Метод селективного недосыпания при REM-фазе сна с помощью селективного фликания носа для забывания фазы REM (SNiFFer)

Summary

Мы представляем новый протокол для селективного лишения сна с быстрым движением глаз (REM) у грызунов.

Abstract

Сон в целом делится на стадии быстрого движения глаз (REM) и не-REM, и были разработаны различные методы лишения сна для изучения их функций. Традиционные методы — такие как механическая стимуляция или опускание животного во время REM-сна — часто приводят к быстрой привычке и непреднамеренным стрессовым эффектам, что затрудняет интерпретацию. Здесь мы представляем новый, мягкий и мягкий метод недосыпания при REM-состоянии у грызунов: SNiFFer. Грызуны известны своей высокой чувствительностью к носовым раздражителям. В этом методе мягкая кисть нежно гладит нос животного во время REM-сна, надёжно вызывая возбуждение. Для выборочного применения этой техники во время фазы REM-сна мы использовали систему классификации стадий сна на основе ИИ в реальном времени электроэнцефалографии (ЭЭГ). Вмешательство запускалось только во время REM-эпизодов, и была включена контрольная группа с яром, получившая одинаковый паттерн стимуляции независимо от состояния сна. Мы также применили SNiFFer в парадигме обусловленного следа страха, чтобы проверить, мешает ли дефицит REM-сна в течение 6 часов после обучения консолидации памяти. По сравнению с контрольными группами с яром, животные, лечащиеся SNiFFer, показали значительное сокращение общего количества эпизодов REM-и продолжительности REM, что свидетельствует о специфичности и эффективности метода. В заключение, техника SNiFFer предлагает высокоселективный, минимально инвазивный тактильный подход к недосыпу в фазе REM-сна у мышей. Это позволяет точно контролировать экспериментальные условия и открывает новые возможности для изучения роли REM-сна в памяти и когнитивном мышлении — с нежным поворотом.

Introduction

Сон с быстрыми движениями глаз (REM) играет ключевую роль в когнитивных процессах, таких как консолидация памяти ^1,2. Для изучения функциональной значимости REM-сна в мозге часто используется REM-депривация как экспериментальный подход. В настоящее время широко используются четыре основных метода для индуцирования REM-недосыпания у грызунов: метод вращающегося^{диска 1}, метод с^{цветочным горшком 3}, метод воздушного^{выдыхания 4} и техники физической^{стимуляции 5,6}. Хотя методы вращающегося диска и цветочных горшков очень эффективны для устранения REM-сна, они часто вызывают у животного значительный стресс, например, воздействие воды или физическую^{усталость 7}, что может запутать интерпретацию поведенческих и физиологических результатов. Аналогично, методы воздушного выдыхания и традиционной физической стимуляции, как правило, доставляют в организм широкие, неспецифические стимулы, что приводит к вариативности интенсивности стимулов и ограниченному выбору контрольных групп ^4,8.

Мы провели всестороннее сравнение литературы, охватывающее более шести десятилетий исследований недосыпания в фазе REM, которое приведено в Дополнительном файле 1 и Дополнительной таблице 1. Мы включили фундаментальные исторические, механистические, нейрохимические, гормональные и поведенческие исследования из основных исследовательских направлений, включая Жуве, Рехтшаффена, Бергмана, Туфика, Андерсена и Борбели. Дополнительная таблица 1 структурирует ключевые статьи в хронологическом порядке. В ней прослеживается методологическая эволюция методов депривации REM-сна и изложены их основные биологические, нейрохимические, гормональные, иммунные, терморегуляторные и поведенческие результаты. Поскольку данная рукопись структурирована как статья по методам, а не как всесторонний исторический обзор, она была добавлена в качестве дополнительной информации.

