Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Интеграция сетевой фармакологии для изучения защитного эффекта циннамальдегида против нейротоксичности, вызванной оксалиплатином

469 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69013

⸱

28 ноября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании изучаются защитные эффекты циннамальдегида (CA) против повреждений, вызванных оксалиплатином (OXA), в клетках ганглия дорзального корня (DRG) у крыс. Основной механизм заключается в подавлении сигнального пути JAK2/STAT3 и активации пути SLC7A11-GSH-GPX4, что было выявлено с помощью сетевой фармакологии и экспериментальной валидации.

Аннотация

В данном исследовании изучаются защитные эффекты циннамальдегида (CA) против повреждений, вызванных оксалиплатином (OXA), в клетках ганглия дорзального корня (DRG) у крыс. Фармакологическая активность CA была проанализирована, а её потенциальные цели, наряду с метаболитами, выявлены с помощью платформы базы данных и анализа традиционных китайских медицинских систем (TCMSP), интегративной фармакологической сетевой вычислительной исследовательской платформы традиционной китайской медицины (TCMIP) и платформ PharmMapper. Анализ CCK-8 используется для определения оптимальных концентраций лекарств, а анализы на малондиалдегида (MDA) применяются для оценки уровня перекисления липид. Внутриклеточные уровни Fe2+ и реактивных видов кислорода (ROS) были количественно измерены с помощью флуоресцентных зондов. Влияние CA на уровень экспрессии белков, включая p-STAT3, XCT и GPX4, в клетках DRG, обработанных OXA, было изучено с помощью иммуноблоттинга. Анализ сетевой фармакологии выявил 14 пересекающихся мишеней среди «CA-невропатической боли (NP)-ферроптоза». Экспериментальные результаты показали, что 24-часовая обработка с 4,0 мкмоль/л CA даёт оптимальные эффекты, значительно снижая уровни MDA, Fe2+ и ROS в клетках DRG (P < 0,05). Кроме того, лечение CA снижало экспрессию JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 и ядерного фактора-каппа B (NF-κB) (P < 0,05), одновременно повышая экспрессию XCT, GPX4 и FTH1 (P < 0,05). Эти данные свидетельствуют о том, что CA смягчает повреждения, вызванные OXA, в клетках DRG, ингибируя сигнальный путь JAK2/STAT3 и активируя ось SLC7A11-GSH-GPX4.

Введение

В последние годы ферроптоз, как неапоптотический способ клеточной гибели, доказано участвует в повреждении тканей, вызванном различными химиотерапевтическими препаратами. Основной механизм ферроптоза — накопление железозависимых продуктов перекислениялипидов 1. Исследования механизмов нейротоксичности цисплатина показывают, что этот препарат индуцирует нейронный ферроптоз через несколько путей, при этом этот процесс напрямую связан с развитием нейротоксичности. В частности, цисплатин ингибирует активность глутатион пероксидазы 4 (GPX4). Как критическая «тормозная молекула» при ферроптозе, инактивация GPX4 препятствует удалению липидных гидропероксидов (L-OOH), тем самым вызывая окисляющее повреждение мембран нейронныхклеток 2. Тем временем оксалиплатин способствует высвобождению ферроптоза в нервных клетках и усиливает образование реактивных форм кислорода (ROS) в результате реакции Фентона, что дополнительно усиливает каскадферроптоза 3. Эти данные свидетельствуют о том, что целенаправленная регуляция нейродегенерации может быть потенциальной стратегией для снижения нейротоксичности оксалиплатина.

Оксалиплатин (OXA), широко используемый платиновый химиотерапевтический препарат третьего поколения при лечении колоректального рака, обладает высокой противоопухолевой эффективностью, но часто связан с значительной нейротоксичностью. Хроническое применение часто приводит к невропатической боли, вызванной ОКСА, с частотой заболеваемости 60%4, характеризующейся механической аллодинией, термической гипералгезией и гиперчувствительностью кхолоду 5. Несмотря на распространённость, текущие стратегии лечения OINP остаются недостаточными, что существенно снижает качество жизни пациентов. Следовательно, выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе OINP, и выявление новых терапевтических целей остаются ключевыми областями текущихисследований 6.

Циннамальдегид (CA), основной активный компонент эфирного масла корицы, представляет собой жёлтую вязкую жидкость 7,8 с разнообразной биологической активностью, включая инсектицидныепрепараты 9, антимикробные10, противогрибковые11,антиоксиданты 12,антидиабетические 13,противораковые 14, противовоспалительные и нейроваскулярные защитныеэффекты 15,16. Новые данные свидетельствуют о том, что CA может подавлять активацию сигнального пути JAK/STAT 17. Химическая формула CA — C9H8O, а его химическая структура показана на рисунке 1. Как природный мономер традиционной китайской медицины, CA демонстрирует широкий спектр фармакологических свойств. Что касается нейропротекции, ряд исследований подтвердил, что CA может проникать в центральную нервную систему через гематоэнцефалический барьер, способствовать экспрессии антиоксидантных ферментов (таких как HO-1 и NQO1), активируя сигнальный путь Nrf2/ARE, снижать накопление ROS в нервных клетках и, таким образом, снижать нейрооксидативное повреждение при ишемическом инсульте, болезнь Альцгеймера и другиеболезни 18,19. В то же время CA может подавлять гиперактивацию микроглии, снижать выделение воспалительных факторов (таких как TNF-α, IL-1β) и снижать нейровоспалительныйответ 20. Однако не было сообщено о том, может ли СА облегчить нейротоксичность, вызванную оксалиплатином, регулируя путь ферроптоза.

Сигнальный путь JAK2/STAT3 — важный внутриклеточный механизм передачи сигналов, поступающих через клеточную мембрану, к ядру клетки, и тесно связан с ключевыми биологическими процессами, такими как пролиферация клеток, дифференциация, апоптоз, окисляющий стресс и воспалительныеответы 21. Как путь, тесно связанный с воспалительными реакциями, сигнальный путь JAK3/STAT3 может запускать воспалительные реакции в активированном состоянии, приводя к воспалительному повреждению тканей. Исследования показывают, что ингибирование сигнального пути JAK3/STAT3 может уменьшить воспалительный ответ и окислительное повреждение у крыс с сосудистой деменцией, тем самым улучшая когнитивную функциюкрыс 22. Кроме того, ингибирование сигнального пути JAK3/STAT3 также может облегчить воспалительные реакции у эпилептических крыс, снизить частоту нейронного апоптоза и смягчить повреждениямозга 23. Хотя кофеиновая кислота (КА) оказывает определённый защитный эффект на нервную систему, связан ли её эффект улучшения с регуляцией сигнального пути JAK3/STAT3, пока не является однозначным выводом.

