Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Установление и количественная оценка de novo литической инфекции бесклеточным герпесвирусом Капоши, ассоциированным с саркомой Капоши

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68959

⸱

15 августа 2025 г.

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описывается система in vitro для моделирования de novo литической инфекции герпесвируса Капоши, ассоциированного с саркомой, с использованием вирионов, полученных из BAC16. Метод позволяет исследовать раннюю репликацию и распространение вируса. Производство инфекционных вирусов количественно оценивается с помощью анализов инфекционных единиц на основе GFP и ПЦР в реальном времени инкапсулированных вирусных геномов.

Аннотация

Вирус герпеса, ассоциированный с саркомой Капоши (KSHV), гаммагерпесвирус, участвующий в множественных злокачественных новообразованиях человека, может подвергаться литической репликации во время первичной инфекции, что способствует распространению вируса, уклонению от иммунитета и патогенезу заболевания. Тем не менее, отсутствие надежных систем in vitro для лечения de novo литической инфекции ограничило понимание ранних событий инфекции. В данной работе мы представляем управляемый протокол, в котором клетки HCT 116 колоректального рака человека используются в качестве мишеней для инфицирования бесклеточными вирионами, полученными из бактериальных клеток-производителей iSLK, реактивированных бактериальной искусственной хромосомой 16 (BAC16). Эта модель повторяет ключевые этапы первичной инфекции, включая проникновение вируса, доставку генома, экспрессию литических генов и производство потомства. Инфекция синхронизируется с помощью спинокуляции и контролируется во времени. Производство вируса количественно оценивается с помощью двойной системы считывания, состоящей из анализов инфекционных единиц (МЕ) на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP) и количественной ПЦР инкапсулированной вирусной ДНК. Эти подходы позволяют детально проанализировать кинетику репликации вируса. В то время как текущий протокол ориентирован на обнаружение событий на поздних стадиях, система может быть адаптирована для изучения ранних фаз инфекции с помощью модифицированных временных точек выборки. Предлагая воспроизводимую, масштабируемую платформу для продуктивной инфекции de novo , эта система устраняет методологический пробел в исследованиях KSHV и поддерживает механистические исследования взаимодействия вируса герпеса и хозяина и противовирусных стратегий.

Введение

Вирус герпеса, ассоциированный с саркомой Капоши (KSHV) — это гаммагерпесвирус человека, этиологически связанный с саркомой Капоши (СК), первичной выпотной лимфомой (PEL), мультицентрической болезнью Кастлемана (MCD) и синдромом воспалительных цитокиновKSHV 1,2. Как и все герпесвирусы, KSHV обеспечивает пожизненную персистенцию в организме хозяина, чередуя латентную и литическую фазы. В то время как латентность преобладает в большинстве инфицированных клеток, подмножество может вступать в литический цикл либо во время первичной инфекции (de novo), либо в результате реактивации из латентности3. Литическая репликация включает в себя упорядоченный каскад экспрессии вирусных генов, кульминацией которого является репликация генома, сборка вирионов и высвобождение потомства. Этот процесс имеет решающее значение для распространения вируса и прогрессирования заболевания 4,5. Ранние исследования литической репликации KSHV часто основывались на эктопической экспрессии отдельных вирусных генов в гетерологичных системах. Несмотря на информативность, эти подходы не учитывают скоординированную регуляцию генов и взаимодействие вируса с хозяином, присутствующее во время подлинной инфекции. Разработка BAC-16, рекомбинантной бактериальной искусственной хромосомы (BAC), несущей полноразмерный геном KSHV, позволила получить генетически манипулируемые вирусы, которые сохраняют способность к репликации и производству инфекционныхвирионов. Эта система способствует целенаправленному мутагенезу и функциональному анализу вирусных генов в контексте полного генома. Модели реактивации с использованием латентно инфицированных клеток iSLK или BCBL-1 с BAC-16 или KSHV с тех пор стали стандартом для изучения литической репликации KSHV. Эти системы обеспечивают синхронизированную индукцию литического цикла с использованием таких агентов, как доксициклин (Dox) и бутират натрия 7,8. Однако, поскольку модели реактивации обходят ранние этапы инфекции, включая проникновение вируса, внутриклеточный транспорт и первоначальное решение между латентностью и литической репликацией, они не могут полностью повторить динамику первичной инфекции.

Модели инфекции de novo предлагают дополнительную основу для устранения этих пробелов. Было показано, что несколько первичных клеточных моделей, таких как эндотелиальные и эпителиальные клетки десны человека, поддерживают литическую репликацию после инфекции KSHV de novo 3,9,10,11. Тем не менее, их ограниченный срок службы, высокая стоимость и плохая податливость к генетическим манипуляциям ограничивают их воспроизводимость и масштабируемость для механистических исследований. В этом протоколе мы описываем управляемую и масштабируемую модель KSHV de novo литической инфекции с использованием клеточной линии колоректальной карциномы человека HCT 116. Несмотря на то, что клетки HCT116 не являются естественной мишенью KSHV, они демонстрируют устойчивую восприимчивость к инфекции и представляют собой стабильную и экономически эффективную платформу, подходящую для механистических исследований и высокопроизводительных приложений. Учитывая ограниченную способность KSHV к образованию бляшек в культуре, мы используем систему BAC16, включающую репортер GFP, для создания бесклеточного вируса для инфекции. Это позволяет напрямую визуализировать инфицированные клетки и количественно определять инфекционные титры с помощью анализов инфекционных единиц (МЕ) на основе GFP12. В дополнение к этому, вирион-ассоциированная ДНК измеряется с помощью количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) после обработки ДНКазой, что является чувствительным методом обнаружения инкапсулированных вирусных геномов. В совокупности эти анализы позволяют провести временное разрешение, количественный анализ динамики литической репликации во время первичной инфекции.

Этот протокол обеспечивает надежную и гибкую платформу для моделирования KSHV de novo литической инфекции in vitro, облегчая препарирование ранних событий в жизненном цикле вируса, позволяя оценить функцию генов и противовирусную активность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

KSHV классифицируется как патоген человека уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Выполняйте все процедуры, связанные с инфекционными материалами, в сертифицированном шкафу биобезопасности BSL-2. Обеззараживайте рабочие поверхности 70% этанолом до и после каждой процедуры. Утилизируйте все отходы в соответствии с институциональными правилами биобезопасности и рекомендациями ВОЗ BSL-2. Схематический обзор полного рабочего процесса представлен на рисунке 1. Процедура включает в себя получение бесклеточного KSHV, полученного из BAC16, из реактивированных клеток iSLK, заражение de novo клеток HCT 116, количественную оценку титров вируса с помощью анализа инфекционных единиц (МЕ) и анализ qPCR вирусной ДНК, ассоциированной с вирионом. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Производство бесклеточного KSHV, полученного из BAC16

  1. Засейте пять колб T75 Dox-индуцируемыми клетками iSLK, содержащими широкий тип (WT) KSHV BAC 16 (iSLK-BAC16) при примерно 80% конфлюенции. Инкубировать при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием CO2 в течение 24 часов.
  2. Индуцируйте литическую реактивацию, добавив 1 мкг/мл Dox и 1 мМ бутирата натрия в каждую колбу. Продолжайте инкубацию в течение 72-96 ч.
  3. Ежедневно контролируйте клетки с помощью фазово-контрастной микроскопии. Соберите надосадочную жидкость после того, как >90% клеток проявят округление, отслоение от поверхности колбы и/или видимый лизис, признаки цитопатического эффекта (CPE), свидетельствующие об устойчивой литической реакции. После сбора надосадочной жидкости обеззараживают и утилизируют литически индуцированные клетки iSLK-BAC16 с использованием 10% отбеливателя.
  4. Центрифугируйте собранные надосадочные жидкости при 1 500 x g в течение 10 мин при 4 °C для удаления мусора. Фильтруйте осветленную надосадочную жидкость через мембранный фильтр из полиэфирсульфона (PES) 0,45 мкм, не повреждая гранулы.
  5. Переложите отфильтрованную надосадочную жидкость в ультрацентрифужные пробирки. Гранулируйте вирусные частицы центрифугированием при температуре 25 000 x g в течение 3 ч при 4 °C с помощью ротора SW28.
  6. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость в 10% отбеливатель. Ресуспендируйте вирусную гранулу в 1 мл сыворотки Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. Аликвотируйте ресуспендированный вирус в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Хранить аликвоты при температуре -80 °C до использования. Определите инфекционные титры вирусного запаса с помощью анализов инфекционных единиц (МЕ) на основе GFP в клетках SLK (см. шаг 3).

2. Инфекция de novo клеток HCT116

ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая кратность инфекции (MOI) имеет решающее значение для эффективной инициации литической репликации в клетках HCT116 после инфекции de novo KSHV. Это состояние обеспечивает надежную экспрессию вирусных генов и продуктивную репликацию без необходимости использования экзогенных стимулов. Репрезентативный результат, демонстрирующий MOI-зависимое влияние на продукцию вирионов, представлен на дополнительном рисунке 1A.

  1. Засейте 1 x 10по 5 клеток HCT116 в лунку в 12-луночный планшет для культуры тканей. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием CO2 .
  2. Разбавьте концентрированный вирусный запас в предварительно подогретом бессывороточном DMEM до конечного объема 250 мкл до достижения кратности инфекции (MOI) 10.
  3. Отсаживайте питательную среду из каждой лунки. Добавьте 250 мкл разведенного вируса непосредственно в клетки.
  4. Центрифугируйте планшет при давлении 1 500 x g в течение 1 ч при 30 °C для синхронизации инфекции (спинокуляции). Немедленно перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C и продолжайте инкубацию еще 1 ч.
  5. Аспирируйте инокулюм и трижды промойте клетки предварительно подогретым PBS для удаления остаточного вируса. Добавьте по 1 мл полного DMEM в каждую лунку.
  6. Контролируйте экспрессию GFP в инфицированных клетках с помощью флуоресцентной микроскопии через 36 ч, 60 ч и 96 ч после заражения. В каждый момент времени соберите по 1 мл надосадочной жидкости из каждой лунки.
    Примечание: После сбора надосадочной жидкости инфицированные KSHV клетки HCT116 могут быть сохранены для последующих применений, таких как экстракция РНК, анализ белков, иммунофлуоресценция или проточная цитометрия, в зависимости от экспериментальных целей.
  7. Центрифугируйте собранные надосадочные жидкости при 1500 x g в течение 10 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора. Переложите осветленные надосадочные жидкости в свежие пробирки. Мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.

3. Анализ инфекционных единиц (анализ МЕ)

Примечание: SLK-клетки допускают проникновение KSHV и поддерживают раннюю экспрессию литических генов. Этот анализ количественно определяет инфекционные единицы на основе экспрессии GFP в инфицированных клетках SLK после воздействия последовательно разведенных вируссодержащих надосадочных линий.

  1. Засейте 1 x 10по 4 SLK-клетки в лунку в 96-луночный планшет за 24 ч до заражения. Убедитесь, что клетки равномерно распределены и достигают ~60%-70% слияния в день заражения.
  2. Маркировка девяти микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл для серийного двойного разведения: пробирка 1 (неразбавленная, 1:1), пробирка 2 (1:2), пробирка 3 (1:4), пробирка 4 (1:8), пробирка 5 (1:16), пробирка 6 (1:32), пробирка 7 (1:64), пробирка 8 (1:128) и пробирка 9 (1:256).
  3. Добавьте 200 μL вирусной надосадочной жидкости в пробирку 1. Добавьте по 100 мкл предварительно подогретого DMEM без сыворотки в каждую из пробирок со 2 по 9. Чтобы начать серию разведения, перелейте 100 мкл из пробирки 1 в пробирку 2 и тщательно перемешайте пипетированием вверх и вниз. Затем переложите 100 μL из пробирки 2 в пробирку 3 и повторите этот процесс последовательно через пробирку 9, тщательно перемешивая на каждом этапе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый тюбик должен содержать конечный объем 100 мкл. Выполняйте все разведения в трех экземплярах.
  4. Аспирируйте питательную среду из клеток SLK. Добавьте по 100 мкл каждого разбавления вируса в предназначенные для этого лунки. Всего используйте 27 лунок (по 3 лунки на разведение от 1:1 до 1:256).
  5. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 1500 x g в течение 1 ч при 30 °C для стимуляции адсорбции флакона. Перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C CO 2 еще на 1 час.
  6. Извлеките инокулянт и аккуратно добавьте 100 мкл полного DMEM в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение 24 ч при 37 °C.
  7. Соберите клетки и проанализируйте экспрессию GFP с помощью проточной цитометрии. Запишите количество GFP-положительных клеток в лунке.
  8. Рассчитаем инфекционные единицы на мл (МЕ/мл) по следующей формуле13:
    МЕ/мл = [(количество GFP-положительных клеток на лунку)/объем инокулюма (мл)] x коэффициент разведения. Определение конечного титра вируса с помощью последнего разведения с обнаруживаемыми GFP-положительными клетками

