Методическая статья

Применение электрофореза в полиакриламидном геле при анализе субфракций липопротеинов, имеющих отношение к атеросклеротическим сердечно-сосудистым заболеваниям

DOI:

10.3791/68996

⸱

24 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данный протокол направлен на разработку метода анализа субфракции липопротеинов на основе электрофореза в полиакриламидном геле, который обеспечивает важную диагностическую основу для оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний. Он может делить ЛПНП на семь поддробей. ЛПНП1 и ЛПНП2 характеризуются как крупные частицы, в то время как ЛПНП3-ЛПНП7 характеризуются как мелкие частицы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Холестерин липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП) является ключевым фактором развития атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний (АССЗ). Повышенный уровень холестерина ЛПНП тесно связан с образованием атеросклеротических бляшек и риском сердечно-сосудистых событий. Тем не менее, гетерогенность ЛПНП существенно влияет на его способность способствовать развитию атеросклероза. Исследования показывают, что частицы липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) можно разделить на маленькие плотные ЛПНП (ЛПНП) и большие плавучие ЛПНП (ЛБЛНП). Среди них sdLDL с большей вероятностью проникает в эндотелий сосудов и обладает более сильной окислительной модификационной активностью, что особенно связано с ASCVD. У пациентов с метаболическим синдромом, сахарным диабетом и гипертриглицеридемией уровень холестерина ЛПНП может быть нормальным, но доля sdLDL повышена, что приводит к недооценке сердечно-сосудистого риска. Таким образом, точное обнаружение субфракций ЛПНП имеет решающее значение для стратификации риска ASCVD и оптимизации стратегий вмешательства.

Традиционные методы обнаружения ХС ЛПНП, такие как формула Фридевальда и прямое измерение, отражают только общий уровень холестерина и не могут дифференцировать субфракции. Методы обнаружения субфракций ХС ЛПНП включают ультрацентрифугирование (UC), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Однако эти методы имеют высокие технические требования, сложные операции или дорогостоящее оборудование, что делает их непрактичными для широкого клинического применения.

Технология электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) разделяет частицы липопротеинов с помощью эффекта молекулярного сита и разницы зарядов. В этой технике используются неденатурирующие градиентные гелевые системы в сочетании со специфическими красителями, такими как суданский черный, что обеспечивает высокое разрешение, высокую воспроизводимость и простоту эксплуатации. Типирование липопротеинов с использованием технологии PAGE может обеспечить более всестороннюю и точную оценку уровня липопротеинов у пациентов, помогая в принятии решений о клиническом лечении. В этой статье представлены пять репрезентативных результатов. Средний размер частиц ЛПНП в образцах A, B, C, D, E составляет 275,3 Å, 266,6 Å, 258,2 Å, 257,4 Å и 252,9 Å, что указывает на низкий, маргинальный, легкий, умеренный и тяжелый риск сердечно-сосудистых заболеваний из-за дислипидемии, соответственно.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Согласно отчету Всемирной организации здравоохранения за 2021 год, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются ведущей причиной смерти среди болезней человека. В докладе указывается, что в 2019 году от ССЗ умерло 17,9 миллиона человек во всем мире, что составляет почти треть от общего числа смертей вмире1. ASCVD, тип сердечно-сосудистых заболеваний, является основной причиной смерти среди городских и сельских жителей в Китае, составляя более 40% всех смертей2. Атеросклероз – это хроническое воспалительное заболевание сосудов, обусловленное как традиционными, так и нетрадиционными факторами риска3. Характеризуется отложением липидов в артериальной стенке4, разрастанием фиброзной ткани и кальцинозом, что в конечном итоге приводит к утолщению стенки сосуда, снижению эластичности и сужению просвета. Дислипидемия является наиболее значимым фактором риска развития АССЗ, при этом ХС ЛПНП является патогенным фактором риска развития АССЗ, играя решающую роль в развитии АССЗ5. Многочисленные эпидемиологические исследования, менделевские рандомизированные исследования и рандомизированные контролируемые исследования неизменно показывают, что уровни холестерина ЛПНП в плазме положительно коррелируют с риском ASCVD. Снижение уровня холестерина ЛПНП может снизить риск развития ASCVD6.