Цель данного исследования — проверить, могут ли in vitro ингибирование сигналов JAK2/STAT3 и активация оси LC7A11-GSH-GPX4 смягчить повреждение, вызванное OXA, в клетках DRG крыс. Кроме того, рассматриваются потенциальные антиферроптотические эффекты КА и роль ключевых мишеней, выявленных с помощью сетевой фармакологии, в модулировании воспаления в клетках DRG.

Современные терапевтические подходы к нейротоксичности, вызванной оксалиплатином, в первую очередь сосредоточены на хелатировании свободных ионов платины для снижения повреждения нервов, например, с использованием комплексов кальция и магния, с основной целью облегчения острых периферических невропатий (например, онемения и покалывания в руках и ногах)24. Однако точные механизмы остаются неясными. Эти методы лечения не способны обратить хронические состояния, такие как аксональная дегенерация и разрушение нервных волокон, вызванные оксалиплатином, и демонстрируют ограниченную эффективность в предотвращении кумулятивной нейротоксичности. В этом эксперименте был изучен нейропротекторный эффект терапии 4 мкм CA под 5 мкм OXA путём сочетания противовоспалительных и противоферроптозных механизмов. Результаты подтверждают, что активация этого механизма служит критически важным этапом запуска OINP. Открытие специфических ингибиторов может заменить существующие неспецифические подходы, тем самым повышая как точность, так и эффективность терапевтических вмешательств.

Модель in vitro , используемая в этом эксперименте, включает изолированные ганглионные нейроны дорзального корня (DRG) крыс для изучения OINP. Однако эта модель значительно отличается от человеческих первичных клеток по генетическому фону, метаболическим характеристикам и чувствительности к токсичности, что может затруднять клиническое применение исследовательских выводов. Кроме того, функциональное поддержание нейронных тканей in vivo зависит от точной регуляции многоклеточной координации и динамических микроокружений — сложных факторов, которые сложно полностью воспроизвести in vitro модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия была получена от клеточных линий крыс.

1. Анализ фармакологии в сети

ПРИМЕЧАНИЕ: Ссылки можно найти в Таблице материалов.

  1. Поиск возможных целей CA
    1. Получите структурную информацию из базы данных PubChem и изучите потенциальные биологические механизмы КА. Затем провести анализ прогнозирования целей с помощью SwissTargetPrediction, используя его передовые вычислительные возможности.
    2. Для повышения точности и всесторонности анализа можно сравнить прогнозируемые цели с базами данных, специфичных для традиционной китайской медицины, включая TCMSP и TCMIP.
    3. Изучите соответствующую литературу для выявления дополнительных потенциальных целей. Дублировать объединённый список целей для создания комплексного набора данных, который служит важным ориентиром для дальнейших исследований биологической активности и разработки лекарств с участием КА.
  2. Выявление потенциальных мишеней невропатической боли (NP)
    1. Используя базы данных GeneCards и TTD, проведите обширный поиск по ключевым словам «невропатическая боль» и «ферроптоз». Отдавайте приоритет генным мишеням из базы данных GeneCards с «Рейтингом релевантности», превышающей медиану, поскольку эти гены демонстрируют более высокую релевантность для направления исследования.
    2. Интегрировать ранее выбранные генные мишени с данными, полученными из TTD (Терапевтической базы данных). Обеспечить всестороннюю идентификацию потенциальных целей в процессе интеграции, сверяя все выбранные генные мишени с записями базы данных TTD. Систематически удалять дублирующиеся записи из интегрированного набора данных генных мишеней. Проверьте, содержит ли полученный набор данных уникальный список потенциальных целей.
  3. Идентификация целей пересечения «CA-NP-Ферроптоз»
    1. Определите пересечение мишеней для CA, NP и ферроптоза с помощью диаграммы Венна, сгенерированной онлайн.
    2. Эти цели пересечения были определены как потенциальные кандидаты для «путь NP-ферроптоза, регулируемого CA».
  4. Построение сети взаимодействия белков и белков (PPI)
    1. Для дальнейшего изучения отправьте в базу данных STRING общие мишени для «CA-NP-ферроптоз», «CA-NP» и «CA-ферроптоз».
    2. Установите порог оценки взаимодействия на уровне «максимальной уверенности > 0,4» и ограничьте максимальное количество взаимодействий 10 для первого и второго слоёв взаимодействия. Примените стандартные настройки для всех остальных параметров и постройте сеть PPI 4.5 для «CA-NP-ферроптоза».
  5. Анализ обогащения GO и KEGG
    1. Загрузите цели пересечения для «CA-NP-ferroptosis» на платформу DAVID со следующими параметрами: «выбрать идентификатор: официальный генетический символ», «тип списка: генелист» и «вид: Homo sapiens». Анализ обогащения генной онтологии (GO) проводился по трём категориям: биологический процесс (BP), клеточный компонент (CC) и молекулярная функция (MF).
    2. Проведите анализ обогащения путей KEGG и визуализируйте полученные данные с помощью бар-графиков, созданных на платформе Hiplot.

2. Молекулярная стыковка

  1. Чтобы прояснить взаимодействие между активными соединениями и их мишенями, связанными с болезнью, получите структурную информацию о активных веществах из базы данных PubChem в виде малых молекул, а также извлечете 3D-структуры мишенных белков из Protein Data Bank (PDB) в виде белковых моделей.
  2. Используйте PyMOL для предварительной обработки белковых рецепторов, удаляя молекулы воды и несущественные лиганды. Затем подготовьте целевые белки и активные вещества к стыковке с помощью AutoDock Tools 1.5.7 и выполните полугибкое молекулярное стыковывание с помощью AutoDock Vina.
  3. Проанализировать энергии связывания и активные участки связывания веществ на рецепторных белках. Для белка JAK2 его структура (PDB ID: 3e64) была выбрана из базы данных PDB на основе данных рентгеновской кристаллографии и оптимального разрешения.
  4. Используйте программное обеспечение PyMOL для подготовки структуры JAK2, исключая лиганды, удаляя молекулы воды и добавляя водороды. Маломолекулярные структуры активных соединений были получены из PubChem.
  5. Загрузите как белки, так и составные структуры в AutoDock Tools 1.5.7, определите стыковочные коробки и выполните молекулярное стыковывание с помощью AutoDock Vina.

3. Клеточная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги будут многократно использоваться в эксперименте валидации. Придерживайтесь строгих асептических методов. В этой части эксперимента использовалась низкоскоростная горизонтальная роторная центрифуга.

