Методическая статья

Термическая предварительная подготовка во время перфузии легких ex-vivo для реабилитации поврежденных трансплантатов легких перед трансплантацией

697 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69084

⸱

31 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлена модель перфузии легких ex-vivo крысы, включающая временное воздействие калиброванного термического стресса, способствуя эндогенным защитным механизмам для терапевтического восстановления поврежденных легочных трансплантатов. Этот подход является масштабируемым и воспроизводимым и поддерживает разработку немедикаментозных методов лечения для повышения успешности трансплантации легких.

Аннотация

Перфузия легких ex-vivo (EVLP) стала прорывом в трансплантации легких, позволив как функциональную оценку донорских легких, так и терапевтические вмешательства для реабилитации краевых трансплантатов. Стратегии восстановления включают фармакологические и нефармакологические подходы. Среди последних мы продемонстрировали, что преходящий, контролируемый тепловой стресс («Thermal Preconditioning», TP) является эффективным средством восстановления поврежденных легких путем индуцирования эндогенной защитной реакции на тепловой шок. Здесь мы представляем пошаговый протокол для модели EVLP крысы, которая включает TP для восстановления легких, подвергшихся теплой ишемии, имитируя донорство после смерти от кровообращения (DCD). В протоколе подробно описывается подготовка легких, канюляция, перфузия и индукция реакции на тепловой шок. ТП состоит из 30-минутного повышения температуры перфузата до 41,5 °С в начале ЭВЛП с последующим быстрым возвращением к 37 °С в течение оставшейся части перфузии. В модели EVLP с 6-часовой нагрузкой легкие, обработанные TP (n = 30), показали повышенную экспрессию белка теплового шока 70, улучшенную статическую податливость легких, уменьшение отека, более низкое высвобождение фактора фон Виллебранда (биомаркер эндотелиального повреждения) и ослабление гистологических повреждений по сравнению с контрольной группой (n = 30). Протокол позволяет в режиме реального времени контролировать сосудистое сопротивление, давление в дыхательных путях, податливость легких и оксигенацию, а также поддерживает молекулярный и морфологический анализы как перфузата, так и тканей. Этот воспроизводимый, масштабируемый протокол может быть адаптирован к более крупным системам EVLP животных или человека, обеспечивая практическую трансляционную платформу для изучения нефармакологических вмешательств, направленных на улучшение результатов трансплантации.

Введение

Перфузия легких ex-vivo (ЭВЛП) представляет собой значительный шаг вперед в области трансплантации легких. Его основной эффект заключается в расширении пула доступных донорских легочных трансплантатов за счет возможности функциональной оценки маргинальных легких, чтобы можно было использовать органы, которые в противном случае были бы отброшены для трансплантации 1,2. Маргинальные (или расширенные) донорские легкие относятся к одному или нескольким из следующих критериев: возраст донора более 55 лет, PaO2 / FiO2 менее 300 лет, время ишемии более 6 часов, положительная микробиология мокроты, аномальная рентгенография3. В дополнение к физиологической оценке, ЭВЛП может служить платформой для применения различных терапевтических вмешательств, направленных на улучшение качества трансплантата до трансплантации (концепция терапевтического восстановления)4. Таким образом, ЭВЛП предоставляет уникальную возможность реабилитировать поврежденные (маргинальные) легкие и снизить риск первичной дисфункции трансплантата (ПГД), серьезного осложнения, ухудшающего как ранние, так и отдаленные исходы после трансплантации легких 5,6. ПГД является клиническим выражением процесса ишемии-реперфузионного повреждения (ИРИ), патофизиология которого основана на окислительном стрессе, воспалении, активации каскадов комплемента и коагуляции, а также индукции процессов клеточной гибели 7,8,9. В конечном счете, эти механизмы способствуют нарушению нормальных функций эндотелия и эпителия легких, что приводит к некардиогенным отекам легких со сниженной способностью к оксигенации, двум ключевым признакам ПГД 6,10,11,12.

Растущее число экспериментальных исследований, как доклинических, так и клинических, продемонстрировало эффективность различных терапевтических стратегий ex-vivo для облегчения IRI во время трансплантации легких. Примеры включают фармакологические агенты, нацеленные на окислители и свободные радикалы, пути гибели клеток, медиаторы воспаления, а также клеточную и генную терапию, и это лишь некоторые из них 13,14,15,16,17,18,19,20. Помимо таких терапевтических подходов, EVLP также может служить платформой для приложения физиологического стресса непосредственно к легочному трансплантату, чтобы вызвать внутренние защитные механизмы, обеспечивающие адаптивную толерантность к последующим патофизиологическим повреждениям. Одна из таких стратегий включает в себя применение преходящего, нелетального теплового стресса к легочному трансплантату во время ЭВЛП. Действительно, в течение долгого времени было известно, что условия теплового стресса способствуют адаптивной реакции теплового шока, возникающей в результате экспрессии ряда белков теплового шока (HSP), действующих как молекулярные шапероны и придающих устойчивость к дальнейшему воздействию различных стрессовых стимулов. Помимо индукции ГСП, после теплового воздействия были идентифицированы некоторые дополнительные клеточные адаптации, в том числе: (а) антиоксидантный и цитопротекторный путь, связанный с фактором 2 NF-E2 (NRF2), активация которого при тепловом стрессе заметно повышает цитопротекторный ген гемоксигеназы22,23; (b) развернутый белковый ответ (UPR), связанный с протеотоксическим стрессом в эндоплазматическом ретикулуме (стресс ER) и активация которого при нагревании может быть либо защитной, либо вредной, в зависимости от интенсивности термического стресса 24,25,26; (c) аутофагия – цитопротекторный процесс, способствующий лизосомальной деградации поврежденных органелл и макромолекул, которые могут активироваться или ингибироваться под действием тепла в зависимости от температуры и времени27,28.

Мы продемонстрировали, что такое «термическое предварительное кондиционирование» обеспечивает значительные преимущества с точки зрения снижения окислительного стресса, воспаления, гибели клеток и эндотелиальной дисфункции, что приводит к значительной защите от ИРИ легких. Таким образом, мы предположили, что термическое предварительное кондиционирование может представлять собой новый, нефармакологический метод терапевтической реабилитации ex-vivo поврежденных легочных трансплантатов до трансплантации 29,30,31. Термическое предварительное кондиционирование может иметь ряд преимуществ по сравнению с существующими фармакологическими и нефармакологическими стратегиями. Вызывая интегрированный клеточный эндогенный ответ, он может одновременно обеспечивать защиту от различных патофизиологических путей, относящихся к IRI, в то время как другие стратегии обычно нацелены на один путь. Кроме того, это позволяет избежать риска возникновения потенциальных побочных эффектов, связанных с применением фармакологических соединений. Целью данной статьи является представление подробного пошагового протокола термической предварительной подготовки во время перфузии легких ex-vivo поврежденных легких крыс, который может быть применен в различных условиях, в частности, на более крупных животных моделях или человеческих легких в исследовательских целях.

Для ЭВЛП мы используем изолированную перфузированную легочную систему IPL-2 с изоляцией крыс. Схема описана на рисунке 1 и включает в себя следующее: резервуар для перфузата (рисунок 1-1); два роликовых насоса для циркуляции перфузата (рис. 1-2А) и отбора проб перфузата (рис. 1-2В); термостатическая водяная баня (рисунок 1-3) для поддержания температуры перфузата; мембранный газообменник (рис. 1-4), соединенный с бензобаком (не показан), содержащий смесь 6%О2, 10% СО2 и 84%Н2 для дезоксигенации и карбоксилирования поступающего перфузата; два датчика давления (рис. 1-5) для контроля давления в левом предсердии (ЛП) и легочной артерии (ЛТ) (датчик давления ЛД на рисунке не виден); подогреваемая и герметичная камера (рис. 1-6), в которой находится блок искусственного кровообращения, со специальными соединениями для канюль PA, LA и трахеи; аппарат искусственной вентиляции легких (рис. 1-7), подключенный к трахеальной канюле для вентиляции легких и измерения давления в дыхательных путях и статической податливости легких; электронный термометр (рис. 1-8) для отображения температуры перфузата на уровне притока ПА. Соединительная платформа (Рисунок 1-9), элементы которой подробно показаны на Рисунке 2: Соединение для канюль PA (Рисунок 2-1), LA (Рисунок 2-2) и трахеи (Рисунок 2-3); подключение к весовому модулю (рис. 2-4) для непрерывного контроля веса блокады искусственного кровообращения; Датчик температуры (Рисунок 2-5) для контроля температуры перфузата на входе ПА. Подробное схематическое описание схемы можно найти в другом месте18.