Для устранения этих ограничений мы разработали новый метод, обеспечивающий высокую селективность при недосыпании в фазе REM. Эта техника разработана для выборочного лишения грызунов REM-сна в точно контролируемой форме. В этом подходе мы ограничиваем стимул носом животного — одной из самых чувствительных зон у^{грызунов 9}. Кроме того, мы используем систему классификации стадий сна в реальном времени с помощью ИИ для обнаружения и прерывания эпизодов REM-сна с временной^{специфичностью 10}. Эта система искусственного интеллекта обращается к сигналу ЭЭГ за последние 4 секунды с одного канала и оценивает текущие стадии сна мыши. Такая схема также позволяет реализовывать группы контроля с яром, что позволяет временно согласованное вмешательство. Хотя протокол относится к методике физической стимуляции для депривации REM-сна, наш протокол отличается от традиционных методов. Во-первых, мы применили анализ стадий сна в реальном времени с помощью ИИ для точного и последовательного вмешательства, специфичного для REM. Во-вторых, область стимуляции ограничивается только верхом носа, которая является одной из самых чувствительных у^{мышей 6}, что приводит к минимальным различиям в длительности и силе стимуляций. Наконец, мы недавно создали контрольную группу с привязанным яром, которая получила одинаковое количество стимуляции для контроля смешивающих факторов. Этот протокол предлагает метод исследования функций, специфичных для REM-сна.

Чтобы оценить полезность этого метода, мы применили его для изучения роли REM-сна в консолидации памяти по следам страха. Предыдущие исследования сообщали, что дефицит REM-сна ухудшает консолидацию памяти страха, зависящую от гиппокампа, включая отсроченные воспоминания о^{страхе 11,12}. Однако существуют противоречивые данные о влиянии дефицита REM-сна на процессы памяти, задействовающие распределённые и сложные мозговые^{цепи 5,13}. Консолидация памяти по следам страха требует ассоциации удара стопы (безусловного стимула), слухового сигнала (условного стимула) и интервала между ними — процесса, который активирует несколько областей мозга, включая гиппокамп, медиальную префронтальную кору и^{миндалину 14}. Поэтому мы лишили мышей REM-сна на 6 часов сразу после следового страхового^{обусловленного 15} — временного окна, который считается критическим для консолидации памяти¹⁶. Используя этот протокол, мы оценили влияние нехватки REM-сна на консолидацию следов памяти, зависящих от координированной активности распределённых нейронных систем. В этой статье представлен новый метод, описывающий детальный экспериментальный протокол, проверяющий эффекты.

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Цукуба. В этом исследовании использовались самцы и самки мышей C57BL/6J (11–13 недель, вес 20–35 г). Полный список материалов и инструментов, использованных в этом исследовании, приведён в Таблице материалов.