  1. Дезинфицируйте внешнюю упаковку и бутылки стерильных клеток, купленных с 75% алкоголем, а затем переместите в посуды на сверхчистом верстаке для субкультуры, пока клетки не будут распределены по пяти чашкам Петри диаметром 10 см, чтобы обеспечить достаточное количество клеточного запаса.
  2. Криоконсервировать клетки при -80 °C для последующих экспериментов.
    1. Приготовьте DMEM, DMSO клеточной культуры, сыворотку для плода (FBS), центрифугные трубки на 15 мл, пипетки, криовиалы и ледяную ванну. Смешайте 1 мл DMSO, 1 мл FBS и 8 мл DMEM, чтобы получить общий объём 10 мл. Охлаждайте DMSO на льду на 15 минут. Сначала перенесите базовую среду в трубку центрифуга, затем медленно добавляйте предварительно охлаждённый DMSO при вращении. Тщательно перемешайте пипеткой, затем аккуратно добавьте FBS и снова перемешайте. Храните смесь в ледяной ванне для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация 20%-50% ДМСО вызвала значительное увеличение высвобождения ЛДГ, что указывает на то, что высокие концентрации ДМСО являются цитотоксичными, тогда как 10% ДМСО относительно безопасны. Это не повлияло на наш эксперимент25.
    2. Возьмите логарифмически растущие клетки, промыйте их 3 раза с PBS, затем добавьте 0,25% трипсина на чашку 400 мкл/10 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только происходит цитоплазматическое втягивание, соединения становятся ослабленными или при появлении признаков крупномасштабного плавания, процесс переваривания немедленно останавливается.
    3. Подготовка до варения: Разогреть ключевые реагенты (0,25% раствора трипсина-ЭДТА и полную среду DRG) до 37 °C. Вынимите колбу с клеточной культурой из инкубатора и выбросьте старую среду стерильной пипеткой, чтобы предотвратить влияние остаточной среды на эффективность пищеварения. Аккуратно промыйте однослойные культивированные клетки дважды стерильным PBS 5 мл, чтобы удалить остатки сыворотки, избегая выделения клеток.
    4. Добавьте 2 мл предварительно нагретого раствора трипсина-EDTA 0,25% в сосуд для культуры, чтобы он полностью покрыл отдельный слой клеток. Инкубировать при комнатной температуре 1-3 минуты. В этот период наблюдайте клетки под перевёрнутым микроскопом каждые 30 секунд. Немедленно прекратите пищеварение, когда большинство клеток начинают сжиматься, становиться круглыми и появляться чётко выраженные межклеточные пространства (чтобы предотвратить переварение и повреждение клеток).
    5. Быстро добавьте 4 мл полностью нагретого среднего вещества в сосуд для культуры. Аккуратно пипетируйте смесь 5 раз стерильной пипеткой, чтобы рассеять клеточный кластер в одноклеточную суспензию. Перенесите всю суспензию с одной ячейкой в стерильные центрифугные трубки ёмкостью 15 мл и собирайте гранулу ячейки с центрифугой на 300 x g 5 минут с использованием низкоскоростной горизонтальной роторной центрифуги при 25 °C.
    6. Сбросьте супернатант и добавьте 5 мл подготовленного криоконсервационного материала. Аккуратно дуйте пипеткой, чтобы равномерно перемешать клетки. Распределите их равномерно по 5 флаконам.
    7. Помечайте криовиал именем клетки, датой заморозки и оператором; Поместите его в заморозительный контейнер и храните в морозильнике при -80 °C, затем перенесите в жидкий азот после ночного хранения.
  3. Реанимация клеток
    1. Наденьте перчатки, достаньте флакон из контейнера с жидким азотом и немедленно окуните его в тёплую воду при температуре 37 °C, время от времени встряхивая для быстрого размораивания (в течение 1 минуты).
    2. Вынимите флакон из водяной бани при температуре 37 °C, откройте крышку, аспирируйте суспензию клетки пипеткой, перенесите в центрифугную трубку, добавьте в 10 раз больше объёма культурной среды, хорошо перемешайте и центрифугуйте при 300 х г в течение 5 минут (25 °C).
    3. Выбросьте супернатант, добавьте 5 мл культурной среды, дополненную сывороткой из 10% плода бычьего скота (полная среда для такого состояния клеточной культуры), инокулируйте посевную чашу и инкубируете статически в инкубаторе с температурой 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 .
    4. На следующий день замените посевную среду (чтобы удалить остатки DMSO и мёртвые клетки) и продолжайте наблюдать за культурой на предмет условий роста. Если плотность клеток высокая, немедленно проводите субкультуру для последующих экспериментов.
  4. Подсчёт клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части эксперимента использовалась низкоскоростная горизонтальная роторная центрифуга.
    1. Заранее подготовьте 75% спирта, чтобы очистить камеру для счёта и накрыть шлиф, затем высушите их для последующего использования.
    2. Суспензировать переваренные и центрифугированные клетки в 1 мл среды и разбавить 50 мкл суспензии клетки 150 мкл среды в 1,5 мл EP для четырёхкратного разбавления.
    3. Колебайтесь равномерно, берите 10 мкл и вводите между камерой для накладки и счётной камеры, чтобы полностью заполнить камеру, избегая пузырьков. Поместите под микроскоп для наблюдения и подсчёта. Принципы подсчёта: не пропускайте и не пересчитывайте; Считайте ячейки, касающиеся верхней и левой границ, но исключайте те, что касаются нижней и правой границ.
    4. В соответствии с экспериментальными требованиями рассчитывать объём ячеек на основе желаемого количества ячеек для нанесения или посева в тарелке и результатов подсчёта, а затем дополнить общий объём среды полным материалом.

4. Протокол анализа жизнеспособности клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Дулоксетин был выбран в качестве контрольного агента Western Medicine, поскольку он широко используется и клинически валидирован препарат для лечения периферической невропатической боли. Её установленная эффективность в этом показании (подтверждённая клиническими рекомендациями и рандомизированными контролируемыми исследованиями) гарантирует, что контрольная группа может предоставить надёжный ориентир для оценки относительной эффективности вмешательства теста.