Протокол

Примечание: Для исследования были использованы взрослые самцы крыс породы Спрэг-Доули (n = 60; возраст 8-11 недель; вес 300-450 г). Животные были размещены (2 крысы в клетке) в нашем местном животноводческом комплексе, где они содержались в течение 12 часов свет/12 часов в темное время суток с неограниченным доступом к еде и воде. Все животные обрабатывались в соответствии с «Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию» (публикация NIH No 96-23), а все эксперименты проводились в соответствии с протоколом экспериментов, утвержденным нашим местным комитетом по уходу за животными (Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud (разрешения 3456a и 3456x1). Размер и вес животных были выбраны на основе наших предыдущих исследований на модели EVLP крыс и с учетом анатомического удобства (размер легких и сосудов). Штамм Спрэга-Доули был выбран с учетом того, что другие штаммы (в частности, крысы линии Wistar) могут проявлять реакции гиперчувствительности к раствору декстрана, присутствующему в растворе перфузата 1,32.

1. Общее описание схемы ЭВЛП

ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка описана на рисунке 1, а элементы соединительной платформы (рисунок 1-9) подробно показаны на рисунке 2. Подробное схематическое описание схемы было описано ранее18.

  1. Используйте бесклеточный бесклеточный буферный раствор для перфузии ex-vivo . Следите за тем, чтобы перфузат вытекал из резервуара через газообменник и направлялся через канюлю PA для перфузии легких, а затем выходил через канюлю LA обратно в резервуар. Непрерывный контроль давления притока (PA) и нагнетания (LA).
  2. Подключите все датчики (давление PA, давление LA, вес легких, скорость насоса) к коробке аналогово-цифрового преобразователя (рис. 3). Откройте программу Basic Data Acquisition Software (BDAS). Калибровка сигналов давления с помощью двухточечной калибровки (0; 10 см H2O) с помощью водяного столба. Откалибруйте весовой модуль с помощью двухточечной калибровки (0 г и 1 г). Откалибруйте скорость насоса с помощью 1-минутного отбора проб перфузата со скоростью 10 мл/мин. Контролируйте качество сигналов путем применения известных давлений и скорости насоса и оценки адекватности результатов (подробный протокол и видео для калибровки сигналов можно найти в дополнительных материалах).
  3. Записывайте все ключевые параметры (давление PA, LA, вес и поток легких) в режиме реального времени с помощью системного программного обеспечения и наблюдайте за их визуальным отображением на персональном компьютере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Физиологические сигналы, записанные BDAS, экспортируются в текстовый файл с помощью команды «Экспорт файла » в строке меню. Данные, извлеченные в выбранные моменты времени (каждые 60 минут), переносятся в электронную таблицу, а затем копируются/вставляются в программное обеспечение для статистического анализа.
  4. Рассчитайте легочно-сосудистое сопротивление (PVR) с помощью уравнения (1):
    figure-protocol-1(1)
  5. Получить образцы (1-2 мл) перфузата в специально отведенные для этого моменты времени проведения измерений различных биологических маркеров.

2. Применение термического предварительного кондиционирования

  1. Подключите термостатическую водяную баню (рис. 4-1), чтобы обеспечить постоянную, точную и регулируемую температуру воды для нагрева перфузата. Используйте встроенный мотонасос внутри водяной бани для циркуляции нагретой воды.
  2. Используйте стеклянный контейнер с двойными стенками в качестве резервуара (рис. 4-2) для поддержания температуры перфузата путем циркуляции нагретой воды между стенками контейнера.
  3. Используйте нагревательный змеевик со змеевидной трубкой внутри емкости с нагретой водой (Рисунок 4-3) для подачи перфузата, обеспечивая теплообмен от воды к перфузату непосредственно перед тем, как он попадет в препарат легких ex-vivo.
  4. Блок искусственного кровообращения находится в камере органа (рис. 4-4), контейнере с двойными стенками, заполненном водой, циркулирующей из термостатической водяной бани для поддержания теплой среды.
  5. Для датчика температуры и термометра (Рисунок 2-5 и Рисунок 4-5) надежно и надежно приложите датчик воздуха/поверхности шариков типа K к входящей канюле для непрерывного контроля фактической температуры перфузата, поступающего в легочную артерию (ПА). Температура отображается на цифровом термометре.
  6. Чтобы поддерживать температуру притока на уровне 37 °С, установите водяную баню на уровне 38-38,5 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы компенсировать потери тепла от перфузата по его течению в трубке, мы определили в наших условиях, что температура водяной бани должна быть установлена на уровне 38-38,5 °С для поддержания 37 °С на входе. В зависимости от потерь тепла от перфузата эти настройки, возможно, придется адаптировать, чтобы гарантировать желаемую температуру на входе.
  7. Запустите протокол нагрева ex-vivo через 60 минут ЭВЛП, увеличив температуру водяной бани до 43 °C для достижения температуры притока 41,5 °C, которая достигается в течение 5 минут и поддерживается в течение 30 минут.
    Примечание: В нашей предыдущей работе29 мы определили оптимальную температуру для термического предварительного кондиционирования (TP), используя диапазон температур от 40 °C до 43,5 °C и протокол EVLP в течение 3 часов, как показано на рисунке 5. Температура нагрева, обеспечивающая оптимальную защиту без каких-либо вредных воздействий (как показано на рисунке 5В), составила 41,5 °С. Поэтому эта температура использовалась во всех наших последующих экспериментах с длительностью ЭВЛП до 6 ч29,30,31.
  8. После этого кратковременного нагрева добавьте лед в водяную баню, чтобы быстро (через 5 минут) снизить температуру водяной бани до 38 °C, чтобы вернуть температуру перфузата во входной канюле до 37 °C и поддерживать эту температуру до конца протокола EVLP.
  9. Определите физиологические переменные (податливость легких), образование отека и молекулярные конечные точки (экспрессия белков теплового шока, антиоксидантных ферментов, воспалительных цитокинов и биомаркеров апоптоза, аутофагии, стресса эндоплазматического ретикулума и повреждения эндотелиальных клеток).