ЛПНП является основным липопротеином, отвечающим за транспортировку эндогенного холестерина в организме7. Плазма ЛПНП неоднородна, состоит из множества частиц с различными размерами, плотностями и химическим составом8. Частицы LbLDL имеют меньшую плотность и больший размер, в то время как частицы sdLDL имеют более высокую плотность и меньший размер. Гетерогенность ЛПНП лежит в основе его различных биологических эффектов9. Частицы lbLDL больше по диаметру (≥ 25,5 нм), меньше по плотности (близко к 1,02 г/мл) и свободны по морфологии, состоят из LDL1 и LDL2. Частицы LbLDL содержат большее количество сложных эфиров холестерина. Они с меньшей вероятностью окисляются или проникают в эндотелий сосудов, что делает их относительно более безопасными. Напротив, частицы sdLDL имеют меньший диаметр (< 25,5 нм)10, более высокую плотность (около 1,06 г/мл) и плотную структуру, состоящую из LDL3 – LDL7. Частицы SdLDL содержат меньшее количество эфира холестерина, но более высокие уровни триглицеридов и аполипопротеина B (ApoB) по сравнению с lbLDL. Их физические свойства делают их более склонными к проникновению через артериальный эндотелиальный барьер. Под субэндотелием частицы sdLDL окисляются активными формами кислорода (АФК) с образованием окисленных ЛПНП (ox-LDL)11. Ox-LDL ингибирует активность эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), снижает выработку NO и индуцирует эндотелиальные клетки к экспрессии VCAM-1/MCP-1, способствуя адгезии и миграции моноцитов12. Мигрирующие эндотелиальные мононуклеарные клетки дифференцируются в макрофаги, которые поглощают бычий ЛПНП без ограничений через рецепторы-мусорщики. Накопление внутриклеточного эфира холестерина трансформируется в пенистые клетки, которые являются основными компонентами атеросклеротических липидных полос. Пенистые клетки секретируют воспалительные факторы, такие как IL-1β и TNF-α, которые еще больше расширяют окислительный стресс и повреждение эндотелия, образуя петлю положительной обратной связи13. Он может активировать воспаление эндотелиальных клеток, способствует образованию пенистых клеток и ускоряет прогрессирование бляшек. Два крупных когортных исследования показали, что sdLDL-C имеет большую клиническую референтную ценность, чем LDL-C, в прогнозировании и оценке потенциальных рисков ASCVD14-15. Но традиционный метод определения ХС ЛПНП не может проверить субфракции липопротеинов из-за ограниченности метода.

Частицы ЛПНП (ЛПНП-Р) отражают количество частиц ЛПНП на единицу объема крови и служат переносчиками для молекул ЛПНП, каждая из которых содержит одну молекулу ApoB и несколько молекул холестерина. Холестерин ЛПНП представляет собой общую массу холестерина, переносимого этими частицами. На уровень холестерина ЛПНП влияет количество частиц ЛПНП и плотность холестерина, которые могут не полностью отражать фактический риск16. Например, пациенты с метаболическим синдромом, диабетом или гипертриглицеридемией могут иметь нормальный уровень ЛПНП, но аномально повышенный уровень ЛПНП (из-за более мелких частиц и более низкого содержания холестерина). Даже если уровень холестерина ЛПНП соответствует целевому уровню, высокий уровень ЛПНП все равно может увеличить остаточный риск сердечно-сосудистых заболеваний. Исследования показали, что ЛПНП-является более прогностическим фактором, чем любой другой параметр, связанный сЛПНП 17. Анализ субфракций липопротеинов имеет решающее значение для понимания патогенеза ASCVD, оценки остаточного риска и руководства точным лечением. В последние годы национальные руководства также рекомендовали субфракции ЛПНП в качестве индикаторов для оценки риска АССЗ или мониторинга лечения18.

