Методическая статья

Стандартизированный рабочий процесс SDS-PAGE для персонализированного профилирования белковой короны в раннем выявлении рака

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69090

⸱

19 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол стандартизирует анализ SDS-PAGE для персонализированного профилирования белковых корон на наночастицах, обеспечивая воспроизводимое, масштабируемое и недорогое обнаружение специфических для рака сигнатур. Разработанный для ранней диагностики аденокарциномы протоков поджелудочной железы, он представляет собой практическую, согласованную с REASSURED альтернативу сложным протеомным методам как в научных, так и в клинических условиях.

Аннотация

Формирование персонализированной белковой короны (ПК) на наночастицах (НП) при воздействии биологических жидкостей стало перспективной, малоинвазивной стратегией раннего выявления рака. В данном исследовании представлен стандартизированный протокол профилирования белковой короны с использованием электрофореза гель-электрофореза натрия додецилсульфат полиакриламида (SDS-PAGE), оптимизированный для обеспечения прочности, воспроизводимости и автоматизации. Метод был тщательно проверен на различных платформах наночастиц (NP), источниках плазмы и экспериментальных условиях, демонстрируя стабильно воспроизводимые профили с минимальной операторно-зависимой вариабельностью. По сравнению с традиционными методами протеомики, этот подход предлагает более быстрое и экономичное решение, соответствующее критериям диагностики REASSURED Всемирной организации здравоохранения. При применении к поджелудочной протоковой аденокарциноме (PDAC), высокоагрессивному злокачественному опухоли с ограниченным количеством ранних биомаркеров, этот процесс обеспечивал классификационную точность до 90% даже у пациентов на ранних стадиях. Эта стандартизированная платформа знаменует собой значительный прогресс в направлении масштабируемых, клинически переводимых и доступных диагностических инструментов скрининга рака.

Введение

Корона белка наночастиц (NP-PC)

Характеристика ПК, формирующейся на поверхности NPs после воздействия биологических жидкостей, стала мощной стратегией диагностики заболеваний и персонализированноймедицины 1. Этот слой адсорбированных белков, динамического и специфичного для болезни по составу, трансформирует синтетическую идентичность NPs и определяет их биологическиевзаимодействия 2. Состав ПК не случайный, а сильно зависит как от физико-химических свойств NP, так и от биологической среды, в которую онивводятся 3. Такие факторы, как размер NP, форма, поверхностный заряд и состав, могут существенно влиять на аффинность, кинетику и структурное расположение адсорбированных белков. Аналогично, биологическая жидкость, её источник, сложность и состояние болезни играют ключевую роль в определении окончательного состава короны 4,5,6.

Динамический характер короны дополнительно усложняет её анализ, поскольку её структура со временем эволюционирует от мягкого, слабо связанного внешнего слоя к более устойчивому и плотно адсорбированному внутреннемуядру 7,8. Эта развивающаяся архитектура, возникшая в результате конкурентных событий адсорбции белков, требует временно разрешенных и стандартизированных подходов для осмысленнойхарактеристики 9. Несмотря на эту сложность, сейчас широко признано, что ПК — это не просто артефакт, а биологически информативный слой, способный фиксировать системные изменения заболеваний неинвазивным способом. Цель метода, описанного в этой статье, — стандартизировать использование SDS-PAGE для надёжного, воспроизводимого и доступного профилирования персонализированного ПК, особенно для раннего выявления рака с помощью методов жидкойбиопсии 10.

Персонализированный компьютер и его значимость в выявлении рака

Научная основа этого метода заключается в концепции персонализированного ПК. При инкубации с плазмой пациента NPs адсорбируют уникальный отпечаток белка, отражающий физиологическое или патологическое состояниеиндивида 11,12. Эта концепция была подтверждена исследованиями, показывающими значительные изменения состава ПК при наличии заболевания, включая аденокарциному протоков поджелудочной железы (PDAC),рака легких 13,менингиомы 14 и глиобластомумультиформной 15. В частности, при PDAC ПК, полученные из плазмы пациента, существенно отличаются от ПК здоровых доноров. Эти различия были использованы в моделях классификаторов, которые достигают до 90% точности диагностики. Таким образом, ПК служит наномасштабным концентратором специфических для болезнейсигналов 16.