3. Подробный протокол EVLP для предварительного теплового кондиционирования

  1. Подготовка животных
    1. Подготовьте необходимые материалы, включая канюли и хирургические инструменты (Рисунок 6A, B и Таблица материалов).
    2. Взвесьте животное, чтобы рассчитать подходящие дозировки для всех вводимых веществ, расход перфузата и параметры вентиляции.
    3. Приготовьте обезболивающую смесь: 80 мг/кг кетамина и 8 мг/кг ксилазина в одном шприце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивающие средства должны храниться в защищенном шкафу.
    4. Приготовьте гепарин, 1,7 ЕД/г массы тела в изотоническом физрастворе (1 мл шприца).
    5. Обезболивают животное с помощью 5% изофлурана (испаряют в специальной индукционной камере) с последующим внутрибрюшинным введением приготовленной смеси анестетика. Поддерживайте анестезию с помощью 1-2% изофлурана с помощью маски для лица.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать глубокую анестезию, чтобы избежать удушья во время обескровливания.
      Используйте установку с системой экстракции изофлурана для защиты оператора.
      Выбросьте все иглы и шприцы в соответствующие контейнеры для биологически опасных и острых отходов. Затем герметичные острые и биологически опасные контейнеры утилизируются в специально отведенных для этого потоках отходов.
    6. Выбрейте животное от горла до области полового члена и удалите остатки шерсти с помощью влажной теплой бумаги.
    7. Проверить глубину анестезии, зажав заднюю лапу; повысить концентрацию изофлурана при наличии рефлексов.
    8. Поместите животное в лежачее положение и закрепите все четыре конечности с помощью скотча.
  2. Экстракция блокады сердца и легких при ЭВЛП
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура требует интенсивной подготовки для своевременного, атравматичного и воспроизводимого выполнения различных этапов. Наиболее деликатным этапом является канюляция легочной артерии, которая должна быть выполнена под увеличением с помощью зеркального операционного микроскопа для достижения наилучших результатов. Вся процедура может быть выполнена одним хорошо обученным следователем. Для достижения такой экспериментальной независимости требуется как минимум 15 полных процедур под руководством опытного исследователя.
    1. Аккуратно приподнимите кожу по средней линии горла и сделайте продольный разрез на 5 см вдоль каудальной до головной оси с помощью маленьких ножниц.
    2. Отделите доли слюнных желез и аккуратно рассеките фасцию над грудиноягодными мышцами с помощью изогнутых щипцов до тех пор, пока гортань и трахея не будут четко обнажены.
    3. Проведите шелковый шов 4-0 под трахеей и подготовьте заранее завязанный узел, оставив щипцы на месте под трахеей.
    4. Рассчитайте дыхательный объем (Vt) для вентиляции in vivo и забора легких с помощью формулы Шталь33:
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. Установите аппарат ИВЛ, предназначенный для вентиляции in-vivo и закачки легких (см. Таблицу материалов), на расчетный дыхательный объем с частотой дыхания 70 вдохов/мин, долей кислорода на вдыхаемом воздухе (FiO2) 0,5 и положительным давлением на конец выдоха (PEEP) 3 см H2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы установить PEEP на 3 см H2O, подсоедините рукав выдоха аппарата ИВЛ к силиконовой трубке, отвержденной платиной, вставленной на 3 см под поверхность наполненного водой контейнера.
    6. Сделайте поперечный разрез между двумя хрящевыми кольцами, вставьте канюлю наружного диаметра 2 мм (длина 14 мм, вентиляционная канюля EVLP, рисунок 6B) для вентиляции и закрепите ее, затянув шов.
    7. Подключите канюлю к аппарату ИВЛ и подтвердите эффективность вентиляции наличием пузырьков в наполненном водой контейнере, подключенном к рукаву выдоха аппарата ИВЛ.
    8. С помощью ножниц с тупым концом разрежьте кожу вдоль живота и войдите в брюшную полость, продолжайте надрезом мышц средней линии брюшной стенки вплоть до диафрагмы.
    9. Аккуратно отодвиньте кишечник в сторону с помощью ватных палочек, чтобы обнажить нижнюю полую вену.
    10. Введите приготовленный раствор гепарина в вену и дайте ему циркулировать в течение 5 минут. Затем пересекте полую вену и аорту для обескровливания.
    11. После того, как животное будет полностью обескровлено и подтверждена его смерть, остановите вентиляцию легких и отключите аппарат искусственной вентиляции легких от трахейной канюли, чтобы позволить легким сдуться, что указывает на начало теплой ишемии. Общее время теплой ишемии (WIT) не должно превышать 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что зарегистрированный медиана ВИТ при клиническом донорстве легких с ДКД составляет 33 минуты, не сообщалось о каких-либо вредных эффектах длительности ВИТ до 60 минут на выживаемость в течение 1 года. Поэтому большинство центров в настоящее время согласны с тем, что 60-90 мин является приемлемым верхним пределом WIT34. Как подробно описано ранее, использование 1 ч WIT в нашей модели на крысах является релевантным для клинического сценария35.
    12. За 15 минут до окончания общего времени теплой ишемии в 1 ч (т.е. после 45 мин теплой ишемии) наполните шприц объемом 60 мл (закрепленный на держателе) холодным (4 °С, храните в холодильнике) раствором консервации (см. состав в табл. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дно шприца установлено на высоте 20 см над животным. Подсоедините шприц к канюле PA с помощью силиконовой трубки, погруженной в ледяную воду (рисунок 6C).
    13. Выполните срединную стернотомию с помощью ножниц Листера с тупым концом, чтобы не повредить ткань, и осторожно втяните грудную стенку с помощью тупых ретракторов, прикрепленных к эластичным лентам, и микромоскитного гемостата, прикрепленного к диафрагме, чтобы обнажить легкие. Избегайте любого прямого контакта с паренхимой легких.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, чтобы предотвратить высыхание тканей, при необходимости нанесите небольшое количество физиологического раствора на поверхность легкого.
    14. Сделайте Х-образный разрез на верхушке левого желудочка сердца и сдвиньте ножницы внутрь сердца вверх к левому предсердию, чтобы облегчить последующее введение канюли ЛП.
    15. Проденьте шелковый шов 5-0 под основной PA и приготовьте предварительно завязанный двойной узел и держите шов с одной стороны самодельным держателем (Рисунок 6D и Рисунок 7A).
    16. Подготовьте дополнительный шов вокруг сердца для последующей фиксации канюли LA (Рисунок 7B).
    17. Сделайте небольшой разрез в основном ПА и вставьте канюлю ПА, следя за тем, чтобы не было попадания пузырьков воздуха.
    18. Немедленно перфузируйте легкие 25 мл холодоконсервирующего раствора через канюлю PA, инициируя время ишемии холода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой перфузии используйте пассивное давление с высоты шприца на держателе, описанном выше.
    19. Закрепите канюлю на месте с помощью наложенного шва.
    20. Сразу после канюляции ПА снова подключите канюлю трахеи к аппарату искусственной вентиляции легких и возобновите вентиляцию с первоначальными настройками, снизив частоту дыхания до 25 вдохов/мин.
    21. Введите канюлю LA через разрез в левом желудочке в левое предсердие.
    22. Закрепите канюлю вторым предварительно наложенным швом (вокруг сердца), стараясь не допустить затруднения потока из левого предсердия и пропустить весь объем 25 мл раствора для сохранения холода (требуется ~15 минут).
    23. По окончании перфузии консервационного раствора зажмите канюлю PA бульдожьим зажимом (рисунок 7C, синий круг) и отсоедините ее от трубки.
    24. Тщательно рассеките трахею и окружающие ткани, чтобы мобилизовать легкие.
    25. Зажмите трахею с помощью зажима для аневризмы (рисунок 7C, красный круг), пока легкие полностью надуты (один дыхательный объем).
    26. Рассеките нисходящую аорту и другие поддерживающие сосуды, чтобы освободить блокаду сердца и легких, поднимая ее, осторожно захватывая трахею.
    27. Поместите блокаду сердца и легких в чашку с консервирующим раствором в положение лежа на животе и храните при температуре 4 °C в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце операции поместите биологические остатки в мешки для утилизации отходов для дальнейшего удаления специальной службой.
  3. Ex-vivo перфузия легких и термическое предварительное кондиционирование
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к блок-схеме, в которой изложены основные шаги для продвижения по различным этапам протокола (Рисунок 8).
    1. Поместите ведро со льдом на термостатическую водяную баню, чтобы снизить температуру перфузата до 15 °C.
    2. Наполните резервуар 100 мл перфузата и дайте ему циркулировать по системе. Используйте перфузионный раствор на основе альбумина человека (см. состав в таблице 1) в качестве бесклеточного буферизованного внеклеточного раствора для перфузии ex-vivo .
    3. Измерьте рН перфузата и поддерживайте его на физиологическом уровне (7,35-7,45), добавьте соответственно трис(гидроксиметил)аминометан (ТАМ).
    4. Взвесьте блок искусственного кровообращения и установите его на систему EVLP, начиная с вентиляционной канюли, сохраняя при этом зажим для аневризмы на трахее.
    5. Подключите канюлю PA, осторожно избегая попадания пузырьков воздуха в сосудистую сеть легких (убедитесь, что ловушка пузырьков заполнена).
    6. Дайте нескольким каплям перфузионного раствора выйти и подсоедините канюлю LA.
    7. Установите левое предсердное давление на уровне 3 мм рт.ст., отрегулировав высоту отводящей линии, подключенной к дренажному контуру.
    8. Обнулите весовой модуль и отслеживайте изменение веса блокады сердца и легких на протяжении всей ЭВЛП.
    9. Рассчитайте теоретический сердечный выброс (СО) по формуле, разработанной Линдштедтом и Шеффером:
      figure-protocol-4
    10. Начните перфузию (2% от теоретического СО) и постепенно увеличивайте расход перфузата (7,5% от теоретического СО) и температуру в соответствии с заданными параметрами, как указано в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время ЭВЛП расход перфузата устанавливается в диапазоне от 2% до 7,5% от расчетного теоретического CO. Этот низкий поток перфузата позволяет поддерживать давление в легочной артерии в пределах нормы и снизить риск раннего отека легких, особенно в теплых легких, поврежденных ишемией. Это позволяет пользователям поддерживать подготовку в течение длительных периодов времени. Другие исследователи использовали сопоставимые потоки для EVLP крыс, в то время как некоторые другие использовали потоки до 20% от теоретического CO38.
    11. Регулируйте температуру перфузата, постепенно увеличивая температуру водяной бани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы руки не касались всего отопительного оборудования, чтобы избежать возможных травм.
    12. Как только температура перфузата достигнет 35 °C, запустите искусственную вентиляцию легких, удалив зажим для аневризмы из трахеи и запустив аппарат ИВЛ, предназначенный для вентиляции ex-vivo (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка давления выполняется каждые 14 дней с использованием двухточечной калибровки (0 и 30 см H2O). Калибровка трубки выполняется при каждом использовании в соответствии с запрограммированным протоколом с поправкой на внешние факторы, связанные с сопротивлением трубок и канюли.
      1. Используйте указанное программное обеспечение для настройки аппарата ИВЛ и сбора данных, так как оно обеспечивает непрерывную запись дыхательных сигналов и податливости легких в определенные моменты времени (см. блок-схему, рис. 8) в соответствии с запрограммированным протоколом ступенчатого увеличения объема легких с одновременным измерением давления в дыхательных путях.
      2. Затем податливость автоматически рассчитывается с помощью уравнения, подогнанного к дефляционной ветке объемной петли давления (уравнение Салазара — Ноулза).
      3. Отображайте все данные о вентиляции, храните их на специальном персональном компьютере и экспортируйте в электронную таблицу. Извлекайте данные в выбранные моменты времени, переносите их в другую таблицу, а затем копируйте/вставляйте их в программное обеспечение для статистического анализа.
    13. Установите частоту дыхания и дыхательный объем на уровне 7 ударов/мин и 3 мл/кг соответственно в течение 10 мин, а затем увеличьте до 15 ударов/мин и 6 мл/кг в течение 10 мин и, наконец, 30 ударов/мин и 6 мл/кг до конца ЭВЛП. Установите положительное давление в конце выдоха (PEEP) на уровне 3 см H2O на протяжении всего EVLP (Таблица 2).
    14. Применяйте маневр рекрутирования каждые 30 минут ЭВЛП для предотвращения ателектаза, установив давление в дыхательных путях на уровне 15 см H2O в течение 6 с.
    15. Через 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4,5 ч и 6 ч ЭВЛП применяйте ступенчатое надувание легких до общего объема легких 10 мл/кг массы тела, чтобы определить податливость легких и пиковое давление на вдохе (Pmax).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения соответствия выполняются после описанного выше маневра по набору персонала.
    16. Увеличьте температуру перфузата до 37 °C на входе канюли PA через 60 минут EVLP.
    17. Запустите протокол нагрева ex-vivo через 60 минут после EVLP.
    18. Увеличьте температуру водяной бани до 43 °C, чтобы достичь 41,5 °C на входе канюли PA (это занимает ~ 5 минут), как показано на рисунках 2, 3 и 4-5.
    19. Поддерживайте эту температуру от 60 минут до 90 минут EVLP (всего 30 минут).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей предыдущей работе мы показали, что 41,5 °C в течение 30 минут не способствуют термическому повреждению на уровневсего легкого. Мы не проводили специфические анализы жизнеспособности клеток in vitro для проверки термической травмы в таких условиях.
    20. После 30 минут нагрева добавьте лед на водяную баню, чтобы быстро (5 минут) установить температуру на входной канюле обратно на 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В контрольной группе температура перфузата поддерживается на уровне 37 °C на протяжении всего ЭВЛП без применения термического предварительного кондиционирования (см. Таблицу 2). Мы не включаем группу «фиктивного нагрева» (например, путем регулировки температуры водяной баней без повышения температуры).
    21. Поддерживайте температуру перфузата на уровне 37 °C на входной канюле PA до конца ЭВЛП.
    22. Соберите образцы раствора перфузата через 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4,5 ч (1-2 мл в каждый момент времени) и 6 ч (10 мл) ЭВЛП из одного из отверстий для отбора проб, подключенных к контуру (до или после препарата легких), как показано на рисунке 1-2В. Немедленно используйте образцы для анализа газов (измерение pH, PCO2 и PO2 с помощью картриджа CG4+). Для дальнейших биохимических измерений образцы центрифугируют (500 × г, 10 мин при 4 °C) и выдерживают прозрачную надосадочную жидкость при температуре -80 °C до использования.
    23. Через 6 часов ЭВЛП снова наложите зажим для аневризмы на трахею (как только легкое полностью накачается) и зажмите канюлю ПА бульдожьим зажимом.
    24. Взвесьте блок искусственного кровообращения, чтобы получить его окончательный вес.
      ПРИМЕЧАНИЕ: увеличение веса во время ЭВЛП может быть оценено как разница между конечным и начальным весом или может постоянно контролироваться во время ЭВЛП с помощью описанного выше весового модуля.
    25. Тщательно рассеките легкие, отделяя отдельные доли.
    26. Сохраняйте ткань для последующего применения: мгновенно замораживайте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C для биохимического анализа или фиксируйте в параформальдегиде (PFA) для гистологической оценки. Левое легкое можно сохранить и подготовить к трансплантации легких.