АССЗ является основной причиной смерти во всем мире. Стратегии его профилактики и контроля в значительной степени зависят от управления липидами. В настоящее время скрининг лиц с дислипидемией в клинической практике в основном опирается на традиционные четыре липидных теста, включая триглицериды (ТГ), общий холестерин (ХС), холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) и ХС ЛПНП. Кроме того, другие липидные маркеры, такие как липопротеин (а), аполипопротеин А1 (ApoA1) и ApoB, в основном используются для групп высокого риска ASCVD19, таких как пациенты с диабетом, пациенты с гипертонией и курильщики или те, чьи уровни холестерина ЛПНП были контролируемы, но все еще представляют высокий риск.

По мере развития исследований ограничения традиционного тестирования на липиды становятся все более очевидными, особенно в отношении эффективности раннего предупреждения и объяснения остаточного риска. У значительного числа пациентов с атеросклерозом и сердечно-сосудистыми заболеваниями первоначально диагностируется нормальный уровень липидов, что делает ХС ЛПНП неэффективным для первичного предупреждения. Эпидемиологические данные показывают, что около 20% пациентов с острым коронарным синдромом имеют уровень холестерина ЛПНП в пределах нормы (<3,4 ммоль/л) при поступлении, что позволяет предположить, что традиционное тестирование липидов может не учитывать лиц с высоким риском. Более того, даже после достижения целевых показателей ХС ЛПНП пациенты с АССЗ могут по-прежнему сталкиваться с высоким остаточным сердечно-сосудистым риском. У этих пациентов большинство остаточных событий в коронарных артериях не может быть объяснено снижением уровня ХС ЛПНП. Таким образом, простое тестирование ЛПНП может не в полной мере удовлетворить клинические потребности в диагностике и лечении аССЗ, поскольку рутинные липидные тесты не могут дифференцировать ЛБЛПНП и ЛПНП.

Многочисленные исследования подтвердили четкую корреляцию между субфракциями липопротеинов и ASCVD. Аномальные результаты тестирования на субфракцию липопротеинов могут служить предупреждением для первичной профилактики ASCVD у лиц с нормальным уровнем липидов, помогая выявить скрытые группы высокого риска. Для вторичной профилактики атеросклероза сердечно-сосудистых заболеваний, когда уровни ХС ЛПНП уже находятся в пределах целевых диапазонов, тестирование на субфракцию липопротеинов может помочь оценить остаточный риск и назначить дальнейшее лечение. Таким образом, ожидается, что обнаружение новых субфракций ЛПНП обеспечит новые мишени для профилактики и лечения дислипидемии и ASCVD по сравнению с традиционными липидными тестами.

Система обнаружения и анализа в нашей лаборатории в основном использует PAGE для разделения субфракций липопротеинов в зависимости от их размера и заряда. Частицы липопротеинов разделяются в основном по размеру благодаря молекулярному просеиванию в полиакриламидной матрице методом PAGE. Малые молекулы мигрируют быстро, в то время как крупные молекулы затрудняются стерической обструкцией и мигрируют медленно. И чем больше заряда несет молекула, тем быстрее она мигрирует. Этот метод позволяет быстро разделить липопротеины на двенадцать подфракций. ЛПНП делится на семь подфракций, обозначенных как ЛПНП1 - ЛПНП7. Все они имеют различные размеры, плотность, физико-химические свойства, метаболические свойства и атеросклеротический потенциал. LDL1 и LDL2 классифицируются как lbLDL, в то время как LDL3 - LDL7 классифицируются как sdLDL. Методы детектирования субфракции липопротеинов включают ЯК, ВЭЖХ и ЯМР. Однако в связи с высокими требованиями к оборудованию, сложностью эксплуатации и затратами времени их клиническое применение относительноограничено21. Метод PAGE эффективно разделяет различные субфракции ЛПНП, что делает его более удобным для пользователя по сравнению с другими методами. Используемое оборудование является экономичным и портативным, что делает его более подходящим для широкого использования в клинических лабораториях. Данное исследование направлено на валидацию PAGE в качестве быстрого и экономически эффективного метода анализа субфракции ЛПНП в образцах сыворотки для поддержки принятия клинических решений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все образцы в этом исследовании были оценены и одобрены Комитетом по этике Народной больницы провинции Гуандун (номер одобрения: KY2025-435-01). Перед началом эксперимента все участники подписали письменное информированное согласие.