  1. Сначала сбросьте старую культурную среду из сосуда и промыйте поверхность клетки 5 мл PBS, чтобы удалить остаточную сыворотку. Затем добавьте 2 мл раствора 0,25% трипсина-EDTA и инкубируете при комнатной температуре 1-3 минуты. Когда микроскопическое наблюдение выявит усадку, округление и отслоение клеток, немедленно добавьте 4 мл DRG Complete Medium, чтобы прекратить расщепление и восстановить клетки с помощью пипетирования.
  2. Перенесите подвеску ячейки в центрифугную трубку и соберите гранулу ячейки, центрифугируя при 300 x g в течение 5 минут с использованием низкоскоростной горизонтальной роторной центрифуги при 25 °C. Сбросьте супернатант и снова суспензируйте клеточную гранулу в центрифугной трубке на 15 мл, затем тщательно суспензируйте и смешайте суспензию.
  3. Возьмите трубку EP объемом 1,5 мл и сначала добавьте 150 мкл культурной среды, затем 50 мкл клеточной суспензии. Хорошо перемешайте, чтобы получить четырёхкратное разбавление.
  4. Затем используй 75% спирта для очистки счётной камеры, накрой стекло, высуши их и снова равномерно встряхни трубку EP.
  5. Вынимите 10 мкл суспензии ячейки и введите её между стеклом крышки и камерой счёта, чтобы жидкость заполнила камеру без образования пузырьков.
  6. Наблюдайте под микроскопом и подсчитывайте количество клеток согласно принципу подсчёта, избегая упущений или дублирований.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если подсчитанное количество ячеек равно n, то концентрация ячеек в центрифуге — n/mL.
  7. Согласно экспериментальным требованиям, клетки засеивают в пластину на 96 лунок с плотностью 2000 ячеек на скважину по мере необходимости.
  8. Сначала введите 200 мкл PBS в каждую яме периферического круга пластины с 96 луками, затем добавьте культурную среду с клетками в зависимости от группировки.
  9. После инкубации в инкубаторе с температурой 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 в течение 24 часов, аспирируйте старую среду и дважды промывайте 200 мкл PBS. Согласно экспериментальной установке, разбавьте CA поэтапно (0 мкм, 2 мкм, 4 мкМ, 8 мкм, 16 мкм, 32 мкМ) и добавьте 200 мкл к пластине с 96 лунками.
  10. Предварительно обработайте клетки OXA (5 мкм) в течение 24 часов, затем обработайте клетки DRG с разными концентрациями CA (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) в течение 24 часов соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел эксперимента направлен на определение оптимальной концентрации препарата для КА.
  11. Промой пластину на 96 лунок три раза буфером PBS, затем добавь 200 мкл свежеприготовленного рабочего раствора CCK-8 в каждую скважину. Этот этап выполняется в темноте, а время эксперимента контролируется так, чтобы завершиться в течение 10 минут. Инкубировать раствор в течение 4 часов в инкубаторе с 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 . Наконец, измерьте значения поглощения с помощью считывателя микропластин. Повторите все эксперименты не менее трёх раз при одинаковых условиях.

5. MDA

  1. Посейте 10 × 10 ячеек по6 DRG в чаше диаметром 15 см и выращивайте на ночь в инкубаторе с температурой 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 . Удалите посевную среду, добавьте лекарства и инкубуйте 24 часа в инкубаторе с влажностью 37 °C, влажностью 95% исодержанием CO2 5%.
  2. Снимите посевную среду и промыйте один раз 5 мл PBS. После пищеварения соберите клетки в коническую трубку с помощью среды DMEM.
  3. Добавьте обработанные клетки DRG в микропробирки объемом 5 мл соответственно. Центрифугуйте при 300 x g в течение 5 минут с низкоскоростной горизонтальной роторной центрифугой и удалите супернатант. Затем добавьте 1 мл PBS, перемешайте с помощью пипетирования и переведите в новую микротрубку объёмом 1,5 мл. Центрифугуйте при 300 x g в течение 5 минут с низкоскоростной горизонтальной роторной центрифугой и удалите супернатант.
  4. Добавьте 100 мкл антиоксидантного раствора PBS, пипетку для смешивания и подготовьте суспензию клетки. Подготовьте стандартное решение по MDA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. приготовление стандартного раствора MDA с использованием флуоресцентного метода; Обратитесь к разделу «Компоненты комплекта» для подробных процедур.
  5. Добавьте 100 мкл буфера Лизиса в пробирку и стандартную трубку соответственно и тщательно перемешайте с помощью вихревого осциллятора. Дайте постоять при комнатной температуре 5 минут.
  6. Добавьте 250 мкл подготовленного рабочего раствора в каждую трубку и тщательно перемешайте с помощью вихревого миксера. Нагрейте водяную ванну до 95 °C в естественной свете в течение 15 минут, затем поставьте её в ледяную ванну на 5 минут для охлаждения. Высокоскоростная угловая роторная центрифуга при 10 000 x g в течение 10 минут (4 °C).
  7. Возьмите 100 мкл супернатанта и добавьте его в чёрную пластину на 96 лунок. Измерьте интенсивность флуоресценции с помощью считывателя флуоресцентных микропластин (например: 540 нм, эм: 590 нм). Рассчитайте концентрацию MDA в образце на основе стандартной кривой.

6. Содержание Fe2+ в клетках, измеренных с помощьюнабора для обнаружения Fe2+

  1. Заранее разогрейте водяную ванну и поднимите температуру до 37 °C. Наденьте перчатки, добудьте клетки DRG из жидкого азота, заверните их в слой пластикового пакета, затем погрузите в тёплую воду при температуре 37 °C, слегка встряхивая, чтобы обеспечить полное оттаяване в течение 1 минуты.
  2. После размораживания достаньте флакон из водяной бани при температуре 37 °C, откройте крышку, аспирируйте суспензию ячейки, передайте её в центрифугную трубку на 15 мл и добавьте 10 мл культурной среды по каплею, тщательно перемешивая. Низкоскоростная горизонтальная роторная центрифуга при 300 x g в течение 5 минут (25 °C).
  3. После центрифугирования сбросьте супернатант, добавьте 10 мл свежей культурной среды, используйте пипетку для тщательного перемешивания и снова центрифугируете. Повторите эту процедуру 3 раза перед тем, как нанести инокуляцию на новые культурные тарелки.
  4. Культивируйте клетки статически в инкубаторе с влажностью 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 . На следующий день замените среду, чтобы удалить остатки DMSO и мёртвые клетки, затем продолжайте культивирование. Если плотность клеток высокая, своевременно выращивайте субкультуру. Затем собирайте клетки в логарифмической фазе роста, переваривают их, центрифугируют и восстанавливают. Засеять вновь взвешенные клетки в 12-колодцевые пластины плотностью 70%-80%, затем поместить пластины обратно в инкубатор с температурой 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 для дальнейшего выращивания.
  5. На следующий день наблюдайте состояние клетки, проводите соответствующие обработки в соответствии с экспериментальной установкой, а затем возвращайте их в инкубатор с температурой 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 для продолжения культивации.
  6. После 24 часов введения препарата выбросьте исходную культурную среду и промыйте клетки PBS. Добавьте 300 мкл/скважину зонда FerroOrange (1 мкм), разбавленного в HBSS, и инкубировать при 37 °C, влажности 95%, 5% углекислого газа в течение 30 минут.
  7. Затем добавьте к клеточной пластине раствор Hoechst 33342 для окрашивания живых клеток (100x) в соотношении 1:100, инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 5 минут, чтобы окрашить ядра клетки.
  8. Наблюдайте эффект окрашивания под флуоресцентным микроскопом и фотографируйте для документации. Затем используйте ImageJ для расчёта средней интенсивности флуоресценции, при этом эксперимент повторяется три раза для статистического анализа.