4. Статистика

  1. Распределите животных по конкретным группам лечения (контрольная группа в сравнении с предварительным тепловым кондиционированием, n = 5/группа для каждой экспериментальной конечной точки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не распределяем животных случайным образом по одной или другим группам, но группы чередуются каждый день. Протокол (тепло vs контроль) не может быть выполнен вслепую из-за необходимости строго знать температуру перфузата во время экспериментов. В отличие от этого, биологический и гистологические анализы проводятся вслепую, без определения распределенной группы лечения.
  2. Проанализируйте данные.
  3. Экспресс-результаты как средство ± SEM.
  4. Проверьте нормальное распределение данных с помощью теста Колмогорова-Смирнова.
  5. Для экспериментов с временными точками оцените эффекты распределения времени и групп с помощью двусторонней ANOVA, за которой следует апостериорный тест Сидака для групповых эффектов и коррекция Бонферрони для временных эффектов, используя 1 час в качестве эталона. Рассмотрим значение p < 0,05 как статистически значимое. Перед применением ANOVA рассмотрите логарифмическое преобразование данных в случае ненормального распределения.
  6. Для гистологических анализов определите (слепым способом) оценку повреждения легких для каждого образца путем количественной оценки периваскулярного отека в 10 полях/срезах.
    1. Используйте относительное количество сосудов с периваскулярным отеком (А): 0: отсутствуют; 1: легкая (<25%); 2: умеренный (25-50%); 3: тяжелая (>50%).
    2. Используйте толщину периваскулярного отека (В), рассчитанную в процентах от диаметров внутренних сосудов (0: отека нет; 1:<25%; 2:25-50%; 3:>50%).
    3. Используйте сумму A + B в 10 рассмотренных разделах, чтобы рассчитать31 балл.
    4. Провести статистические сравнения с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (из-за ненормального распределения данных) со значением, присвоенным p < 0,05.

