate in seawater. J Marine Biol Assoc U K. 37, 9-14 (1958).
  16. Kirsten, W. Organic Elemental Analysis: Ultramicro, Micro, and Trace Methods. , Academic Press/Harcourt Brace Jovanovich. (1983).
  17. Parsons, T. R., Maita, Y., Lalli, C. Manual of Chemical and Biological Methods for Seawater Analysis. , Pergamon Press. (1989).
  18. Standard Test Methods for Particle Size (Sieve Analysis) of Plastic Materials, ASTM D1921-96. , ASTM International. (1996).
  19. Gilbert, J. A., et al. The taxonomic and functional diversity of microbes at a temperate coastal site: a 'multi-omic' study of seasonal and diel temporal variation. PLoS ONE. 5 (11), e15545(2010).
  20. Chafee, M., et al. Recurrent patterns of microdiversity in a temperate coastal marine environment. ISME J. 12 (1), 237-252 (2018).
  21. Jannasch, H. W., Eimhjellen, K., Wirsen, C. O., Farmanfarmaian, A. Microbial degradation of organic matter in the deep sea. Science. 171 (3972), 672-675 (1971).
  22. Zumstein, M. T., et al. Biodegradation of synthetic polymers in soils: Tracking carbon into CO2 and microbial biomass. Sci Adv. 4, eaas9024(2018).
  23. Zumstein, M. T., Narayan, R., Kohler, H. P. E., McNeill, K., Sander, M. Dos and do nots when assessing the biodegradation of plastics. Science. 366 (6470), 9967-9969 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Marine EnvironmentBiodegradable MaterialsCarbon Dioxide ProductionStandardized TestingNutrient SupplementationReactor VesselsMaterial Mineralization

Похожие статьи