7. Набор для обнаружения ROS

  1. Возьмите клетки в логарифмической фазе роста, переварите, центрифугайте их и снова суспензируете, затем засейте клетки в пластине с 12 лунками с плотностью (70%–80%). После тщательного перемешивания ячеек поместите их в инкубатор с влажностью 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 для дальнейшего выращивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этапов пищеварения, центрифугирования и ресуспензии см. шаг 4.1.
  2. На следующий день наблюдайте за состоянием клетки, проводите соответствующие процедуры в соответствии с экспериментальной установкой, а затем возвращайте клетки в инкубатор с температурой 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 для продолжения культуры. После 24 часов введения препарата отбросьте исходную культурную среду и дважды промывайте клетки HBSS.
  3. Добавьте 200 мкл рабочего раствора DCFH-DA с красителем, затем инкубировать при 37 °C, влажности 95% и 5%CO2 в течение 30 минут.
  4. Сбросьте супернатант, дважды промывайте HBSS и окрашивайте 2 мкл раствора для окрашивания живых клеток Hoechst 33342 (100x) в течение 5 минут, затем осмотрите под флуоресцентным микроскопом. Повторите эксперимент три раза с помощью статистического анализа.

8. Митохондриальная морфология клеток, наблюдаемая с помощью ТЭМ

  1. Выбросить культурную среду из хорошо культивированных клеток, добавить 1 мл 2,5% раствора фиксирующего глутаральдегида комнатной температуры и зафиксировать клетки в темноте при комнатной температуре примерно на 5 минут. Аккуратно соскрести клетки в одном направлении с помощью скребка.
  2. Перенесите подвеску элемента в центрифугную трубку и центрифугу при 25 °C, 600 x g в течение 3 минут с использованием низкоскоростной горизонтальной роторной центрифуга.
  3. После удаления верхней части фиксирующего раствора добавьте свежий фиксатор для электронной микроскопии (используйте 1 мл на каждую яме для пластины с 12 луками), затем фиксируйте при комнатной температуре вдали от света на 30 минут, затем переведите на 4 °C для хранения.
  4. Инфильтрация при обезвоживании: Вставьте образец в пластину для встраивания и поместите его в духовку при температуре 37 °C на ночь.
  5. Полимеризуйте встраивающую среду в духовке при температуре 60 °C на 48 секунд. Вырежьте ультратонкие срезы диаметром 60-80 нм с помощью ультрамикротома.
  6. Покрасьте срезы раствором насыщенного спирта 2% уранилацетата в течение 15 минут, затем свинцовым цитратом ещё 15 минут. Высушите пятнистые участки на ночь при комнатной температуре. Наблюдайте и фотографируйте срезы под пропускающим электронным микроскопом.