Результаты

Физиологические показатели легких постоянно контролируются на протяжении всей процедуры, включая давление в легочной артерии (ПАП), расчетное легочное сосудистое сопротивление и вентиляционные параметры, включая статическую податливость легких (SPC) и пиковое давление в дыхательных путях (Pmax). Кроме того, весовой модуль позволяет оценить образование отека, косвенно измеряя накопление жидкости в легких. Преимущества термического предварительного кондиционирования (ТП) по отношению к контрольным легким (Ctrl) включают улучшение СПК (Рисунок 9A, выраженный как отношение SPC в каждый момент времени к исходному значению SPC, n = 5/группа) и снижение прироста массы легких (Рисунок 9B, n = 5/группа) во время ЭВЛП. Данные представлены в виде средств ± SEM.

Перфузатная жидкость может быть проанализирована на различные биомаркеры. Например, термическое предварительное кондиционирование связано со значительно сниженным высвобождением фон Виллебранда (vWF), биомаркера эндотелиальных клеток в конце EVLP (рисунок 9C, n = 5/группа, означает ± SEM).

Морфологический анализ легочной ткани, полученный в конце ЭВЛП, включает гистологию и иммуногистохимию. Примеры окрашенных гематоксилином и эозином (H & E) срезов показаны на рисунке 9D, демонстрируя снижение гистологических повреждений в легких, подвергшихся термическому предварительному кондиционированию, выраженное в виде оценки повреждения легких (рисунок 9E, n = 5/группа). Оценка была определена путем количественной оценки периваскулярного отека в 10 полях/срезе (см. этапы протокола 4.6.1 и 4.6.2). Сумма A + B в 10 рассмотренных разделах использовалась для расчета31 балла.

Молекулярные анализы в легочной ткани в конце ЭВЛП включают профилирование экспрессии РНК или белка. Например, уровни экспрессии белка индуцируемого теплового шока HSP70 могут быть измерены с помощью иммуноферментного анализа, чтобы показать развитие реакции на тепловой шок в легких, подвергшихся термическому предварительному кондиционированию (рисунок 9F, показывающий временной эксперимент с различной продолжительностью EVLP, n = 5/группа в каждой временной точке). Экспрессия HSP70 в группе ТП достигала пика через 3 ч ЭВЛП, то есть через 90 мин после окончания ТП, и оставалась стабильной до конца ЭВЛП. Данные представлены в виде средств ± SEM.

figure-results-1
Рисунок 1: Описание платформы EVLP. (1) Резервуар с двойными стенками для перфузата. (2A) Роликовый насос для циркуляции перфузата. (2B) Роликовый насос для отбора проб перфузата (биохимические измерения и анализы газов). (3) Термостатическая водяная баня. (4) Мембранный газообменник, подключенный к газовому баллону (не показан). (5) Датчик давления в левом предсердии. (6) Отапливаемая и герметичная камера. (7) Аппарат искусственной вентиляции легких EVLP. (8) Температурный щуп и термометр. (9) Соединительная платформа для блокады сердца и легких, элементы которой подробно описаны на рисунке 2. (Примечание: датчик давления PA не виден). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Соединительная платформа для блокады сердца и легких. (1) Входная канюля в легочную артерию. (2) Отток канюли из левого предсердия. (3) Соединение для канюли трахеи. (4) Весовой модуль. (5) Датчик температуры собственной разработки надежно прикреплен к входной канюле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Преобразователи/усилители сигнала и блок аналогово-цифрового преобразователя. (A). Преобразователь/усилитель давления в легочной артерии. (B). Регулятор скорости насоса. (C). Датчик/усилитель давления в левом предсердии. (D). Модуль веса легких. (E). Аналогово-цифровой преобразователь. (F). Персональный компьютер для отображения и записи данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Иллюстрация 4: Поддержание температуры перфузата во время ЭВЛП. (1) Термостатическая водяная баня. (2) Резервуар для перфузата с двойными стенками стеклянного контейнера, в котором циркулирует вода из термостатической водяной бани. (3) Нагревательная трубка внутри емкости с подогревом воды, подключенной к термостатической водяной бане. (4) Органная камера со стеклянным контейнером с двойными стенками для циркуляции теплой воды из водяной бани. (5) Электронный термометр и датчик температуры собственной разработки надежно прикреплены к впускной канюле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Иллюстрация 5: Определение оптимальной температуры для термического предварительного кондиционирования. (A) Протокол EVLP для оценки различных температур нагрева. От 60 мин до 90 мин ЭВЛП температуру перфузата повышали при указанных температурах. Через 90 мин ЭВЛП температуру возвращали к 37 °С в течение 90 мин до конца ЭВЛП, где проводили различные физиологические и молекулярные измерения. (B) Резюме результатов влияния различных температур нагрева на физиологические и молекулярные параметры (зеленый цвет указывает на благоприятные эффекты, красный – на неблагоприятные эффекты, а оранжевый – на смешанные эффекты). Температура нагрева 41,5 °C обеспечивала наибольший защитный эффект. Сокращения: EVLP = ex-vivo перфузия легких; TP = предварительное термическое кондиционирование. Эта цифра была изменена по Ojanguren et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Хирургический материал. (А) Инструменты для извлечения блокады сердца-легкого: держатель клипсы для аневризмы и микроклипса для аневризмы (система Ясаргиль), зажим для бульдога, ножницы, микроножницы, ретракторы, прикрепленные к эластичным лентам. (B) Канюли EVLP для легочной артерии (ПА), левого предсердия (ЛП) и трахеи. (В) Самодельная перфузионная система для промывания легких холодным перфузатом. Расстояние между уровнем ПА у животного и дном шприца устанавливается на уровне 20 см. (С) Самодельный держатель. (Не показаны: хирургический микроскоп, аппарат искусственной вентиляции легких и установка для анестезии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Репрезентативные изображения хирургической подготовки (А) Предварительно завязанный узел вокруг легочной артерии. (Б) Предварительно завязанный узел вокруг кончика сердца. (C) Бульдожий зажим (синий круг) на канюле PA и зажим для аневризмы (красный круг) на трахее. Сокращение: PA = легочная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Блок-схема. Основные шаги для продвижения по различным этапам протокола. Период от 1 ч до 1,5 ч ЭВЛП увеличивается для обозначения протокола лечения в соответствии с распределением по группам (контроль против термического предварительного кондиционирования). Сокращения: ДИ = холодовая ишемия; EVLP = перфузия легких ex-vivo ; PA = легочная артерия; SPC = статическая легочная податливость; TP = термическая предварительная подготовка; WI = теплая ишемия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: Репрезентативные результаты эффектов термического предварительного кондиционирования в поврежденных легких крыс. Легкие, поврежденные в результате 1 ч теплой ишемии, перфузировали в системе ЭВЛП в течение 6 ч. С 60 по 90 мин ЭВЛП группа легких подвергалась термическому предварительному кондиционированию при температуре 41,5 °С (группа ТП). Контрольная группа легких поддерживалась на уровне 37 °C на протяжении всей ЭВЛП. (A) Статическая легочная податливость (SPC), выраженная в виде отношения к исходному значению, в контроле (Ctrl, n = 5) и TP легких (n = 5). SPC лучше сохранялся в легких с ТП. (B) Увеличение массы тела легких во время ЭВЛП в контроле (n = 5) и легких TP (n = 5). В группе ТП наблюдалось значительное снижение образования отеков. (C) Высвобождение в перфузате биомаркера эндотелиальных клеток фактора фон Виллебранда было подавлено в группе TP (n = 5) по сравнению с контрольной группой (n = 5). (D) Макроскопическое и микроскопическое (окрашивание гематоксилин-эозином) легкие в конце ЭВЛП в контрольных (n = 5) и TP легких (n = 5). (E) Оценка повреждения легких (для количественной оценки гистологического повреждения) была ниже в группе TP (n = 5) по сравнению с контрольной группой (n = 5). (F) Уровни белка индуцируемого теплового шока HSP70 в экстрактах легочной ткани, измеренные после 1, 2, 3, 4,5 и 6 ч ЭВЛП в контрольной группе и группе ТП (n = 5/группа в каждый момент времени), демонстрируя выраженную реакцию на тепловой шок в группе ТП. Экспрессия HSP70 в группе ТП достигала пика через 3 ч ЭВЛП (через 90 мин после окончания ТП) и оставалась стабильной до конца ЭВЛП.
На всех графиках показаны средние значения ± SEM. Для экспериментов с ходом времени (A-C,F) статистические сравнения проводились с использованием двусторонней ANOVA с последующим тестом Сидака для группового эффекта и поправками Бонферрони для влияния времени (с временем 1 ч в качестве эталона). Для оценки повреждения легких (E) статистические сравнения проводились с использованием теста Манна-Уитни. * p < 0,05 (межгрупповые различия), † p < 0,05 против 1 ч ЭВЛП. Сокращения: Ctrl = управление; EVLP = перфузия легких ex-vivo; HSP70 = белок теплового шока 70; SPC = статическая легочная податливость; TP = предварительное термическое кондиционирование. Модифицировано по Parapanov et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Состав растворов, использованных в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Настройки ЭВЛП для перфузионного потока, температуры притока (на уровне канюли легочной артерии) и вентиляции с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Устранение неполадок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Разработка воспроизводимой и физиологически значимой модели EVLP крысы представляет собой значительный шаг вперед в исследованиях в области трансплантации легких. Несмотря на значительные видовые различия между легкими крысы и человека (недавно рассмотренные впункте 1), в частности, большую уязвимость легких крысы, модель EVLP крысы предлагает фармакологические и нефармакологические вмешательства с высокой воспроизводимостью и низкой стоимостью. EVLP предлагает уникальную платформу для оценки функции донорских легких, моделирования сценариев клинических повреждений, таких как ишемия-реперфузионное повреждение, и реализации терапевтических вмешательств до трансплантации 2,39,40. В этом контексте модель EVLP крысы позволяет проводить высокопроизводительные механистические исследования в строго контролируемых условиях33. В последние годы несколько групп внесли свой вклад в совершенствование методов ЭВЛП крыс. Nelson et al. предоставили основополагающее процессуальное руководство39. Wang et al. предложили модульную установку EVLP, предназначенную для имитации моделирования донорства после смерти от кровообращения (DCD)41. Gouchoe et al. исследовали новые формы перфузата с использованием искусственных носителей кислорода42, а Oliveira et al. сосредоточились на воспалении после длительного сохранения холодовой ишемии38. Основываясь на этих существующих знаниях, наш текущий протокол представляет новую, нефармакологическую стратегию, а именно термическое предварительное кондиционирование, предназначенное для активации эндогенных защитных механизмов для восстановления трансплантатов легких крыс, поврежденных теплой ишемией. Наша модель поврежденного легкого, которая имитирует условия DCD, была выполнена на самцах крыс Sprague-Dawley33.