1. Подготовка набора

  1. Приготовление гелевого буфера
    1. Приготовление 30% акриламида (ACR): Взвесьте 30 г акриламида, добавьте 80 мл деионизированной воды, перемешайте до растворения и доведите до 100 мл. Хранить при температуре 4 °C в темноте до использования.
    2. Приготовление 1% бисакриламида (BIS): Взвесьте 1 г бисакриламида, добавьте 80 мл деионизированной воды, перемешайте до растворения и доведите до 100 мл. Хранить при температуре 4 °C в темноте до использования.
    3. Приготовление 25% сахарозы: Взвесьте 25 г сахарозы, добавьте 70 мл деионизированной воды, перемешайте до растворения и доведите до 100 мл для хранения при 4 °C.
    4. Приготовление 10% персульфата аммония (APS): Растворите 0,1 г персульфата аммония в 1 мл деионизированной воды и немедленно используйте.
    5. Приготовление 1М Трис (pH = 6,8): Взвесьте 121,14 г трисгидроксиметиламинометана, добавьте 800 мл деионизированной воды, перемешайте до растворения и отрегулируйте значение pH до 6,8, затем сделайте до 1000 мл.
    6. Приготовление 1М Трис (pH = 8,6): Взвесьте 121,14 г трисгидроксиметиламинометана, добавьте 800 мл деионизированной воды, перемешайте до растворения и отрегулируйте значение pH до 8,6, затем сделайте до 1000 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с акриламидом надевайте перчатки из бутилкаучука, защитные очки, защитную одежду и работайте в вытяжном шкафу. При попадании на кожу немедленно умыться водой с мылом, после чего обратиться за медицинской помощью. В случае вдыхания переместиться на свежий воздух.
  2. Приготовление разделительного геля
    1. Возьмите чистую стеклянную трубку и заклейте нижний слой герметизирующей пленкой.
    2. Добавьте 8,29 мл 30% ACR, 17,76 мл 1% BIS, 10 мл 25% сахарозы, 1 мл 10% APS, 10 мл 1M Tris (pH = 8,6), 0,1 мл тетраметилэтилендиамина (TEMED) и 32,85 мл деионизированной воды в чистую мензурку по очереди. Хорошо перемешайте, чтобы получить 80 мл маточного раствора (с концентрацией полиакриламида 3,3%) и добавьте в стеклянную пробирку по 1,2 мл на корень. Полимеризуйтесь при комнатной температуре в течение 60 минут и запечатайте жидкость очищенной водой, чтобы обеспечить ровную поверхность жидкости.
  3. Приготовление концентрированного клея
    1. Добавьте 4,07 мл 30% ACR, 3,05 мл 1% BIS, 5 мл 25% сахарозы, 0,5 мл 10% APS, 5 мл 1М Tris (pH = 6,8), 0,05 мл TEMED и 32,33 мл деионизированной воды в чистый стакан последовательно, хорошо перемешайте, чтобы получить 50 мл маточного раствора (с концентрацией полиакриламида 3,05%), добавьте в стеклянную пробирку по 0,2 мл на корень. Полимеризуйтесь при комнатной температуре в течение 60 минут и запечатайте жидкость очищенной водой, чтобы обеспечить ровную поверхность жидкости.
  4. Приготовление консервационного раствора
    1. Взвесьте 6,4 г триса, 75 г сахарозы, 2,5 мл глицерина и 0,3 мл PC-300 (антибактериальный консервант) и добавьте 800 мл деионизированной воды, перемешайте до растворения, отрегулируйте значение pH до 6,8 и, наконец, разбавьте до 1000 мл. Концентрация Tris-HCl составляет около 52 мМ.
  5. Приготовление раствора для окрашивания суданского черного цвета
    1. Взвесьте 0,03 г суданского черного и растворите его в смеси из 2 мл этиленгликоля, 6 мл безводного этанола и 2 мл диметилсульфоксида. После фильтрации разделите его на 1 мл на флакон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с суданским черным и диметилсульфоксидом надевайте нитриловые перчатки и защитные очки для предотвращения прямого контакта. Операции должны проводиться в проветриваемой среде. Немедленно промойте кожу и глаза водой после контакта, затем при необходимости обратитесь за медицинской помощью.
  6. Внутренняя упаковка
    1. Полная упаковка в соответствии с требованиями к составу набора.