9. Вестерн блоттинг

  1. Извлечение всего белка клеток
    1. Обработайте и инокулируйте клетки в чашку Петри диаметром 6 см, пока плотность не достигнет 70%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагу 3.3 для получения инструкций по возрождению клеток и вакцинации.
    2. В посевной чашке добавьте 3 мл OA (5 мкм), а через 4 часа — CA (4 мкм).
    3. Заранее подготовьте коробку со льдом, предварительно охладите PBS, скребки для клеток, подготовленный буфер для лизиса и несколько маркированных пробирок EP.
    4. После обработки лекарствами удалите культурную среду из клеток и дважды промывайте их предварительно охлаждённым PBS. Выполняйте этот процесс на льду и аспирируйте остатки PBS с помощью вакуумной центрифуги.
    5. Маркируйте каждую чашку Петри, затем добавьте 300 мкл буфера для лизиса и оставьте её на льду 5 минут с постоянным перемешиванием, чтобы предотвратить неполный лизис и заморозку.
    6. Затем используйте предварительно охлаждённый скребок для отсоединения клеящихся клеток, собирая 300 мкл в трубку EP после каждого соскребания. Используйте новый скребок для каждой очистки и не используйте его повторно.
    7. Держите верхнюю часть трубки EP и тщательно перемешайте на вихревом миксере, затем продолжайте ставить её на лёд на 25 минут. В этот момент заранее включите высокоскоростную центрифугу с угловым ротором при температуре 4 °C, так как предварительное охлаждение центрифуги требует определённого времени.
    8. После окончания таймера снова вихрь, затем высокоскоростная угловая роторная центрифуга при 4500 x g в течение 15 минут в центрифуге при температуре 4 °C.
    9. Теперь включите нагреватель для сухой ванны и установите температуру на 100 °C.
    10. Достаньте белковый набор BCA, добавьте образцы и реагенты в пластину на 96 лунок, хорошо перемешайте и отреагуйте в инкубаторе с температурой 37 °C, влажностью 95% и 5%CO2 в течение 30 минут. Измеряйте содержание извлеченного белка с помощью многофункционального считывателя микропластин, затем корректируйте с помощью оставшегося буфера лизиса на основе результатов, чтобы обеспечить постоянную концентрацию каждого образца.
    11. Наконец, исходя из содержания каждого супернатанта, добавьте 1/5 объема 6× буфера загрузки, чтобы подготовить систему загрузки белка. Аккуратно аспирируйте 150 мкл супернатанта в новую EP-трубку. Добавьте 30 мкл буфера 6× загрузки в супернатант и тщательно перемешайте (обычно в соотношении 1:5). Храните смесь на льду.
    12. Затем нагрейте при 100 °C на обогревателе 6 минут, обязательно удерживая крышку трубки EP, чтобы она не открылась. После нагрева охладите его в ледяной ванне.
  2. Приготовьте протеиновый гель с концентрацией 10%.
    1. Промывайте гелевую пластину чистой водой, сушите на воздухе, стирайте лишнюю влагу и максимально избегайте пятен и пыли.
    2. Достаньте гелевую подставку, с короткими пластинами двух стеклянных пластин спереди, длинными сзади, выровняя днища, чтобы зазор между стеклянными пластинами плотно прилегал к уплотнительной полосе внизу подставки, чтобы предотвратить протечку, затем надёжно зажмите пластины, чтобы подготовиться к гель-литке.
    3. Подготовьте нижний гель с 6 мл чистой воды, 3,75 мл 1,5 м три-HCl (pH 8,8), 0,15 мл 10% SDS, 5 мл 30% Acry/bis, 75 мкл 10% APS и 7,5 мкл TEMED.
    4. Аккуратно покрутите, чтобы избежать пены, затем быстро и равномерно добавляйте между двумя стеклянными пластинами, оставляя место для верхнего геля. Затем выровняйте жидкую поверхность 1 мл изопропанола и оставьте её стоять примерно 30 минут.
    5. Прополосните гребень для приготовления геля чистой водой, высушите на воздухе и отложите в сторону. Когда нижний гель полностью затвердеет, вылейте изопропанол, аккуратно промывайте 2-3 раза чистой водой, впитывайте жидкость и переверните гелевую пластину, чтобы слить оставшуюся жидкость.
    6. Приготовьте верхний гель для укладки с 6 мл чистой воды, 2,5 мл 0,5 м Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 мл 10% SDS, 1,34 мл 30% Acry/bis, 50 мкл 10% APS и 10 мкл TEMED.
    7. Заполните верхний слой и аккуратно вставьте гребень толщиной 1,5 мм. Через 1-2 минуты пополните зазоры, стараясь минимизировать образование пузырьков в этом процессе. Используйте полностью полимеризированный гель.
  3. Электрофорез с протеиновым гелем
    1. Заранее настройте Буфер Запуска и Буфер Передачи, при этом Буфер Передачи предварительно охлаждён в холодильнике при температуре 4 °C.
    2. Прополосните протеиновый гель ультрачистой водой, достаньте чистый баллон для электрофореза, зажмите две короткие пластины протеинового геля внутрь и напротив друг другу, залейте Running Buffer и проверьте наличие протечек.
    3. Аккуратно снимите гребень, загрузите 10 мкл в каждую скважину с общим числом 4 групп образцов. Загрузите 3 группы образцов на гель, разделённые по 4 мкл белковых маркеров между каждой группой, всего 15 колодц.
    4. После загрузки образцов залейте весь оставшийся буфер в электрофорезный бак, закройте его крышкой, установите напряжение на 140 В и проведите электрофорез с постоянным напряжением в течение 20 минут.
    5. Когда белковые полосы попадают в разделительный гель после концентрации, настройте напряжение на 120 В для электрофореза постоянного напряжения. Во время этого процесса замочите мембрану NC в Transfer Buffer. Остановите электрофорез, когда бромофеноловый синий цвет указывает на то, что образец достиг нижнего края геля, и готовьтесь к переносу через мембрану.
    6. Наполните пенопластовую коробку наполовину льдом, выньте зажим для переноса, предварительно охлаждённый буфер и пропитанную мембрану NC. Налейте половину буфера для переноса в плоский квадратный контейнер.
    7. Достаньте протеиновый гель, тщательно прополосните его ультрачистой водой, положите чёрную сторону вниз, а прозрачную — вверх. В центре разместите один слой губки, один слой фильтрующей бумаги, белкового геля, мембраны NC, затем разместите ещё один слой фильтрующей бумаги и губки.
    8. После нажатия для удаления пузырьков воздуха зажмите трансферную кассету и поместите её в бак для передачи. Когда оба белковых геля полностью вставлены, вылейте весь Transfer Buffer в бак для переноски, затем добавьте два пакета со льдом для охлаждения и накройте крышкой.
    9. Окружите трансферную кассету ледом и передайте при постоянном напряжении 120 В в течение 90 минут. Процесс переноса генерирует значительное тепло, поэтому для охлаждения требуется ледяная ванна.
    10. Вынимите мембрану NC, погрузите её и окрашивайте в 20 мл раствора для окрашивания Ponceau S, отметьте размер маркера карандашом и разрезайте мембрану карандашом в зависимости от размера белка, который нужно обнаружить.
    11. Уберите раствор для окрашивания Ponceau S. Смойте раствор для окрашивания PBS и инкубуйте мембрану NC с 20 мл блокирующего буфера, затем заблокируйте при комнатной температуре на шейкере на низкой скорости в течение 1-2 часа.
    12. Сбросьте блокирующий раствор, быстро промывайте мембрану дважды PBS на обесцветиваемом шейкере, чтобы тщательно удалить блокирующий раствор, затем добавьте соответствующие антитела в соответствии с коэффициентами использования Western Blot для каждого антитела в инкубационной коробке и инкубируете на ночь при 4 °C.
    13. Отдельно извлекать первичные антитела и хранить при -20 °C. Мембраны были быстро промыты 4 раза с помощью TBST на обесцвечивающем шейкере, по 5 минут каждый раз, чтобы тщательно удалить первичные антитела. Затем добавьте 4 мл блокирующего буфера с вторичными антителами и инкубируете мембраны при комнатной температуре на медленном встряхивателе в течение 1 часа.
    14. Промыйте вторичные антитела четыре раза буфером TBST по 5 минут каждый, затем замените на PBS-буфер, чтобы полностью увлажнить мембрану NC.
    15. Согласно инструкции к реагенту ECL, подготовьте люминесцентный раствор и опустите его на поверхность мембраны, затем инкубируете 1-2 минуты перед проявкой с помощью гелевой визуализации.
    16. Обработайте исходные данные в системе изображения Image J, затем перенесите их в программное обеспечение Photoshop для создания фигурок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сетевая фармакология и молекулярное стыкованное соединение
Выявление потенциальных целей КА: В ходе всестороннего исследования фармакологической активности КА было тщательно отобрано 60 потенциальных мишеней на основе обширного обзора соответствующей литературы. Для дальнейшего расширения объема анализа через базу данных TCMSP были выявлены дополнительные 12 потенциальных целей, связанных с CA. Для повышения точности и тщательности были использованы продвинутые предск...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ферроптоз, недавно выявленный способ гибели клеток, характеризуется чрезмерным внутриклеточным накоплением железа и перекислением липид. Морфологически ферроптоз проявляется в виде сжатия митохондрий, потери или уменьшения структур кристов и увеличения плотности мембран, при этом мембрана клетки и морфология ядра остаются незатронутыми26. Механически ферроптоз обусловлен истощением глутатиона (ГСГ) и снижением активности GPX4, препятствуя метаболизму липидных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет финансовых конфликтов интересов, которые нужно раскрывать