Создание этого протокола потребовало тщательного внимания к нескольким технически сложным этапам, которые критически влияют на жизнеспособность и воспроизводимость легких. Извлечение легких должно быть выполнено с минимальными манипуляциями, чтобы избежать травмы паренхимы. Глубина анестезии имеет первостепенное значение для предотвращения застоя в легких, вызванного задыханием, и плохого обескровливания. Строгое исключение пузырьков воздуха во время канюляции и контурного грунтования имеет важное значение, так как даже небольшие эмболы могут вызвать отек43. Конкретные советы по устранению неполадок для распространенных проблем протокола приведены в таблице 3. В то время как настройки вентиляции и перфузии могут быть отрегулированы в безопасных пределах, необходимо поддерживать стратегии защиты легких для предотвращения баротравмы или волютравмы44. Поток перфузата может быть увеличен до 20% от расчетного сердечного выброса у крыс по сравнению с 40% у более крупных моделей, таких как свиньи и люди, но должен быть тщательно титруем45. В нашем протоколе мы используем более низкий поток перфузата (7,5% от теоретического сердечного выброса), чтобы предотвратить скачки давления в легочной артерии и развитие раннего отека легких в теплых ишемически поврежденных легких, тем самым обеспечивая длительную подготовку. Хотя некоторые лаборатории вводят кортикостероиды во время перфузии для уменьшения воспаления46,47, их известные противовоспалительные эффекты могут исказить некоторые экспериментальные результаты, и поэтому мы не используем их в нашей модели, чтобы сохранить возможность изучения повреждения легких и воспалительных процессов.

Для предварительного теплового кондиционирования требуется точный контроль температуры. Поскольку тепло теряется по трубке от резервуара к легкому, температуру перфузата необходимо контролировать на входной канюле, а температуру водяной бани поддерживать немного выше желаемой температуры притока для достижения целевой температуры внутри препарата. Датчики ежегодно калибруются с помощью многоканального цифрового термометра PCE-T 1200 для обеспечения точности.

Наши результаты также учитывают ключевые ограничения традиционной тепловой терапии. Системное применение тепла ограничено неточной регуляцией температуры, системными побочными эффектами и недостаточной специфичностью органов. EVLP обходит эти барьеры, обеспечивая контролируемую, локализованную среду, позволяющую точно доставлять тепловой стресс непосредственно в легочную ткань29. Этот метод обеспечивает строгую модуляцию как величины, так и продолжительности термического напряжения, двух критических параметров для оптимизации защитной клеточной реакции без запуска термического повреждения. Кроме того, наша платформа EVLP позволяет проводить множественные последующие оценки, включая молекулярный, гистологический и функциональный анализы. Важно отметить, что легкие, подвергшиеся ЭВЛП, также могут быть пересажены, что позволяет напрямую оценить функцию трансплантата после ЭВЛП in vivo29. Таким образом, модель поддерживает оценку как на уровне изолированного органа, так и на уровне после трансплантации. В этом контексте интеграция термической предварительной подготовки, т.е. кратковременного воздействия 41,5 °C во время ЭВЛП, представляется многообещающим вмешательством. Стимулируя реакцию на тепловой шок и другие стресс-адаптивные пути, этот метод повышает устойчивость трансплантата без фармакологических искажающих факторов. Наши результаты показывают, что термическое предварительное кондиционирование улучшает физиологию легочного трансплантата, уменьшает образование отеков и высвобождение медиаторов воспаления и биомаркеров клеточного повреждения (примером чего является снижение уровня фактора фон Виллебранда в перфузате EVLP термически обработанных легких). Морфологический анализ также подтверждает защитный эффект этого вмешательства, с уменьшением структурных повреждений и сохранением целостности тканей. Большинство экспериментальных данных EVLP на крысах были получены у самцов, что ограничивает понимание пола; В двух исследованиях сообщали о расходящихся исходах у женщин - уменьшение реперфузионного повреждения в одном и усиление воспаления в другом48,49. Хотя в нашем исследовании использовались мужчины, ранее мы наблюдали преимущества TP в модели EVLP свиней с использованием самок29, что свидетельствует о релевантности для представителей разных полов.