2. Состав набора

  1. Убедитесь, что продукт содержит сборные колонны, консервирующий раствор и раствор для окрашивания суданским черным цветом. Сборные колонки должны содержать акриламид, бисакриламид, сахарозу, персульфат аммония, трис и тетраметилэтилендиамин. Длина сборной колонны составляет 75 ± 0,5 мм, внутренний диаметр – 5,5 ± 0,02 мм, наружный – 7,0 ± 0,02 мм. Консервирующий раствор должен содержать трис, сахарозу, глицерин, консерванты. Раствор для окрашивания суданского черного цвета должен содержать суданский черный, этиленгликоль, безводный этанол и диметилсульфоксид. Убедитесь, что характеристики упаковки различаются в зависимости от количества сборных колонок. На одну порцию реагента должна приходиться одна сборная колонка. Не объединяйте наборы реагентов разных партий, так как это может повлиять на результаты экспериментов.

3. Подготовка образцов

  1. Подготовка пациента: Убедитесь, что пациент находится на пустой желудок во время забора образцов крови.
  2. Используйте пробирки для отбора проб геля для разделения сыворотки и проводите сбор проб в соответствии со стандартной операционной процедурой. Кровь должна быть отделена как можно скорее после забора крови, чтобы избежать гемолиза.
  3. Как можно скорее протестируйте образцы сыворотки после разделения при комнатной температуре. Если немедленное тестирование невозможно, храните образцы при температуре 2-8 °C до 7 дней или при -20 °C до 30 дней.
  4. Восстановите образцы до комнатной температуры и полностью перемешайте перед использованием, особенно для замороженных и размороженных образцов. Повторное замораживание-размораживание не допускается, так как это может нарушить целостность образца. Как липемия, так и образцы гемолиза могут повлиять на результаты теста. Если речь идет о легкой липемии или образце гемолиза, рекомендуется провести высокоскоростное центрифугирование при температуре 14 462 x g при комнатной температуре в течение 15 минут. Для образцов липемии используйте пипетку, чтобы отсасывать весь прозрачный слой снизу. Для образцов для гемолиза соберите надосадочную жидкость. Затем переложите его в новую пробирку центрифуги и покрасьте. Однако, если липемия или гемолиз протекают очень тяжело, рекомендуется снова взять кровь.