Благодарности

Мы выражаем искреннюю благодарность за превосходные условия, предоставленные больницей и её отделениями, которые позволили нам достичь этих результатов. В то же время мы выражаем искреннюю благодарность многим членам лаборатории за их неустанные усилия и ценный вклад на протяжении многих лет. Труд каждого участника — неотъемлемая часть нашего успеха, и в будущем мы продолжим работать вместе для продвижения прогресса в области медицины. Китайский национальный фонд естественных наук (82104838), Программа искры Фонда продвижения Китая (XH-D001), ключевая программа исследований и разработок провинции Ляонин (2024JH2/102500062) и Ляонинский провинциальный фонд естественных наук (2025-MSLH-490).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  ГлицинBiofroxx1275KG001
  Tris-baseBiofrooxx1115KG001
0,5  M  Tris-HCl буфер (pH  6.8)Biorad1610799
1 M Tris-Hcl (PH 7.5)BeyotimeST775
1.5  M  Tris-HCl буфер (pH  8.8)Biorad1610798
APSBeyotimeST005
Базовый электрофорезный блок питанияBIO-RAD PowerPac Basic
Комплект для количественной оценки белков BCABeyotimeP0012
Рекомбинантное антитело к бета-актинуХуабио81115-1-RR
Инкубатор углекислого газаТермо150L
Пробный набор CCK-8ApexbioK1018
Набор для анализа активности клеток и цитотоксичностиBeyotimeC2015M
Циннамальдегид (CA)МаклинC805134чистота 98%
Шейкер для обесцвечиванияKylin-BellTS-100
DMEM (Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco)BasalMediaL110KJ
DMSOSigmaD2650
Ганглий дорсального корня (DRG)Фухэн БиоFH165Серийный номер: 20211227-1
DRG полный средний материалФухэн БиоFH-DRG
Люминесцентный раствор ECLТермо34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
Плод   Крупный рогатый скот; СывороткаМаклинFO193
Зонд обнаружения ионов железа — FerroOrangeДодзиндоF374
FTH1Технология клеточной сигнализации4393S1:1000
Гелевая система визуализацииBIO-RAD ChemiDoc Touch
Сбалансированный сольный раствор Хэнкса (HBSS)SolarbioH1025
Высокоскоростная рефрижераторная центрифугаЭппендорф5804R
Hoechst 33342 Раствор для окрашивания живых клетокBeyotimeC1028
Набор для иммуногистохимииBiosharpBS-24-PB
Система инвертированного флуоресцентного микроскопаLeicaLeica Dmi 8
Рекомбинантное моноклональное антитело JAK2 [SY0245]ХуабиоET1607-351:2000
Лабораторный инвертированный фазовый контрастный микроскопLeicaLeica Dmi 1
Низкоскоростная центрифугаЭппендорф5804
Набор для обнаружения содержимого MDAСангонD799762
Считыватель микропластинРАССВЕТ  TECAN
Многофункциональный считыватель микропластинBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-κ Поликлональное антитело B p65Proteintech10745-1-AP1:1000
ПараформальдегидМаклинP804536
Раствор для окрашивания ПонсоBeyotimeP0022
Белковый маркерТермо26617
P-STAT3 (Ser727)Технология клеточной сигнализации9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)Технология клеточной сигнализации9145S1:2000
Рекомбинантное антитело к глутатионпероксидазе 4[EPNCIR144]AbcamAB1250661:1000
Рекомбинантные антитела к XCT[EPR27115-64]Abcamab3076011:1000
Набор для анализа ROSДодзиндоR252
Буфер загрузки белков SDS-PAGE (6X)BeyotimeP0289
Обезжиренное молокоBiosharpBS102-500g
Додецилсульфат натрия SDSBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Санта-КрусSC-80191:200
TEMEDSolarbio    T8090   
TFRCИнвитроген13-68000,5 и микро; g/mL
Tween80СеллекS6702
Ультрачистый верстакHDLDL-CJ-2NDI
Вертикальный микроскопОлимпCX 31
Вертикальный электрофорезBIO-RAD Мини Протеан Тетра
Мокрый перекачивающий резервуарBIO-RAD Мини Транс Блот
&альфа;-Тубулин&альфа;-ТубулинER130905
GraphPad PrismСтатистический анализ
Программное обеспечение ImageJПолучите серое значение белкового блота