Недавние исследования показали, что ПК у пациентов с раком обогащаются белками, участвующими в воспалении, свертывании, активации комплемента и транспорте внеклеточных везикул — биологических путях, известных своей дисрегулированностью призлокачественных раках. Эти белковые паттерны хорошо воспроизводимы в отдельных классах пациентов, но при этом явно различаются в разных состояниях болезни, что говорит о том, что корона может функционировать не только как общий датчик болезни, но и как классификатор, специфичный для заболевания. В контексте PDAC, одного из самых смертоносных и коварных злокачественных опухолей, наша группа стала пионерами в проведении тестов крови с поддержкой NP (NEB) на основе характеристик PC 18,19,20. Этот минимально инвазивный подход использует способность NP селективно обогащать белоки плазмы с низким содержанием и изменённые заболеваниями, делая их обнаруживаемыми с помощью простого стационарного электрофоретического разделения.

Преимущества по сравнению с традиционными протеомными методами

Обоснование разработки такого подхода связано с ограничениями традиционных методов протеомики, таких как масс-спектрометрия (РС), которые, хотя и обеспечивают глубокое покрытие протеомом, являются дорогими, трудоёмкими и плохо подходят для высокопроизводительного скрининга или диагностики на местеоказания оказательной помощи 21. Ещё одной ключевой проблемой является внутренняя сложность РС, где вариации в подготовке образцов, калибровке приборов, параметрах сбора и анализе данных способствуют значительным межлабораторным различиям в составе ПК22. В отличие от этого, анализ SDS-PAGE PC предлагает быстрый и экономически эффективный способ фиксировать протеомные паттерны, связанные с болезнями. Ключевым является то, что данные SDS-PAGE не опираются на абсолютную идентификацию отдельных биомаркеров, а на выявление систематических изменений в глобальном профиле белка, которые можно анализировать с помощью денситометрии и многомерной статистики.

В отличие от анализов на основе антител, которые ограничены известными мишенями и подвержены перекрёстной реактивности, SDS-PAGE предлагает объективный взгляд на ландшафт белков, сохраняя целостность исходного образца и позволяя интеграцию в дальнейшем с комплементарными платформами, такими как LC-MS/MS, для идентификации белков. Кроме того, поскольку SDS-PAGE не требует этапов фракционирования или истощения образцов, он особенно подходит для анализа биологических образцов малого объёма, что является важной особенностью для приложений, связанных с ранней диагностикой или скринингом уязвимыхпопуляций 23. По всем этим причинам этот протокол соответствует нескольким критериям REASSURED ВОЗ (подключение в реальном времени, простота сбора образцов, доступность, чувствительность, специфическая, удобная для пользователя, надёжность, отсутствие оборудования и результативность), что делает его практичным инструментом для масштабируемойдиагностики 24. На основании этих данных было выдвинуто гипотеза, что NPs инкубируют с адсорбцией плазмы пациента воспроизводимый, специфичный для заболевания ПК, который можно систематически профилировать с помощью SDS-PAGE. Мы также предлагаем, что стандартизированный электрофоретический анализ этих персонализированных корон может отличать онкологических пациентов от здоровых людей, предоставляя таким образом надёжный и клинически переводимый диагностический инструмент.