4. Этапы работы

  1. Подготовка
    1. Выньте сборные колонны и образцы для тестирования. С помощью пипетки отсасывайте остаточную консервационную жидкость из отверстия для отбора проб сборных колонок. Сбалансируйте предварительно изготовленные колонки и образцы до комнатной температуры и растворите 14,3 г электрофоретического буферного порошка с 800 мл деионизированной воды.
  2. Краска
    1. Возьмите чистые центрифужные пробирки и пронумеруйте их. Количество пробирок соответствует порядку пробирок для забора крови. Добавьте в пробирки центрифуги в соотношении 50 мкл образца на 10 мкл раствора суданского черного окрашивания, хорошо перемешайте и дайте постоять 30 минут при комнатной температуре до окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Принцип окрашивания суданского черного основан на его липофильных свойствах. Он может вызывать специфические хромогенные реакции с липидными веществами, такими как нейтральные жиры, фосфолипиды и стероиды в клетках, в результате чего образуются коричневато-черные или темно-черные частицы. В этой системе мы оптимизировали время окрашивания и дозировку с помощью однофакторного экспериментального дизайна со следующим протоколом. Отбираются три образца сыворотки ХС ЛПНП (высокая, средняя и низкая концентрации) с соответствующими объемами окрашивания 5 мкл, 10 мкл, 15 мкл и 20 мкл соответственно. Продолжительность окрашивания составляет 10 минут, 15 минут, 20 минут, 25 минут, 30 минут, 35 минут, 45 минут и 60 минут. Проводятся электрофоретические эксперименты с последующим анализом электрофоретических полос в оттенках серого для проверки эффективности окрашивания. Оптимальными условиями определен объем окрашивания 10 мкл с продолжительностью окрашивания 30 мин ± 5 мин. Меньший объем и продолжительность окрашивания приводят к слабо окрашенному холестерину липопротеинов. Несмотря на то, что в оптимальных условиях достигнут баланс, нет необходимости в более высоком объеме и продолжительности окрашивания.
  3. Ионофортическое разделение
    1. Вставьте предварительно уравновешенные колонны в резиновое гнездо бака для электрофореза. Отверстие для отбора проб гелевой колонки находится на расстоянии около 2 см от резиновой пробы. Убедитесь, что он плотно закрыт и не происходит утечки. Когда количество столбцов с гелем для образцов не заполнится, заполните пустое пространство резиновой пробкой без отверстий.
    2. Затем залить буфер для электрофореза в верхний и нижний резервуары. Удалите пузырьки в устье сборных колонн. Добавьте 25 мкл окрашенных образцов в порт для образцов сборных колонок.
    3. Накройте крышку, подключите выключатель питания и установите параметры напряжения (U = 100 В), тока (I = 3 мА/лампа), мощности (P = 120 Вт), времени (T = 70 мин) для разделения электрофореза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение, мощность и время являются фиксированными параметрами. Ток необходимо устанавливать в соответствии с количеством испытуемых образцов (например, 10 пробирок для образцов, I = 3 мА x 10 пробирок = 30 мА).
    4. После завершения электрофореза выключите питание, снимите крышку и вылейте буфер для электрофореза на верхнюю часть аппарата для электрофореза. Выньте по очереди гелевые колонки и поместите их на фиксирующую рамку, вылейте излишки буфера электрофореза на верхнюю поверхность и проанализируйте в сканирующей системе анализа.
  4. Сканирующий анализ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тип анализатора - DY-03, а программное обеспечение для сканирования - KBL 3.3.9 GD.
    1. Включите выключатель питания сканирующего анализатора, дважды щелкните программное обеспечение настольной системы и нажмите кнопку Коллекция , чтобы войти в программный интерфейс. Нажмите «Экспортировать лоток для образцов » в интерфейсе программного обеспечения, поместите гелевые колонки на штатив для образцов так, чтобы конец для отбора проб был обращен внутрь устройства. Убедитесь, что гелевые колонки размещены в соответствующих пронумерованных положениях. Позиции 25 и 26 предназначены только для контроля качества.
    2. Нажмите кнопку «Импортировать лоток для образцов» в интерфейсе программного обеспечения, чтобы импортировать лоток для образцов в устройство. Нажмите кнопку Сканировать, чтобы получить образцы изображений сканирования. В устройство встроена система автофокусировки. Он автоматически регулирует фокусировку между сканирующим модулем и гелевой трубкой для обеспечения четкого изображения. Программное обеспечение автоматически определяет начальное положение (ЛПОНП) и конечное положение (ЛПВП) электрофорограммы. Когда в этих положениях обнаруживаются очевидные пики, программное обеспечение фиксируется на назначенной области анализа для спектрального анализа.
    3. После ввода информации о пациентах и сканирования штрих-кода нажмите «Анализ и обработка » в интерфейсе программного обеспечения, система автоматически проанализирует и сформирует отчеты об анализах. Нажмите кнопку Загрузить ЛИС , чтобы перенести отчеты о тестировании в систему ЛИС.
    4. После сканирования и анализа сборные колонны извлеките и обработайте их в соответствии со спецификациями медицинских отходов.

5. Контроль качества

  1. Перед ежедневным тестированием образцов проведите двухуровневый контроль качества. Этапы проведения испытания контроля качества такие же, как и при испытании образца. Эталон типа А — средний диаметр частиц больше 268 Å. Эталон типа B — средний диаметр частиц меньше 265 Å.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ результатов: ТИП А, средний размер частиц ЛПНП составляет > 268 Å, на долю ЛПНП1 и ЛПНП2 приходится больше, что указывает на низкий риск сердечно-сосудистых заболеваний. ТИП ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ (ТИП INT), средний размер частиц ЛПНП составляет от 265 до 268 Å, что указывает на то, что соотношение ЛПНП3 и ЛПНП7 выше критического значения. ТИП В, средний размер частиц ЛПНП составляет < 265 Å, на долю ЛПНП3-ЛПНП7 приходится больше, что указывает на высокий риск развития ССЗ.