Ссылки

  1. Dolma, S., Lessnick, S. L., Hahn, W. C., Stockwell, B. R. Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethal chemical screening in engineered human tumor cells. Cancer Cell. 3 (3), 285-296 (2003).
  2. Ye, L. F., et al. Radiation-induced lipid peroxidation triggers ferroptosis and synergizes with ferroptosis inducers. ACS Chem Biol. 15 (2), 469-484 (2020).
  3. Huang, L., Bian, M., Zhang, J., Jiang, L. Iron metabolism and ferroptosis in peripheral nerve injury. Oxid Med Cell Longev. 2022, 5918218(2022).
  4. Hao, D., et al. Supercritical fluid extract of Angelica sinensis promotes the anti-colorectal cancer effect of oxaliplatin. Front Pharmacol. 13, 1007623(2022).
  5. Binder, A., et al. Pain in oxaliplatin-induced neuropathy: sensitisation in the peripheral and central nociceptive system. Eur J Cancer. 43 (18), 2658-2663 (2007).
  6. Finnerup, N. B., et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 14 (2), 162-173 (2015).
  7. Dorri, M., Hashemitabar, S., Hosseinzadeh, H. Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) as an antidote or a protective agent against natural or chemical toxicities: a review. Drug Chem Toxicol. 41 (3), 338-351 (2018).
  8. Hajimonfarednejad, M., et al. Cinnamon: a systematic review of adverse events. Clin Nutr. 38 (2), 594-602 (2019).
  9. Zaio, Y. P., et al. Cinnamaldehyde and related phenylpropanoids, natural repellents, and insecticides against Sitophilus zeamais (Motsch.): a chemical structure-bioactivity relationship. J Sci Food Agric. 98 (15), 5822-5831 (2018).
  10. Thirapanmethee, K., et al. Cinnamaldehyde: a plant-derived antimicrobial for overcoming multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection. Eur J Integr Med. 48, 101376(2021).
  11. Bi, Z., et al. Improvement of mould resistance of wood with cinnamaldehyde chitosan emulsion. Wood Sci Technol. 56 (1), 187-204 (2022).
  12. Qureshi, K. A., et al. Cinnamaldehyde-based self-nanoemulsion (CA-SNEDDS) accelerates wound healing and exerts antimicrobial, antioxidant, and anti-inflammatory effects in rats' skin burn model. Molecules. 27 (16), 5225(2022).
  13. Safaei, F., Tamaddonfard, E., Nafisi, S., Imani, M. Effects of intraperitoneal and intracerebroventricular injection of cinnamaldehyde and yohimbine on blood glucose and serum insulin concentrations in ketamine-xylazine-induced acute hyperglycemia. Vet Res Forum. 12 (2), 149-156 (2021).
  14. Al Tbakhi, B., et al. Cinnamaldehyde-cucurbituril complex: investigation of loading efficiency and its role in enhancing cinnamaldehyde in vitro anti-tumor activity. RSC Adv. 12 (12), 7540-7549 (2022).
  15. Zhu, R., et al. Cinnamaldehyde in diabetes: a review of pharmacology, pharmacokinetics and safety. Pharmacol Res. 122, 78-89 (2017).
  16. Yang, D., et al. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of cinnamaldehyde on protecting high glucose-induced damage in cultured dorsal root ganglion neurons of rats. Chin J Integr Med. 22 (1), 19-27 (2016).
  17. Malemud, C. J. Negative regulators of JAK/STAT signaling in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 18 (3), 484(2017).
  18. Zhang, Q., et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 34, 43-63 (2021).
  19. Bagheri-Mohammadi, S., Askari, S., Alani, B., Moosavi, M., Ghasemi, R. Cinnamaldehyde regulates insulin and caspase-3 signaling pathways in the sporadic Alzheimer's disease model: involvement of hippocampal function via IRS-1, Akt, and GSK-3β phosphorylation. J Mol Neurosci. 72 (11), 2273-2291 (2022).
  20. Fu, Y., et al. Trans-cinnamaldehyde inhibits microglial activation and improves neuronal survival against neuroinflammation in BV2 microglial cells with lipopolysaccharide stimulation. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4730878(2017).
  21. Guo, B., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway with natural plants and phytochemical ingredients: a novel therapeutic method for combatting cardiovascular diseases. Biomed Pharmacother. 172, 116313(2024).
  22. Gao, Y., et al. Modified Erchen decoction ameliorates cognitive dysfunction in vascular dementia rats via inhibiting JAK2/STAT3 and JNK/BAX signaling pathways. Phytomedicine. 114, 154797(2023).
  23. Hu, Q. P., et al. Genistein protects epilepsy-induced brain injury through regulating the JAK2/STAT3 and KEAP1/NRF2 signaling pathways in developing rats. Eur J Pharmacol. 912. 912, 174620(2021).
  24. Kang, L., Tian, Y., Xu, S., Chen, H. Oxaliplatin-induced peripheral neuropathy: clinical features, mechanisms, prevention and treatment. J Neurol. 268 (9), 3269-3282 (2021).
  25. Brayton, C. F. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Vet. 76 (1), 61-90 (1986).
  26. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (3), 234-245 (2008).
  27. Xiao, Z., La Fontaine, S., Bush, A. I., Wedd, A. G. Molecular mechanisms of glutaredoxin enzymes: versatile hubs for thiol-disulfide exchange between protein thiols and glutathione. J Mol Biol. 431 (2), 158-177 (2019).
  28. Georgiadis, M. M., et al. Small-molecule activation of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 reduces DNA damage induced by cisplatin in cultured sensory neurons. DNA Repair (Amst). 41, 32-41 (2016).
  29. Wei, G., et al. Platinum accumulation in oxaliplatin-induced peripheral neuropathy. J Peripher Nerv Syst. 26 (1), 35-42 (2021).
  30. Maung, K., Chu, E., Rothenberg, M. Oxaliplatin combinations as first-line therapy in advanced colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer. 2 (2), 78-80 (2002).
  31. Egashira, N., et al. Mexiletine reverses oxaliplatin-induced neuropathic pain in rats. J Pharmacol Sci. 112 (4), 473-476 (2010).
  32. Lainez, S., Tsantoulas, C., Biel, M., McNaughton, P. A. HCN3 ion channels: roles in sensory neuronal excitability and pain. J Physiol. 597 (17), 4661-4675 (2019).
  33. Siau, C., Bennett, G. J. Dysregulation of cellular calcium homeostasis in chemotherapy-evoked painful peripheral neuropathy. Anesth Analg. 102 (5), 1485-1490 (2006).
  34. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neurosci Lett. 458 (2), 93-95 (2009).
  35. Carozzi, V. A., Canta, A., Chiorazzi, A. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: what do we know about mechanisms. Neurosci Lett. 596, 90-107 (2015).
  36. Di Cesare Mannelli, L., et al. Glial role in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Exp Neurol. 261, 22-33 (2014).
  37. Ta, L. E., Espeset, L., Podratz, J., Windebank, A. J. Neurotoxicity of oxaliplatin and cisplatin for dorsal root ganglion neurons correlates with platinum-DNA binding. Neurotoxicology. 27 (6), 992-1002 (2006).
  38. Bobylev, I., Joshi, A. R., Barham, M., Neiss, W. F., Lehmann, H. C. Depletion of mitofusin-2 causes mitochondrial damage in cisplatin-induced neuropathy. Mol Neurobiol. 55 (2), 1227-1235 (2018).
  39. Nassini, R., et al. Oxaliplatin elicits mechanical and cold allodynia in rodents via TRPA1 receptor stimulation. Pain. 152 (7), 1621-1631 (2011).
  40. Lee, J. H., Kim, W. The role of satellite glial cells, astrocytes, and microglia in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Biomedicines. 8 (9), 324(2020).
  41. Makker, P. G., et al. Characterisation of immune and neuroinflammatory changes associated with chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 12 (1), e0170814(2017).
  42. Holmes, J., et al. Comparative neurotoxicity of oxaliplatin, cisplatin, and ormaplatin in a Wistar rat model. Toxicol Sci. 46 (2), 342-351 (1998).
  43. Podratz, J. L., et al. Cisplatin-induced mitochondrial DNA damage in dorsal root ganglion neurons. Neurobiol Dis. 41 (3), 661-668 (2011).
  44. Trecarichi, A., et al. Preclinical evidence for mitochondrial DNA as a potential blood biomarker for chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 17 (1), e0262544(2022).
  45. Mao, Y. F., et al. Edaravone, a free radical scavenger, is effective on neuropathic pain in rats. Brain Res. 1248, 68-75 (2009).
  46. Kim, H. K., Zhang, Y. P., Gwak, Y. S., Abdi, S. Phenyl N-tert-butylnitrone, a free radical scavenger, reduces mechanical allodynia in chemotherapy-induced neuropathic pain in rats. Anesthesiology. 112 (2), 432-439 (2010).
  47. Han, R., Li, X., Gao, X., Lv, G. C. Cinnamaldehyde: pharmacokinetics, anticancer properties and therapeutic potential. Mol Med Rep. 30 (3), 163(2024).
  48. Liao, J. C., et al. Anti-inflammatory activities of Cinnamomum cassia constituents in vitro and in vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2012, 429320(2012).
  49. Liu, P., et al. Cinnamaldehyde suppresses NLRP3-derived IL-1β via activating succinate/HIF-1 in rheumatoid arthritis rats. Int Immunopharmacol. 84, 106570(2020).
  50. Li, X., Wang, Y. Cinnamaldehyde attenuates the progression of rheumatoid arthritis through down-regulation of PI3K/AKT signaling pathway. Inflammation. 43 (5), 1729-1741 (2020).
  51. Dai, X. Y., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway for chronic pain. Aging Dis. 15 (1), 186-200 (2024).
  52. Reddy, A. M., et al. Cinnamaldehyde and 2-methoxycinnamaldehyde as NF-κB inhibitors from Cinnamomum cassia. Planta Med. 70 (9), 823-827 (2004).
  53. Youn, H. S., et al. Cinnamaldehyde suppresses toll-like receptor 4 activation mediated through the inhibition of receptor oligomerization. Biochem Pharmacol. 75 (2), 494-502 (2008).
  54. Chen, X., Kang, R., Kroemer, G., Tang, D. Ferroptosis in infection, inflammation, and immunity. J Exp Med. 218 (6), e20210518(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Нейропротекция циннамальдегидомнейротоксичность оксалиплатинаганглии задних корешковпуть ферроптозасигнальный путь JAK2 STAT3экспрессия GPX4анализ перекисного окисления липидовактивные формы кислородаанализ экспрессии белков
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.