Необходимо подчеркнуть важные ограничения и недостатки нашего метода. Во-первых, чтобы гарантировать перфузию легких с фактической желаемой температурой, последнюю необходимо контролировать на входной канюле путем плотного применения датчика температуры. Во-вторых, необходимо, чтобы изменения температуры происходили в течение очень коротких периодов времени, что требует использования быстродействующей термальной водяной бани для нагрева и добавления льда в водяную баню для быстрого охлаждения. В-третьих, физиологическая реакция на тепловой стресс может различаться в зависимости от используемого вида и сильно зависит от уровня и продолжительности стресса. В связи с этим обязательным является проведение пилотных экспериментов с использованием различных температур нагрева в течение различной продолжительности в случае, если данный протокол применяется к различным видам животных или человеческим легким, и оценка конкретных конечных точек, относящихся как к защитным, так и к потенциальным вредным последствиям применяемого теплового стресса. В-четвертых, благодаря кинетической экспрессии чувствительных к теплу генов, эффекты термической предварительной подготовки зависят от времени восстановления после применения теплового стресса. Для оценки таких зависящих от времени эффектов теплового воздействия требуется проведение экспериментов с использованием различных длительностей после теплового напряжения (т.е. с разной продолжительностью ЭВЛП), как показано в нашей недавней публикации поэтой теме.

В целом, наше текущее исследование устанавливает подробный, воспроизводимый протокол EVLP крыс, включающий термическое предварительное кондиционирование в качестве жизнеспособной стратегии для улучшения качества маргинальных донорских легких. Протокол является масштабируемым и адаптируемым к более крупным системам EVLP животных или человека, что усиливает его трансляционную актуальность. Обеспечивая как методологическую строгость, так и физиологическую точность, эта модель открывает новые возможности для изучения нефармакологических вмешательств, направленных на снижение ишемии-реперфузионного повреждения и улучшение исходов легочного трансплантата после трансплантации.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

При поддержке гранта Швейцарского национального научного фонда (No 310030_212252) для TK и LL).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>общее снаряжение
Клип аневризмы Б. БраунFE762K
Тепловой датчик воздушно-поверхностных шариковTES Electrical Electronic Corp/Distrelec AGTP01/176-67-162
Тупые ретракторыТонкие научные инструменты18200-09
Бульдог СерафинесТонкий научный инструмент18051-50
Взгляд сжимает Promedical25404
Соединительный набор для анестезииHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3076
Ватные палочкиApplimed SA6001109
Ножницы для вскрытияБ. Браун  BC165R
Маска для лица для крысыTem SegaPFM0006
Гепарин 5000 U/mLБ. Браун3522430
Индукционная камера для анестезииHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus50-0116
Щипцы для рассечения радужки полностью изогнутыеЭскулап  OC022R
ИзофлуранProvet AG2222
Пар изофлуран 19,3Медицинская клиника РотачерCV30-310 O2/Air
Картридж iSTAT4Axon lab AG03P85-25
Кетазол 100 (100 мг/мл)Доктор Э. Греуб АГQN01AX03
Листерские ножницы Б. БраунBC876R
Микроножницы, изогнутые тупые/тупые ножницыAesculap FM011R
Щипцы Micro-AdsonТонкий научный инструмент11018-12
Микро-комарные гемостатыТонкий научный инструмент13011-12
Microscop OPMI MDUZeiss267067
NaCl 0,9 % Б. Браун534534
Игла 23 G x 25 ммBD Microlance 4300800
Игла 25 G x 25 ммBD Microlance 3300400
Perfadex (решение для сохранения)Xvivo перфузия AB19811
Перфузионный шприц 60 мл люер-замкаBD пластик300865
РасорAesculap GT-421
МасштабМеттлер ТоледоPB602-L
Шёлковый шов 4-0Б. БраунF1134035
Шёлковый шов 5-0Б. БраунF1134027
Стин (раствор перфузии)Xvivo перфузия AB19004
Хирургические перчаткиАнселл93-843
Шприц 1 мл, Omnifix-FБ. Браун9161406V
ЗаписьLeukofix02136-00
ТермометрTES Electrical Electronic Corp1303
Пробирки с формолом  Biosystems Switzerland AG87-0960-00-10113
Вентилятор (EVLP) (Установка приливного объёма согласно протоколу EVLP)FlexiventFX3
Аппарат искусственной вентиляции лёгких (подача легких) и bbsp; (Объём прилива установлен как: 7.69*(вес тела (кг))^1.04)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus683
WEITLANER РетракторБ. БраунBV073R
Ксилазол (1 мг/мл)Доктор Э. Греуб АГQN05CM92
Applier YasargilБ. БраунFE502T
<сильная>система IPL-2 EVLP
Адаптер для положительного давленияHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3635
AME 14- SC0062 насосная трубка (tygon) с 3-стопным воротником, упаковка из 12Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0126
AME 24-SC0072 насосная трубка (tygon) с тремя ступенями с воротником, упаковка из 12Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0155
Базовое устройство для изолированного перфузионного лёгкого размера 2 (IPL-2) типа 829/2Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-2266
Комплект соединения для волоконного оксигенатора D150Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3765
Модуль балансировки отёков EBM (EBM) с датчикомHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-4626
Волокнистый оксигенатор типа D150, упаковка из 5 штукHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3762
Держатель для зажима аортальной или трахеальной канюли для OP-столов размера 5Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3855
Держатель для оксигенаторовHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3061
Система измерения веса HSEHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-4604
Базовое программное обеспечение для сбора данных HSE-BDAS для Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-1712
Аппаратное обеспечение для сбора данных HSE-USB, отдельная USB-приставка для Windows 10 или 11Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3330
Аналоговый роликовый насос ISM 827/230 V, 4 канала, 0,003-35 мл/мин (2 раза)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0114
Канюля левого предсердия (DD 4,0 мм)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0712
Мини-кислородный электрод с проточным протоком с фитингами 1/16" (опционально)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-4189
Монтажный набор для волокнистого оксигенатора типа D150 на держателяхHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3759
Односторонний запорный кран типа 9500 (один для Пенсильвания, один для Лос-Анджелеса)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0097
OPPM plugsys кислородный парциальный модуль типа 697  (По желанию)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0210
Plugsys базовый тип корпуса 603Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0045
pO2 раствор нулевой раствор 20 упаковок по 20 мл  (По желанию)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3812
Датчик давления P75 типа 379/HSE, диапазон -75 до +75 мм рт. ст. (PA, LA)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0020
Канюля легочной артерии (OD 2,0 мм, диаметр головы 2,5 мм)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0711
Резервуар (с оболочкой) для буферного раствораHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3496
SCP plugsys сервоконтроллер для перфузионного типа 704Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-2806
Экранирующий корпус для одного pO2 или pCO2 мини-сенсора и bbsp; (По желанию)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-4196
Небольшая монтажная пластина для одного датчика O2 или CO2 сенсора и nbsp; (По желанию)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3000
Модуль усилителя TAM-A plugsys тип 705/1 (один для PA, один для LA)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0065
Термостатический циркулятор E 103 (3 л)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0125
Трёхсторонний стоп-кран типа 9560 R (один для Пенсильвания, один для Лос-Анджелеса)Hugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-0096
Комплект трубок для подъёмного буферного резервуара с клапанами запорки жидкостиHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3456
Вентиляционная канюля (трахея) OD 2,0 мм, L 14 ммHugo Sachs Elektronik — Harvard Apparatus73-3384
<сильно>компьютерное программное обеспечение
Базовое программное обеспечение для сбора данных HSE-BDAS для Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik — Harvard ApparatusV2.0
ExcelMicrosoft2502, Microsoft 365
FlexiwareСкирек8
GraphPad PrismGraphPad Software inc.10.0.1
Крысы Спраг-Доули Charles River Laboratories (Сен-Жермен-Нюэль, Франция) 