1. Хирургическая имплантация электродов ЭЭГ¹⁷

1. Анестезия и подготовка животного
   1. Индуцировать анестезию с помощью 4% изофлурана, смешанного с воздухом, за 3 минуты. Адекватная анестезия подтверждалась отсутствием отмены педалей и мышечного тонуса, а также стабильными дыхательными паттернами.
   2. Побрийте спинную часть головы и шеи от затылка до области между глазами с помощью электробритвы. Когда мышь показывает бодрствование, например, движение усов, снова выведите анестезию.
2. Фиксация головы и экспозиция черепа
   1. Закрепите животное в стереотаксичной рамке, обеспечивая выравнивание носа и черепа. С этого момента и до конца всей хирургической процедуры анестезия поддерживалась непрерывно с помощью насоса изофлуранного испарителя.
   2. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы. Удалите оставшиеся волосы с помощью депиляционного крема.
   3. Сделайте разрез по средней линии кожи головы и аккуратно уберите кожу, чтобы открыть череп от задней линии уха до передней линии глаза. Удалите слизистую ткань ватной палочкой.
3. Идентификация и выравнивание памятников
   1. Определите брегму и лямбду; Отрегулировать стереотаксический рычаг так, чтобы эти точки были ровно в пределах ±0,05 мм. Проверьте, что боковые координаты ±3,0 мм от брегмы также ровны (±0,05 мм).
4. Сверление и установка винтов
   1. Отметьте следующие координаты относительно брегмы. Просверлите четыре пилотных отверстия по этим координатам. Передне-задняя / медиально-латеральная: +1,5 мм / ±1,5 мм, –3,0 мм / ±1,7 мм.
   2. Имплантируйте ЭЭГ-записывающие винты в каждое отверстие и закрепляйте их гелевым клеем на основе цианоакрилата. Свяжите и накройте обнажённый череп и свинцы тонким слоем зубного цемента.
5. Послеоперационный уход
   1. Введите 0,5 мл раствора глюкозы 5% и 0,13 мл ибупрофена (или эквивалентного обезболивающего).
   2. Вернуть мыши в её домашнюю клетку — цилиндрическую клетку из плексигласа (диаметром 21,9 см, высотой 31,6 см), помещённую в изолированную камеру (45,7 x 50,8 x 85,4 см). Камера поддерживается при температуре 23,5 ± 2,0 °C, относительной влажности 50,0% ± 10,0%, а также 12-часовом цикле свет/темнота (светлая фаза: с 9:00 до 21:00).
   3. Поместите животное в тёплую клетку для восстановления. Ждите перед клеткой, пока мышь не проснётся. После операции животных содержали в индивидуальных помещениях и не возвращали в групповое содержание на время эксперимента.

2. Обращение и привычка

1. График экспериментов
   1. Начинайте обработку в лёгкой фазе через 24–48 часов после операции. Продолжайте четыре дня подряд.
2. Операционная процедура
   1. В первый день положите мышь на 2 минуты на 2 раза. Положите мышь на открытую ладонь экспериментатора, пальцы вытянуты и ладонь направлена вверх. Расположите ладонь чуть выше предплечья, так как мыши обычно лазают на возвышенные поверхности. Позволить мыши свободно двигаться без ограничений; Если мышь пытается забраться на предплечье, аккуратно возвращайте её в ладонь, слегка держась за основание хвоста. Каждый интервал длится более 20 минут. Это следует проводить в световой фазе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь выпрыгивает из руки или укусит её, используйте ткань или папиросную бумагу только в первый день. Одежду можно использовать повторно, и её следует чистить каждые 2 недели.
   2. На второй и четвёртый день держите мышь на 2 минуты для 3 раза. Каждый интервал и период проведения совпадают с первым днём. Оценивайте привыкание с поведенческой точки зрения: непривыкшие мыши обычно пытаются сбежать, прыгая или сильно кусаясь, тогда как привыклие мыши активно исследуют ладонь с минимальными попытками побега и почти без сильных укусов.
   3. В конце финальной сессии подключите мышь к кабелю записи ЭЭГ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если материал подстилки слишком сложен, чтобы мешать носу мыши, снимите некоторые из них вручную и уберите во время обработки или во время подключения.

3. Базовая запись ЭЭГ

1. Начинайте с 5-го и 6-го дней после операции. Записывайте непрерывную ЭЭГ с 11:00 до 17:00 каждый день. Если материал подстилки мешает доступу к носу мыши, постепенно удаляйте излишки подстилки, чтобы обеспечить чистый носовой доступ и минимизировать беспокойство для животного для дальнейшего обработки.

4. Воспитание^{страха 18,19}

1. Начните послеоперационный день 7 (или 8) между 10:00 и 11:00. В качестве подготовки распылите 70% этанола в камеру кондиционирования (30 x 25 x 24 см), которая состоит из прозрачных акриловых стен и пола из нержавеющей стали (стержни диаметром 2,0 мм, расположенные на расстоянии 6,0 мм друг от друга).
2. Протокол тренировки (всего 1 100 секунд)
   1. Передавать пять слуховых сигналов (восходящий звук 20 с, 5–20 кГц при 1,25 Гц, длительность 0,8 с) на 180, 400, 620, 840 и 1060 с. Каждый звуковой сигнал сочетается с амортизатором стопы (1,0 мА, 2 с), доставленным на 218 с, 438 с, 658 с, 878 с и 1098 с.