Рабочий процесс и клиническая применимость

Протокол корона-профилирования на основе SDS-PAGE систематизирует каждый этап: от подготовки и инкубации NPs с разбавленной плазмой до коронной изоляции, гель-электрофореза и количественного денситометрического анализа (см. рисунок 1). Ключевые параметры, такие как время инкубации, разбавление плазмы и NP тип25 , тщательно настроены для обеспечения оптимального захвата белка и разрешения изображения геля. Протокол также учитывает практические вопросы, такие как пропускная способность выборки, стабильность хранения и согласованность междупартиями 26. Кроме того, поскольку это неразрушающий метод, SDS-PAGE можно бесшовно комбинировать с комплементарными протеомными подходами, такими как MS, для идентификации молекулярного состава отдельных белковыхдиапазонов 15. Рабочий процесс оптимизирован с учётом высокой воспроизводимости между операторами, включая совместимость с ручными и автоматизированными платформами пипетирования, и он надёжен при различных NP-химиях и концентрациях плазмы. Эти функции обеспечивают применение метода в различных лабораторных условиях, что делает его пригодным как для централизованных диагностических центров, так и для децентрализованных исследовательских лабораторий. Таким образом, этот метод особенно подходит для исследователей и клиницистов, занимающихся ранней диагностикой, открытием биомаркеров и трансляционной наномедициной. Он применим к широкому спектру патологий и адаптируется к различным биологическим жидкостям, выходящим за рамки плазмы, включая слюну или мочу. Гибкость и надёжность этого протокола делают его отличным кандидатом для интеграции в клинические валидационные конвейеры, крупномасштабные скрининговые исследования и платформы на месте оказания помощи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол обеспечивает подробный и стандартизированный рабочий процесс для подготовки, инкубации с человеческой плазмой (HP), выделения и анализа ПК, сформированного на различных типах NP. Рисунок 2 — графическое представление всего протокола, описывающее последовательные экспериментальные этапы от синтеза NP до многомерного SDS-PAGE анализа профилей белков. Важно, что методология была стандартизирована нашей группой, как показано в предыдущих работах18,26, обеспечивая воспроизводимость и надёжность результатов. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка и характеристика NP

  1. Нанолисты GO
    1. Разведите настоящий раствор 4 мг/мл в сверхчистой воде до нужной концентрации. Соник в течение 2 минут при амплитуде 28% (импульс: 0,8/0,6 с) для правильного дисперсионирования.
    2. Количественная оценка концентрации с помощью UV-Vis спектроскопии
    3. Измерять гидродинамический размер и зета-потенциал с помощью динамического рассеяния света (DLS) с помощью 633-нм He-Ne лазера. Подготовка образцов путём разбавления в сверхчистой воде с учётом пределов обнаружения кюветы (например, разбавление 1:100 для кювет 1 мл). Зафиксированное среднее ± стандартное отклонение (SD) от трёх реплик.
  2. Золотые NPs
    1. Используйте цитратно-стабилизированные 100-нм золотые NP (концентрация из запаса: 3,8E+9 частиц/мл) без дальнейших изменений.
    2. Измерять гидродинамический размер и зета-потенциал с помощью динамического рассеяния света (DLS) с помощью 633-нм He-Ne лазера. Подготовка образцов путём разбавления в сверхчистой воде с учётом пределов обнаружения кюветы (например, разбавление 1:100 для кювет 1 мл). Запись означает ± SD из трёх репликатов.
  3. Липосомы DOTAP
    1. Растворить порошок 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропана (DOTAP) в хлороформе внутри сертифицированного химического выхлопчика с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, очки). Испариться в вакууме в течение 2 часов, затем снова суспензировать липидную пленку с ультрачистой водой до конечной концентрации 1 мг/мл и гидратировать ночью при 4 °C. Наконец, экструдируйте раствор липосом 20 раз через поликарбонатный фильтр диаметром 0,1 мкм.
    2. Измерять гидродинамический размер и зета-потенциал с помощью динамического рассеяния света (DLS) с помощью 633-нм He-Ne лазера. Подготовка образцов путём разбавления в сверхчистой воде с учётом пределов обнаружения кюветы (например, разбавление 1:100 для кювет 1 мл). Запись означает ± SD из трёх репликатов.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с хлороформом в вытяжке с полной индивидуальной защитой. Утилизировать отходы органических растворителей в соответствии с институциональными процедурами химической безопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для GO с распределением размеров примерно на 300 нм, соникайте 10 минут при 125 Вт, центрифугу при 7 700 x г в течение 30 минут при 4 °C, собирайте супернатант, снова центрифугуйте при 18 620 x g в течение 30 минут и снова суспензируйте гранулу. Для ГО с распределением размеров примерно в 100 нм, соникайте 3 × 180 минут при 4 °C, центрифугуйте при 10 000 x г в течение 30 минут, при 4 °C после каждого круга и собирайте финальный супернатант.