6. Технические усовершенствования

  1. Для обеспечения точных результатов диагностики необходимо внедрить следующие технические усовершенствования.
    1. Предварительное обследование: Убедитесь, что пациенты полностью натощак перед забором крови. Используйте сыворотку или антикоагулянтную плазму ЭДТА вместо гепариновой антикоагулянтной плазмы. Убедитесь, что пипетка точно поглощает данные. Избегайте тяжелых хилезных или гемолитических образцов.
    2. Во время обследования: Установите параметры электрофореза напряжения (U = 100 В), тока (I = 3 мА/лампа), мощности (P = 120 Вт), времени (T = 70 мин) в соответствии со стандартными протоколами. Надевайте стерильные перчатки, чтобы предотвратить загрязнение стеклянных трубок, которое может повлиять на возможность фото- и сканирования.
    3. После обследования: При составлении отчетов просмотрите аномальные хроматограммы на предмет потенциальных помех и проведите повторный анализ, чтобы избежать предоставления неправильных диагностических выводов.
      1. Нормальная хроматограмма: в начальном положении ЛПОНП и в конечной позиции ЛПВП оба имеют отчетливый пик (см. раздел «Репрезентативные результаты»).
      2. Хроматограмма аномалии: в начальном положении ЛПОНП или в конечной позиции ЛПВП не имеет или имеет более одного пика.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование направлено на изобретение метода с использованием PAGE для обнаружения субфракций липопротеинов в сыворотке крови участников. Цель состоит в том, чтобы определить, являются ли субфракции ХС ЛПНП в первую очередь крупными частицами (ЛПНП1 и ЛПНП2) или мелкими частицами (от ЛПНП3 до ЛПНП7). После окрашивания суданским черным образцы разделяют с помощью устройства для электрофореза в полиакриламидном геле. Затем липопротеины разделяются на отдельные полосы внутри гелевых пробирок, и субфракционный анализ вы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что роль sdLDL как фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний в развитии атеросклероза подтверждена исследованиями, в настоящее время не существует установленного метода выявления субфракций ЛПНП. За последние несколько десятилетий был достигнут значительный прогресс в разработке методов обнаружения субфракций ЛПНП. UC считается золотым стандартом. Он может разделять субфракции ЛПНП на основе их разницы в плотности, различая sdLDL и lbLDL с высоким разрешением. Однако ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование поддержано грантами Фонда медицинских исследований и науки провинции Гуандун (A2024108).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Электрофоретический буферный порошокТехнологическая компания Guangxi Kangbolai25030401Для приготовления буферных растворов и обеспечения условий электрофореза
Высококачественные продукты контроля качестваТехнологическая компания Guangxi Kangbolai25030301Для контроля точности и прецизионности
Раствор для разделения плотности липопротеинов (градиентный гель-электрофорез)Технологическая компания Guangxi KangbolaiLSS60-SB1-A1  25030301Для отделения компонентов подтипа липопротеинов из образцов сыворотки крови
Продукты контроля качества с низкой стоимостьюТехнологическая компания Guangxi Kangbolai25030301Для контроля точности и прецизионности
Суданский раствор для черного окрашиванияТехнологическая компания Guangxi KangbolaiLSS60-SB1-A1  25030301Для окрашивания образцов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  2. Li, J. J., et al. 2023 Chinese guideline for lipid management. Front Pharmacol. 14, 1190934(2023).
  3. Kong, P., et al. Inflammation and atherosclerosis: signaling pathways and therapeutic intervention. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 131(2022).
  4. Xiang, Q., et al. New insight into dyslipidemia-induced cellular senescence in atherosclerosis. Biol Rev Camb Philos Soc. 97 (5), 1844-1867 (2022).
  5. Chen, L., et al. Low-density lipoprotein cholesterol, cardiovascular disease risk, and mortality in China. JAMA Netw Open. 7 (7), e2422558(2024).