Ссылки

  1. Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: A review of translational interspecies models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (6), L932-L940 (2020).
  2. Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. J Thorac Dis. 13 (11), 6602-6617 (2021).
  3. Kukreja, J., Chen, J., Brzezinski, M. Redefining marginality: Donor lung criteria. Curr Opin Organ Transplant. 25 (3), 280-284 (2020).
  4. Lyengar, A., Schiazza, A., Cantu, E. 3rd Ex-vivo lung perfusion therapies: Do they add value to organ donation. Curr Opin Organ Transplant. 27 (3), 204-210 (2022).
  5. Porteous, M. K., Diamond, J. M., Christie, J. D. Primary graft dysfunction: Lessons learned about the first 72 h after lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (5), 506-514 (2015).
  6. Shah, R. J., Diamond, J. M. Primary graft dysfunction (pgd) following lung transplantation. Semin Respir Crit Care Med. 39 (2), 148-154 (2018).
  7. Shepherd, H. M., et al. Innate immunity in lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (7), 562-568 (2021).
  8. Talaie, T., et al. Ischemia-reperfusion injury in the transplanted lung: A literature review. Transplant Direct. 7 (2), e652(2021).
  9. Capuzzimati, M., Hough, O., Liu, M. Cell death and ischemia-reperfusion injury in lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 41 (8), 1003-1013 (2022).
  10. Cantu, E., et al. Gene set enrichment analysis identifies key innate immune pathways in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Transplant. 13 (7), 1898-1904 (2013).
  11. Geraci, T. C., Chan, J. C. Y., Niroomand, A., Chang, S. H. Post lung transplant primary graft dysfunction. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 37 (2), 192-198.e1 (2025).
  12. Ta, H. Q., Kuppusamy, M., Sonkusare, S. K., Roeser, M. E., Laubach, V. E. The endothelium: Gatekeeper to lung ischemia-reperfusion injury. Respir Res. 25 (1), 172(2024).
  13. Machuca, T. N., et al. Safety and efficacy of ex vivo donor lung adenoviral il-10 gene therapy in a large animal lung transplant survival model. Hum Gene Ther. 28 (9), 757-765 (2017).
  14. Nykanen, A. I., et al. Engineered mesenchymal stromal cell therapy during human lung ex vivo lung perfusion is compromised by acidic lung microenvironment. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 184-197 (2021).
  15. Yeung, J. C., et al. Ex vivo delivery of recombinant il-10 to human donor lungs. JHLT Open. 7, 100192(2025).
  16. Francioli, C., et al. Pyrrolidine dithiocarbamate administered during ex-vivo lung perfusion promotes rehabilitation of injured donor rat lungs obtained after prolonged warm ischemia. PLoS One. 12 (3), e0173916(2017).
  17. Wang, X., et al. Treatment with 3-aminobenzamide during ex vivo lung perfusion of damaged rat lungs reduces graft injury and dysfunction after transplantation. Am J Transplant. 20 (4), 967-976 (2020).
  18. Wang, X., et al. Pharmacological reconditioning of marginal donor rat lungs using inhibitors of peroxynitrite and poly (adp-ribose) polymerase during ex vivo lung perfusion. Transplantation. 100 (7), 1465-1473 (2016).
  19. Stone, M. L., et al. Ex vivo perfusion with adenosine a2a receptor agonist enhances rehabilitation of murine donor lungs after circulatory death. Transplantation. 99 (12), 2494-2503 (2015).
  20. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222(2020).
  21. Singh, M. K., et al. Heat shock response and heat shock proteins: Current understanding and future opportunities in human diseases. Int J Mol Sci. 25 (8), (2024).
  22. Ahmed, K., Zaidi, S. F., Mati Ur, R., Rehman, R., Kondo, T. Hyperthermia and protein homeostasis: Cytoprotection and cell death. J Therm Biol. 91, 102615(2020).
  23. Inouye, S., et al. Nrf2 and hsf1 coordinately regulate heme oxygenase-1 expression. Biochem Biophys Res Commun. 506 (1), 7-11 (2018).
  24. Park, S., et al. Modulation of protein synthesis by eif2alpha phosphorylation protects cell from heat stress-mediated apoptosis. Cells. 7 (12), 254(2018).
  25. Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to upr pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
  26. Yang, Y., et al. Ursolic acid alleviates heat stress-induced lung injury by regulating endoplasmic reticulum stress signaling in mice. J Nutr Biochem. 89, 108557(2021).
  27. Mccormick, J. J., Dokladny, K., Moseley, P. L., Kenny, G. P. Autophagy and heat: A potential role for heat therapy to improve autophagic function in health and disease. J Appl Physiol (1985). 130 (1), 1-9 (2021).
  28. Mccormick, J. J., et al. Regulation of autophagy following ex vivo heating in peripheral blood mononuclear cells from young adults. J Therm Biol. 91, 102643(2020).
  29. Ojanguren, A., et al. Therapeutic reconditioning of damaged lungs by transient heat stress during ex vivo lung perfusion. Am J Transplant. 23 (8), 1130-1144 (2023).
  30. Parapanov, R., et al. Optimal duration of ex vivo lung perfusion for heat stress-mediated therapeutic reconditioning of damaged rat donor lungs. Eur J Cardiothorac Surg. 67 (2), ezaf027(2025).
  31. Parapanov, R., et al. Transient heat stress protects from severe endothelial damage and dysfunction during prolonged experimental ex-vivo lung perfusion. Front Immunol. 15, 1390026(2024).
  32. De Brito, F. B., Hanahoe, T. H., Shah, P., West, G. B. Delayed hypersensitivity reactions in rats and their response to clinical dextran. Int Arch Allergy Appl Immunol. 69 (2), 109-112 (1982).
  33. Stahl, W. R. Scaling of respiratory variables in mammals. J Appl Physiol. 22 (3), 453-460 (1967).
  34. Levvey, B., et al. Influence of lung donor agonal and warm ischemic times on early mortality: Analyses from the ishlt dcd lung transplant registry. J Heart Lung Transplant. 38 (1), 26-34 (2019).
  35. Parapanov, R., et al. Experimental models of ischemic lung damage for the study of therapeutic reconditioning during ex vivo lung perfusion. Transplant Direct. 8 (7), e1337(2022).
  36. Lindstedt, S. L., Schaeffer, P. J. Use of allometry in predicting anatomical and physiological parameters of mammals. Lab Anim. 36 (1), 1-19 (2002).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: Lessons learned from developing a rat evlp program. J Vis Exp. (96), e52309(2015).
  38. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. (199), e65981(2023).
  39. Nakata, K., Alderete, I. S., Hughes, B. A., Hartwig, M. G. Ex vivo lung perfusion: Recent advancements and future directions. Front Immunol. 16, 1513546(2025).
  40. Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool: Donation after circulatory death, ex-vivo lung perfusion and hepatitis c donors. Clin Chest Med. 44 (1), 77-83 (2023).
  41. Wang, Z., et al. Establishment of a novel ex vivo lung perfusion system for rat lungs after circulatory death. J Vis Exp. (212), e67168(2024).
  42. Gouchoe, D. A., et al. Exploring alternative perfusion solutions using next-generation polymerized hemoglobin-based oxygen carriers in a model of rat ex vivo lung perfusion. J Vis Exp. (208), e66702(2024).
  43. Bassani, G. A., et al. Ex vivo lung perfusion in the rat: Detailed procedure and videos. PLoS One. 11 (12), e0167898(2016).
  44. Braithwaite, S. A., Van Hooijdonk, E., Van Der Kaaij, N. P. Ventilation during ex vivo lung perfusion, a review. Transplant Rev (Orlando). 37 (2), 100762(2023).
  45. Iskender, I. Technical advances targeting multiday preservation of isolated ex vivo lung perfusion. Transplantation. 108 (6), 1319-1332 (2024).
  46. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. Eur J Cardiothorac Surg. 45 (3), e54-e60 (2014).
  47. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (1), L61-L70 (2020).
  48. Mrazkova, H., Lischke, R., Herget, J. Influence of gender on ischemia-reperfusion injury in lungs in an animal model. Physiol Res. 65 (6), 953-958 (2016).
  49. Ricardo-Da-Silva, F. Y., et al. Male versus female inflammatory response after brain death model followed by ex vivo lung perfusion. Biol Sex Differ. 15 (1), 11(2024).

Перепечатки и разрешения

Теги

70
Термическая предварительная подготовка во время перфузии легких ex-vivo для реабилитации поврежденных трансплантатов легких перед трансплантацией
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.