2. Подготовка человеческой плазмы

  1. Коммерческая человеческая плазма (HP)
    1. Разбавляйте коммерческую лиофилизированную плазму сверхчистой водой по мере необходимости.
    2. Центрифугуйте восстановленную плазму при 18620 x g в течение 15 минут при 4 °C, соберите супернатант и храните при -80 °C до использования.
  2. HP, полученный пациентом
    1. Центрифугуйте образцы крови при 1216 x g в течение 10 минут при 4 °C и собирайте супернатант для разделения плазмы.
    2. Aliquot 450 мкл плазменных образцов в пробирках с низким содержанием белка 0,5 мл и храните при -80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы человеческой плазмы собираются в соответствии с этическими нормами учреждения, и все участники получили информированное согласие.
      ВНИМАНИЕ: Человеческая плазма является биологически опасной. Держать его внутри шкафа для биобезопасности (BSC) с помощью перчаток, лабораторного халата и защитных очков. Утилизировать все материалы, содержащие плазму, в соответствии с институциональными нормативами по биобезопасности и утилизации отходов.

3. Формирование ПК

  1. Ручное обращение с жидкостями
    1. Определите оптимальное соотношение NP: плазмы, количественно измеряя концентрацию белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA) для корректировки разбавления плазмы.
    2. Добавьте 100 мкл NP-суспензии к 100 мкл плазмы для достижения желаемой концентрации в плазме.
    3. Инкубировать при 37 °C в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа BCA смешайте реагенты A и B (50:1), подготовьте стандартные разбавления BSA, добавьте образец 10-25 мкл/стандарт + реагент 200 мкл, инкубировать 30 минут при 37 °C и измерить поглощение на 562 нм. Концентрации в плазме обычно регулируются в диапазоне от 0,5% до 50% в зависимости от объёма NP, в зависимости от типа NP. Для ГО используйте более низкие концентрации (рекомендуется от 0,5% до 5%); для DOTAP/золотых NP используйте более высокие концентрации (до 50%). Используйте белковые трубки с низким уровнем связания 1,5 мл.
  2. Автоматизированный протокол инкубации
    1. Загрузите протокол программного обеспечения для обработки жидкости на автоматизированную платформу для пипетирования (головки 20 мкл + 200 мкл)
    2. Раздайте по 100 мкл каждого типа NP в трубки с низким уровнем связи 1,5 мл.
    3. Добавьте восстановленную плазму, приготовленную как в 2.1 и 2.2, по следующей формуле:
      где VNP — это объём подвески NP. Для 100 мкл NP:
      figure-protocol-1
      5%: 5,3 мкл HP
      20%: 25 мкл HP
      50%: 100 мкл HP
    4. Добавьте сверхчистую воду, чтобы достичь 200 мкл:
      5%: 94,7 мкл
      20%: 75 мкл
      50%: нет
    5. Микс-сэмплы:
      5%: 15 мкл циклов
      20%: циклы 50 мкл
      50%: 100 мкл циклов 3.2.6. Инкубировать при 37 °C в течение 1 часа
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный рисунок 1 иллюстрирует графический интерфейс автоматизированной установки, используемой для приготовления смесей NP-HP при трёх конечных концентрациях плазмы (5%, 20% и 50% v/v), каждая в тройном экземпляре. Планировка палубы включает стойки для насадки, резервуар для отходов и стойку для труб с низким уровнем связывания 3 × 4, содержащий NP-подвески (GO, золотые наносферы и липосомы DOTAP) (NP), HP и ультрачистую воду (H2O). Используйте белковые трубки с низким уровнем связывания.