  6. Mansoor, T., et al. Inclisiran as a siRNA inhibitor of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9): past, present, and future. Am J Cardiovasc Drugs. 25 (3), 293-306 (2025).
  7. Alam, M. R., et al. Lipid profile of coronary heart disease patients: a prospective observational study. World J Cardiovasc Surg. 11 (11), 114-124 (2021).
  8. Thongtang, N., et al. Metabolism and proteomics of large and small dense LDL in combined hyperlipidemia: effects of rosuvastatin. J Lipid Res. 58 (7), 1315-1324 (2017).
  9. Wang, J., et al. Discordance of small dense LDL cholesterol beyond LDL cholesterol or non-HDL cholesterol and carotid plaque. JACC Asia. 5 (8), 1012-1028 (2025).
  10. Ivanova, E. A., et al. Small dense low-density lipoprotein as biomarker for atherosclerotic diseases. Oxid Med Cell Longev. 2017, 1273042(2017).
  11. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  12. Li, J., et al. The EGR3 gene modulates CRP and VCAM-1 expression to promote the development of atherosclerosis. Gene. 963, 149630(2025).
  13. Rodríguez-Fernández, M. A., et al. Virtual screening and molecular dynamics of cytokine-drug complexes for atherosclerosis therapy. Int J Mol Sci. 26 (7), 2931(2025).
  14. Ikezaki, H., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol is the most atherogenic lipoprotein parameter in the prospective Framingham offspring study. J Am Heart Assoc. 10 (5), e019140(2021).
  15. Higashioka, M., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol and the risk of coronary heart disease in a Japanese community. J Atheroscler Thromb. 27 (7), 669-682 (2020).
  16. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  17. Kanonidou, C. Small dense low-density lipoprotein: analytical review. Clin Chim Acta. 520, 172-178 (2021).
  18. Joint Committee on the Chinese Guidelines for Lipid Management. Chinese guidelines for lipid management (2023). Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 51 (3), 221-255 (2023).
  19. Jha, M., et al. Lipoprotein(a) - from biomarker to therapy: a review for the clinician. Am J Cardiol. 245, 42-53 (2025).
  20. Hirano, T. Clinical significance of small dense low-density lipoprotein cholesterol measurement in type 2 diabetes. J Diabetes Investig. 16 (3), 370-383 (2025).
  21. Rief, M., et al. Comparison of two nuclear magnetic resonance spectroscopy methods for the measurement of lipoprotein particle concentrations. Biomedicines. 10 (7), 1766(2022).
  22. Kroner, G. M., et al. Retrospective comparison of results for simultaneous orders for LDL particle count, apolipoprotein B, and LDL-C. Clin Chim Acta. 518, 38-42 (2021).
  23. Chary, A., et al. Association of LDL-cholesterol subfractions with cardiovascular disorders: a systematic review. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 533(2023).
  24. Duan, R., et al. Estimation of the LDL subclasses in ischemic stroke as a risk factor in a Chinese population. BMC Neurol. 20 (1), 414(2020).
  25. Kotani, K., et al. Similarity and differences in small dense low-density lipoprotein assessment: two methods compared. Arch Med Sci Atheroscler Dis. 6, e166-e168 (2021).
  26. Simachew, Y. M., et al. Lipoproteins and cholesterol homeostasis in paediatric nephrotic syndrome patients. Biochem Med (Zagreb). 32 (2), 020706(2022).
  27. Hirano, T. Hypertriglyceridemia contributes significantly to high prevalence of small dense LDL-cholesterol in patients with type 2 diabetes, even when LDL-C targets are achieved. Diabetol Int. 14 (3), 288-293 (2023).
  28. Zhang, C., et al. Lipid and lipoprotein particle profiles in patients with type 2 diabetes mellitus: a comparative study between highlanders and lowlanders. Lipids. 60 (5), 293-302 (2025).
  29. Waldmann, E., et al. Effect of PCSK9 inhibition with evolocumab on lipoprotein subfractions in familial dysbetalipoproteinemia (type III hyperlipidemia). PLoS One. 17 (3), e0265838(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи