Установление и оценка модели диабетической крысы с облитеранским артериосклерозом нижней конечности

Краткое содержание

Облитерный артериосклероз нижних конечностей — распространённое осложнение сахарного диабета. Здесь мы представляем новый метод моделирования на животных, который моделирует прогрессирование атеросклеротической окклюзивной болезни путём введения этанола в кровеносные сосуды для нарушения сосудистой структуры, тем самым предоставляя новую платформу для лечения сосудистых заболеваний.

Аннотация

Целью данного исследования было установление и подтверждение новой модели артериосклероза нижних конечностей (ASO) у диабетических крыс. В отличие от традиционной перевязки бедренной артерии, мы ввели 95% этанола (0,1 мл) во внешнюю подвздошную артерию. После операции артериальная окклюзия и ишемия задних конечностей оценивались на 1, 3, 7 и 14 дни с помощью допплеровского УЗИ, тепловизии и измерения массы мокрых мышц. Был проведён гистологический анализ кровеносных сосудов и мышечных тканей для оценки эффективности и стабильности модели. Высококонцентрационный этанол (95%) вызывает повреждение сосудистых эндотелиальных клеток, что приводит к окклюзии бедренной артерии. По сравнению с контрольной группой, допплеровское ультразвуковое исследование показало постепенное уменьшение диаметра артерии и увеличение скорости течения в поражённой конечности. Тепловизия показала снижение температуры конечностей, а измерение мышечной массы — значительное уменьшение ипсилатеральной мышечной массы. Гистопатологический анализ подтвердил окклюзию просвета артерии, снижение плотности микрососудистых сосудов и прогрессирующее обострение поражения со временем. В заключение, инъекция 95% этанола в подвздошную артерию эффективно воспроизводит патофизиологические характеристики окклюзии артериальной окклюзии нижней конечности, предоставляя новую модель для изучения артериосклероза облитеранса у диабетических крыс.

Введение

Окклюзия нижних конечностей (DLEAO) при диабете является одной из ведущих причин инвалидности и смертности у диабетиков, серьёзно снижая качество жизни и возлагая значительную социально-экономическую^{нагрузку 1}. Патогенез диабетических артериальных заболеваний включает сложные взаимодействия между гипергликемией, дислипидемией, хроническим воспалением и сосудистой^{дисфункцией 2}. Животные модели сыграли ключевую роль в прояснении этих механизмов, предоставляя критические инсайты для терапевтической разработки. Животные модели служат ценными инструментами для моделирования патофизиологии периферических артериальных заболеваний (ПАД) у пациентов с диабетом. Эти модели обеспечивают высокопроизводительные, воспроизводимые исследования для изучения прогрессирования заболевания и выяснения основных механизмов. Кроме того, доклинические испытания с использованием животных моделей предоставляют важные данные для новых терапевтических средств, включая фармакологические препараты, генную терапию и подходы регенеративной медицины (например, терапия стволовыми клетками)³. Такие фундаментальные исследования критически важны для информирования последующих клинических испытаний и развития трансляционной медицины.

В настоящее время метод перевязки бедренной артерии (FAL) широко используется в лабораториях для создания моделей ишемии задней^{конечности 4} на крыс. Этот подход быстро вызывает ишемические проявления в нижних^{конечностях 5}; однако возникший артериальный тромбоз отличается от патофизиологического прогрессирования, наблюдаемого у диабетиков с болезнью нижних конечностей (LEAD), которое включает повреждение эндотелия, накопление воспалительных факторов и пролиферацию гладкомышечных^{клеток 2,6}. Кроме того, FAL вызывает быструю неоваскулярызацию и формирование сосудов, восстанавливая перфузию с низким потоком вскоре после моделирования ^5,7. Это контрастирует с хроническим прогрессированием диабетического LEAD. Поэтому необходимо разработать животную модель, которая более точно воспроизводит патофизиологические механизмы человеческого артериосклероза.

В моделях на животных с диабетом механическое повреждение интимной бедренной артерии с помощью баллонного катетера или химической индукции (например, стимуляция хлоридом железа) эффективно вызывает патологические изменения, включая эндотелиальную денудацию, инфильтрацию воспалительных клеток и миграцию/пролиферацию^{гладкомышечных клеток 8}. Этот подход лучше воспроизводит характерные патологические признаки человеческого атеросклероза. По сравнению с традиционной моделью FAL, основное преимущество метода, индуцированного этанолом, заключается в его способности более точно моделировать сложный патофизиологический процесс диабетического свинца. Этанол напрямую нарушает сосудистый эндотелий, активируя агрегацию тромбоцитов и тромбоз, имитируя начальное событие при диабетическом^{LEAD 9}. Что ещё важнее, постепенно разрушая сосудистую микроструктуру, этанол эффективно избегает быстрой компенсации коллатерального кровообращения, характерной для модели FAL, тем самым успешно воспроизводя типичное состояние хронической гипоперфузии диабетического^{LEAD 10}. В отличие от этого, модель ишемии, вызванной лигацией бедренной артерии, имеет заметные ограничения: грызуны (например, мыши, крысы) быстро компенсируют острую ишемию благодаря хорошо развитой коллатеральной циркуляции, что приводит к непостоянной тяжести ишемии и плохой репривидности ишемии критической конечности человека (CLI)^11,12. Кроме того, заболевание периферических артерий человека (ПАД) в первую очередь связано с хроническим прогрессированием атеросклероза, тогда как модель лигации бедренной артерии представляет собой острый ишемический событие, фундаментально отличающийся от патофизиологических^{механизмов 13}. Основной целью этого исследования было создание и характеристика стабильной, долгосрочной экспериментальной модели диабетического артериосклероза нижних конечностей (LEAOD), которая точно имитирует прогрессирование заболевания у пациентов. Окклюзия, вызванная этанолом, практически проста, требует лишь минимально инвазивных инъекций, что снижает технический барьер и смертность животных. Его ключевые параметры легко стандартизуются, что обеспечивает высокую воспроизводимость. Кроме того, метод экономически эффективен, устраняет необходимость в специализированном оборудовании и легко переносится между лабораториями. В настоящее время сохраняется нехватка устойчивых моделей животных для подтверждения новых терапевтических вмешательств.

Протокол

Это исследование было проведено по протоколу, утверждённому Комитетом по этике животных больницы Яньтай Юхуандин. В этом исследовании участвовали 40 самцов крыс рода Спраг-Доули (вес: 250-300 г, возраст: 6 недель), содержащихся в 12-часовом цикле света/тьма. Начиная с 7 недель, их кормили диетой с высоким содержанием жиров и сахарозы¹⁴^,¹⁵ ad libitum, с бесплатным доступом к воде в течение 8 недель. На 4-й неделе после начала диеты диабет был вызван инъекцией стрептозотоцина (STZ). Через 8 недель было подтверждено успешное установление диабетической модели перед последующим экспериментами. Операция по окклюзии артериальной задней конечности была проведена крысам в возрасте 14 недель, как описано ниже.

1. Хирургическая индукция облитерирующего артериосклероза задних конечностей у диабетических крыс

1. Подготовьте все хирургические инструменты и материалы, как указано в Таблице материалов и иллюстрировано на рисунке 1.
2. Анестезируйте крысу с помощью анестезиологического аппарата, который доставляет изофлуран (1,5–2,5%) и кислород (_O2, 1-2 л/мин). Сохраняйте спонтанное дыхание на протяжении всего процесса. Оцените глубину анестезии с помощью рефлекса сжатия пальцев, чтобы обеспечить хирургическую плоскость анестезии.
3. Поместите крысу в положение на спине на удерживающую платформу. Удалите волосы от живота до нижних конечностей с помощью депиляционного крема и бритвы.
4. Закрепите конечности. Продезинфицируйте кожу задних конечностей спиртом. Сделайте разрез 2-3 см на медиальной части правого бедра с помощью изогнутых щипцов и ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические процедуры проводились опытным хирургом для обеспечения согласованности и воспроизводимости животных моделей.
5. Под микроскопом вскрытие окружающих тканей, чтобы обнажить внешнюю подвздошную артерию/вену и бедренный нерв. Изолируйте сосуды и нерв. Проследите наружную подвздошную артерию до её раздвоения на поверхностные и глубокие бедренные артерии.
6. Зажмите средний сегмент бедренной артерии и глубокую бедренную артерию сосудистыми зажимами. Медленно введите 0,1 мл 95% этанола в дистальную наружную подвздошную артерию. Через 60 секунд снимите зажимы; Достижение гемостаза с помощью компрессии. Закройте рану слой за слоем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции наблюдалось немедленное бланширование артерии и временный тремор ипсилатеральной стопы, что подтверждает успешную внутрисосудистую доставку этанола.
7. Не иммобилизуйте поражённую конечность после операции. Вводите инъекцию пенициллина натрия (400 000 МЕ) внутримышечно для предотвращения инфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой односторонней модели окклюзии артериальной окклюзии нижней конечности контралатеральная конечность служит контролем. Время окклюзии рассчитывается начиная с 24 часов после процедуры.

2. Определение температуры нижней конечности

1. Анестезируйте крысу и поместите её в положение лежащего на хирургической платформе.
2. Побрийте обе задние конечности и расположите их симметрично.
3. Измерьте температуру обеих задних конечностей с помощью инфракрасной термографии.

3. Диаметр артерии и скорость кровотока

1. Обезболить крысу.
2. Подготовьте систему УЗИ и зонд.
   1. Включите ультразвуковой аппарат, нажав кнопку питания на передней панели.
   2. Выберите высокочастотный линейный антенный зонд (например, 40 МГц) и подключите его к системе.
   3. Нанесите щедрое количество акустического геля-соединения на поверхность зонда.
3. Найдите поверхностную бедренную артерию.
   1. Поместите крысу в лежащее положение на согревающей подушечке, чтобы поддерживать температуру тела.
   2. Сбрийте шерсть от медиальной области бедра в обеих сторонах, примерно на 1-2 см выше коленного сустава, используя электрические машинки.
   3. Аккуратно положите зонд перпендикулярно поверхности кожи на выбритую область.
   4. Отрегулируйте положение зонда в режиме B, чтобы визуализировать бедренную артерию как пульсирующую, безэховую трубчатую структуру.
4. Измерьте диаметр артерии.
   1. Заморозьте изображение режима B, нажав кнопку Freeze на компьютере или в программном интерфейсе.
   2. Выберите инструмент «Измерение » в меню на экране.
   3. Используйте функцию суппорта для измерения внутреннего диаметра от ближней до дальней стенки артерии.
   4. Повторите измерение три раза в одном и том же месте и запишите среднее значение.
5. Измеряйте скорость кровотока.
   1. Переключитесь в режим импульсной волны Доплера , нажав на значок PW Доплера .
   2. Разместите образцовый элемент над центром просвета артерии.
   3. Отрегулируйте угол Доплера на ≤ 60° с помощью инструмента коррекции угла.
   4. Нажмите Update или Capture , чтобы записать форму волны скорости как минимум за три сердечных цикла.
   5. Используйте автоматическую функцию трассировки программного обеспечения для расчёта пиковой систолической скорости (PSV) и конечной диастолической скорости (EDV).
   6. Сохраните данные, нажав «Сохранить » и экспортировав результаты в файл таблицы (например, CSV, Excel).

4. Мышечный вес

1. После глубокой анестезии усыпьте крысу вывихом шейки матки.
2. Рассеките желудочно-кишечные мышцы с обеих задних конечностей, сохраняя ахилловы сухожилия (рисунок 2).
3. Немедленно положите мышцы на электронный вес для измерения влажного веса.
4. Используйте контралатеральные мышцы в качестве контроля.
5. Сравните измерения из четырёх временных точек и представите их в виде графика кривой.

5. Гистопатологический анализ

1. В каждой из четырёх временных точек быстро усыпьте одну группу крыс.
2. Немедленно убрать двусторонние поверхностные бедренные артерии.
3. Зафиксируйте артериальные ткани в 4% параформальдегиде.
4. Внедрить ткани в парафин и разрезать их толщиной 5 мкм.
5. Проведите окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) для изучения гистопатологических изменений.

6. Статистический анализ

1. Выражайте все данные в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Рассмотрим статистически значимые различия при p-значении <0,05.

Результаты

В этом исследовании использовались внутриартериальные инъекции этанола для создания модели у диабетических крыс с SD (n = 40). Модель характеризулась успехом 85% (33/40), основанной на ультразвуковом подтверждении уменьшения противоположного диаметра артерии и скорости кровотока в течение 14 дней после инъекции. Показатель смертности, связанной с моделями, составил 8% (5/40), преимущественно в начальном периоде. Хотя цитотоксичность этанола несёт риск неспецифического повреждения тканей, таких как гангрена, тщательный мо...

Обсуждение

В итоге мы успешно создали модель прогрессирующей окклюзии артерии у крыс, которая близко повторяет клинические проявления, наблюдаемые у пациентов с диабетом. Последовательные оценки гипоперфузии задней конечности были получены с помощью ультрасонографических измерений и оценки веса мышц в течение периодов более двух недель. Перевязка бедренной артерии вызывала поверхностную сосудистую окклюзию, обеспечивая при этом рециркуляцию крови через целую глубинную венозную^сист...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Версия GraphPad 8.0.1			RRID:SCR_002798
Телефонный инфракрасный термометр	HIKMICRO		HM-TJP10B-3AMF
Крыса Спраг-Доули	Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.		250 г
Ультразвуковой аппарат	Vevo 2100