5. Недосыпание в фазе REM

1. Группа депривации REM-сна (группа RSD)
   1. Сразу после установления страха (ZT2-ZT8) отслеживайте ЭЭГ в реальном времени, активируя систему классификации стадий сна на базе искусственного интеллекта для обеспечения обнаружения REM-сна в реальном времени. При обнаружении REM-сна мягко щекочите нос животного мягкой кистью, пока оно не пробудится снова, со средней задержкой от начала стимула до возбуждения 0,89 ± 0,063 с (средняя ± SEM).
   2. В ходе эксперимента возбуждение определялось как поведенческая реакция на тактильный стимул, а именно движение усов после стимуляции. Запишите временную метку каждого щекотки для дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Щекотка выполнялась без фиксированного направления (например, взад-назад, вверх или круг), при сохранении постоянной легкой тактильной стимуляции, ограниченной верхней частью носа. Если нос закупорен, направьте стимуляцию в область вибрации (усы), которая обычно открыта. Если мышь стоит спиной к кисточке, поворачивайте клетку по мере необходимости, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к носовой области. При использовании клетки с открытым верхом стимуляция также может применяться сверху для обеспечения равномерного доступа к носу или вибрации.
2. Группа контроля с яром (группа с яром)
   1. Каждую связанную мышь сопоставьте с аналогом, лишённым REM. Применяйте щекотку носом к связанной мыши в синхрон с эпизодами REM-эффекта партнёра, соответствуя как началу, так и продолжительности. Каждая мышь использует одну и ту же кисть на протяжении всего эксперимента с REM-диспривацией. После каждого использования опрыскивайте кисть слабо кислой водой и протирайте её салфеткой. Оставьте интервал не менее 24 часов между использованиями, чтобы чистая кисть полностью высохла.

6. Тесты на воспоминание

1. Тест контекстного воспоминания (Тест A)
   1. Начинайте с 24 часов (±3 часа) после недосыпа. Верните мышь в исходную камеру для кондиционирования (с запахом этанола 70%). Зафиксируйте зависание на 5 минут.
2. Тест на воспоминание по звуку (Тест B)
   1. Проведите сессию через 3 часа после Теста А.
   2. Подготовка контекста: распылить воду в контексте B (треугольная призма (высота 30 см), состоящая из трёх стен с длиной боков 31 см, 24 см и 24 см. Две стены покрыты белой бумагой, а третья — из прозрачного акрила, через который на заднем плане виден синий прямоугольник. Конструкция имеет пластиковый пол и прозрачный акриловый потолок.
   3. Зафиксируйте поведение зависания на 6 минут. Подайте один звуковой сигнал на 180 секунд, аналогичный тренировке на 180 секунд.