4. Количественная оценка инкапсулированных вирусных геномов с помощью количественной ПЦР

  1. Добавьте ДНКазу I до конечной концентрации 100 Ед/мл до 400 мкл осветленной надосадочной жидкости (см. шаг 1 для осветления надосадочной жидкости и удаления мусора). Инкубировать в течение 15 минут при 37 °C для переваривания неинкапсулированных вирусных и клеточных ДНК. Репрезентативный результат, демонстрирующий специфичность и эффективность лечения ДНКазой, показан на дополнительном рисунке 1B.
  2. Добавьте ЭДТА в конечную концентрацию 50 мМ, чтобы остановить реакцию ДНКазы. Инкубировать при 75 °C в течение 15 мин для инактивации ДНКазы I.
  3. Извлеките вирусную ДНК из надосадочной жидкости, обработанной ДНКазой, с помощью набора DNA Mini Kit в соответствии с протоколом производителя.
  4. Элюируйте вирусную ДНК в 30 мкл элюирующего буфера. Используйте 5 мкл элюированной ДНК для каждой реакции количественной ПЦР.
  5. Усилить открытую считывающую рамку 73 KSHV (ORF 73) с помощью следующих капсюлей: Forward: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; Реверс: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
  6. Приготовьте реакции количественной ПЦР в трех экземплярах с помощью SYBR Green Master SuperMix. Настройте условия цикла следующим образом: Начальная денатурация: 95 °C в течение 3 минут; Усиление: 40 циклов по 95 °C в течение 10 с, 52 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с; Анализ кривой плавления: стандартная шкала для специфичности ампликона.
  7. Сгенерируйте стандартную кривую с использованием 10-кратных серийных разведений вирусной ДНК, полученной из BAC-16, в диапазоне от 109до 101 копий на реакцию. Соотнесите значения Ct с log10 числа входных копий для оценки линейности анализа. Репрезентативная стандартная кривая показана на дополнительном рисунке 1C.
  8. Определение числа копий вирусного генома путем сравнения значений Ct со стандартной кривой. Нормализуйте и сообщите о результатах в виде копий вирусной ДНК на мл надосадочной жидкости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для количественной оценки титра инфекционного вируса надосадочные жидкости, собранные через 72 ч после литической реактивации клеток iSLK-BAC16, подвергали двукратному серийному разведению и использовали для инфицирования клеток SLK. Количество GFP-положительных клеток SLK при каждом разведении показано на рисунке 2A, а соответствующие инфекционные единицы (МЕ) на мл были рассчитаны и представлены на рису...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Моделирование de novo литической инфекции KSHV долгое время затруднялось сильной склонностью вируса к установлению латентности в большинстве типов разрешающих клеток. Несмотря на то, что было показано, что некоторые первичные клетки, такие как эндотелиальные и эпителиальные клетки полости рта, поддерживают литическую репликацию после инфекции de novo, их ограниченная продолжительность жизни, высокая стоимость и технические трудности в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Джэ У. Юнга (Кливлендская клиника) за совместное использование клеточной линии iSLK-BAC16, продуцирующей рекомбинантный KSHV. Графический дизайн создан с использованием BioRender.com, на который у авторов есть лицензия. Эта работа была поддержана наградами NIH R21 DE028256, R01 CA140964 и R01 CA262631 К. Ляну (PI), премией Wistar Science Accelerator Postdoctoral Award К. Чжу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,45 & микро; m фильтр из полиэфирсульфома (PES) ВВР76479-020
БиорендерБиорендерН/ДГрафический дизайн был
создан с помощью BioRender.com, на который у авторов есть лицензия
CFX Opus 96 Система для ПЦР в реальном времениБио-Рад184-5072
Полная DMEMМодифицированная среда Eagle's от Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich) с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco), 2 мМ L-глутамина (Gibco) и 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина (Pen-Strep; GenClone).
ДНКаза IБиолаборатории Новой АнглииМ0303С
ДоксициклинСигма-ОлдричД9891
Проточный цитометр LSR II 18BD BioscienceН/Д
PerfeCTa SYBR Green Master SuperMixКвантабио95054-02К
Мини-набор QIAamp DNAЦягэн56304
бутират натрия (NaB)Сигма-ОлдричВ5887
UltraPure 0,5 М ЭДТА, pH 8,0Термо Фишер15575020

Ссылки

  1. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).
  2. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Cancer Lett. 305 (2), 163-174 (2011).
  3. Golas, G., Alonso, J. D., Toth, Z. Characterization of de novo lytic infection of dermal lymphatic microvascular endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Virology. 536, 27-31 (2019).
  4. Dittmer, D. P., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: immunobiology, oncogenesis, and therapy. J Clin Invest. 126 (9), 3165-3175 (2016).
  5. Chang, H. H., Ganem, D. A unique herpesviral transcriptional program in KSHV-infected lymphatic endothelial cells leads to mTORC1 activation and rapamycin sensitivity. Cell Host Microbe. 13 (4), 429-440 (2013).
  6. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J Virol Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Grundhoff, A., Ganem, D. Inefficient establishment of KSHV latency suggests an additional role for continued lytic replication in Kaposi sarcoma pathogenesis. J Clin Invest. 113 (1), 124-136 (2004).
  9. Gao, S. J., Deng, J. H., Zhou, F. C. Productive lytic replication of a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in efficient primary infection of primary human endothelial cells. J Virol. 77 (18), 9738-9749 (2003).
  10. Atyeo, N., Chae, M. Y., Toth, Z., Sharma, A., Papp, B. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus immediate early proteins trigger FOXQ1 expression in oral epithelial cells, engaging in a novel lytic cycle-sustaining positive feedback loop. J Virol. 97 (3), e0169622(2023).
  11. Lagunoff, M., et al. De novo infection and serial transmission of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in cultured endothelial cells. J Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  12. ViejoBorbolla, A., Schulz, T. F. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and innate immunity. J Gen Virol. 98 (2), 271-284 (2017).
  13. Chandran, B. Early events in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of target cells. J Virol. 84 (5), 2188-2199 (2010).
  14. Zhu, Q., et al. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces mitochondrial fission to evade host immune responses and promote viral production. Nat Microbiol. 10 (6), 1501-1520 (2025).
  15. Lee, S. C., et al. Hypoxia and HIF-1alpha promote lytic de novo KSHV infection. J Virol. 97 (11), e0097223(2023).
  16. White, I. E., Campbell, T. B. Quantitation of cell-free and cell-associated Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus DNA by real-time PCR. J Clin Microbiol. 38 (5), 1992-1995 (2000).
  17. Bechtel, J., Grundhoff, A., Ganem, D. RNAs in the virion of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 79 (16), 10138-10146 (2005).
  18. Lin, X., Li, X., Liang, D., Lan, K. MicroRNAs and unusual small RNAs discovered in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus virions. J Virol. 86 (23), 12717-12730 (2012).
  19. Watzinger, F., et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol. 42 (11), 5189-5198 (2004).
  20. Cho, H. J., et al. Antiviral activity of angelicin against gammaherpesviruses. Antiviral Res. 100 (1), 75-83 (2013).
  21. Coen, N., Duraffour, S., Snoeck, R., Andrei, G. KSHV targeted therapy: An update on inhibitors of viral lytic replication. Viruses. 6 (11), 4731-4759 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

литическая инфекция KSHVинфекция de novoбесклеточный KSHVклетки HCT116вирус BAC16спинокуляцияGFP-анализпроточная цитометрияколичественная ПЦРрепликация вируса
Установление и количественная оценка de novo литической инфекции бесклеточным герпесвирусом Капоши, ассоциированным с саркомой Капоши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.