7. Анализ данных

1. Оценка стадии сна (рисунок 1C-G)¹⁷
   1. Для каждого бодрствования/NREM/REM рассчитайте общее количество, номер эпизода, среднюю продолжительность эпизода и число перехода сна на основе данных, оценённых экспертами человека. Критерии каждого этапа следующие.
      Пробуждение: низкоамплитудный, высокочастотный (β/γ)
      NREM: Высокоамплитудный, низкочастотный (δ)
      REM: Малоамплитудный, тета-доминантный
2. Качество лишения (рисунок 1B)
   1. Оцените стадию сна, во время которой применяется каждый стимул щекотки, сравнивая его временную метку с данными ЭЭГ, аннотированными экспертом-человеком.
3. Поведение замораживания (рисунок 1H, J-K)
   1. Используйте FreezeFrame4 (Actimetrics) для количественной оценки неподвижности (без учета дыхания) во время тестов на кондиционирование страха и воспоминание.
      1. Запустите программу FreezeFrame 4 и выберите режим Recorder . В меню «Файл» (в левом верхнем углу) укажите папку назначения для сохранения файлов записи. В четырёх белых полях на левой панели введите уникальные идентификаторы, соответствующие каждой мыши, чтобы обеспечить выравнивание с четырьмя окнами отображения файлов справа на экране.
      2. Нажмите на панель протокола внизу интерфейса и определите параметры записи, включая общую длительность записи и время слуховых сигналов и ударов стоп согласно экспериментальной конструкции.
      3. Нажмите «Ссылка » в центре экрана, чтобы получить изображение фоновой ссылки. Поместите мышь в камеру для кондиционирования, затем нажмите «Начать », чтобы начать запись.
4. Анализ индекса дискриминации (рисунок 1L)
   1. Вычислим индекс дискриминации по следующей формуле:
      заморозка за 5 минут в среднем в тесте A — заморозка в первые 3 минуты в тесте B)/максимальная заморозка за 5 минут в тесте A, заморозка в первые 3 минуты в тесте B.
5. Анализ индекса ударной реактивности (рисунок 1I)
   1. Используйте трек вручную, чтобы измерить двумерное движение животных 2 до и после начальной точки шока в сессии кондиционирования страха. Вычислим индекс ударной реакции по следующей формуле:
      Движение во время удара — Движение прешок / Движение во время шока + Движение перед шоком

Results

Хирургическая имплантация электродов ЭЭГ
Мыши должны быть полностью анестезиированы во время операции. Если у них наблюдаются признаки неэффективности анестезии, например, трудности, их следует исключить из протокола. Аналогично, если кровотечение длится более 10 секунд, оно может привести к серьёзному повреждению мозга мыши, и рекомендуется удалить его из экспериментов. После операции большинство мышей обычно просыпаются в течение 1 часа. Их походка и движения глаз д...

Discussion

Этот протокол обеспечивает селективное лишение REM-сна у мышей с контрольными мышами с яром. В отличие от традиционных методов, таких как цветочный горшок и вращающиеся диски, эта система позволяет реализовывать тонко согласованные контрольные группы, при которых животные получают одинаковую стимуляцию в одно и то же циркадное время. Кроме того, этот подход минимизирует вариативность расположения стимуляции — распространённое ограничение традиционных методов мягкого обращения и воздушног...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% глюкозы	Оцукба	35061410
6-контактный разъём	Хиросе	172-0989
Клей	Кониси	16351
Анестезиологический аппарат	Синано Сэйсакушо	SN-487-0T
Обжимные корпуса	Хиросе	688-9095
Головка с обжимом	Хиросе	688-8982
Freezeflame4	Мед-Ассошиэйтс	RRID:SCR_014429	Версия 4.104
GraphPad Prism	GraphPad	RRID:SCR_002798	Версия 10.5.0
Ибупрофен	Токийская химическая промышленность	I0415
Изофлуран	Виатрис	901036504
Loctite454	Henkel	UFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
Мышь (C57BL/6J)	Лаборатория Джексона	РИД: IMSR_JAX:000664	11,0 - 13,0 недели на тренировке страха
Кисть	Намуратайсейдоу	4943668000448	SDflat No.8, длина наконечника: 8,2 мм; Ширина: 18,8 мм
Жидкость Провинице	Сёфу	21400BZZ00451000	250 мл
Порошок Провинице	Сёфу	21400BZZ00451000	250 г
SleepSignRecorder	КИССЕЙ КОМТЕК	RRID:SCR_018200	Версия 1.2.10
Винт из нержавеющей стали	Ямадзаки	Н/Д	φ 1.0 и раз; 2.0
Стандартные стереотаксичные приборы	ALA Scientific	68038
Подсолнечное масло	Сигма-Олдрич	S5007-250ML
Белая вазелка	Taiyo Pharmaceutical	K09-TS