4. Анализ ПК от SDS-PAGE

  1. Изоляция ПК
    1. Центрифугуйте образцы NP-HP при 18 620 x g, 4 °C в течение 15 минут. На дне трубки должна быть видимая гранула. Аккуратно отбросьте супернатант, который должен выглядеть прозрачным перед продолжением (см. дополнительный рисунок 2).
    2. Промой гранулы 200 мкл ультрачистой водой, снова суспенируй и снова центрифугируй. Повторите этот шаг дважды. После окончательной промывки компактная гранула должна оставаться видимой, подтверждая успешное выделение NP-белковых комплексов (см. дополнительный рисунок 2).
    3. Подготовьте буфер нагрузки (LB):
    4. Рассчитайте общий объём LB на основе состояния плазмы и смеси восстановительного агента (1:10), буферного денатурирования белков образца SDS (1:2) и воды.
    5. Суспензируйте гранулы в соответствующем объёме 1x lb и кипятите при 100 °C в течение 10 минут.
    6. Центрифуга при 18 620 x г, 4 °C в течение 15 минут. Забери супернатант.
  2. Загрузка примера SDS-PAGE
    1. Подготовьте лестницу, разбавляя стандарт молярного веса (MW) с буфером нагрузки.
    2. Разбавьте буфер 10x Tris/Glycine/SDS до 1 раза.
    3. Собрать камеру электрофореза с помощью геля без пятен 4%-20% и добавить буфер до достижения рекомендованного производителя уровня.
    4. Загрузите образцы 10 мкл и лестницу 7 мкл в каждую яму. Используйте гель при 150 В в течение ~90 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объём LB следует рассчитывать на основе концентрации в плазме, выбранной в статье 3.1.1, чтобы обеспечить оптимальную визуализацию белков на гелевом изображении (обычно 10 мкг белков на 20 мкл фунтов).
      ВНИМАНИЕ: Для оптимальной воспроизводимости проведите анализ SDS-PAGE с использованием свежеприготовленных образцов NP-плазмы. Хранение промытых гранул при -80 °C в течение 24 часов приводило к заметным изменениям как физико-химических свойств (после измерения ресуспензии и измерения DLS/зета-потенциала), так и отпечатков белковых корон (при обработке гранул, начиная с шага 4.3.1 протокола; см. дополнительный рисунок 3).

5. Анализ белковых паттернов

  1. Обработка изображений
    1. Гели для изображения используются с помощью хемилюминесцентного имиджера.
    2. Обработайте изображение геля следующим образом:
      1. Импортируйте изображение геля и сохраняйте его в виде TIFF-файла, исправьте его на наличие нежелательных эффектов, например, искажений косых полос, особенно затрагивающих периферийные линии. Обнаружить все гелевые линии. Вычтите фоновый сигнал из изображения.
      2. Калибруйте вертикальные перемещения, преобразуя пиксельные единицы в единицы молекулярной массы на основе экспоненциальной подгонки двухчленной полосы маркера. Генерируйте графические выходы для визуализации профилей интенсивности и распределения сигналов, специфичных для каждой полосы.
    3. Экспортировать обработанные данные, то есть вычисленные одномерные профили.
    4. Вычислите распределения молекулярного веса, нормализуя профили, и рассчитывайте интегральные площади по нужным диапазонам MW для каждой полосы.
    5. Экспортировать выходные данные, то есть интегральные области в указанных диапазонах молекулярной массы.
  2. Многомерный анализ для диагностики
    1. Применять линейный дискриминантный анализ (LDA) или другие многомерные методы для классификационного анализа.
    2. Рассчитайте точность, чувствительность, специфичность и проведите анализ ROC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые скрипты, используемые для обработки изображений, нормализации профилей, подгонки и классификации, доступны с27 года, где также предоставляется соответствующее руководство пользователя.
      ВНИМАНИЕ: Соблюдайте протоколы биобезопасности при работе с человеческой плазмой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Одной из основных задач стандартизации экспериментов на ПК является минимизация технической и операторно-зависимой вариабельности, как ранее было отмечено в этомисследовании 26. Остаются открытые вопросы относительно влияния экспериментальных переменных, таких как смещение оператора, и влияния автоматизированных инструментов навоспроизводимость 18,28.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Универсальность и воспроизводимость методов между типами NP

Представленный здесь протокол обеспечивает стандартизированный и воспроизводимый рабочий процесс для изоляции и характеристики ПК, сформированного на NP при инкубации с HP. Как показано в предыдущих и текущихисследованиях 33, метод позволяет создавать молекулярные отпечатки на основе SDS-PAGE, которые фиксируют биологически и диагностически значимые особенности...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Исследование частично финансировалось MUR, Национальным планом дополнительных инвестиций в NRRP, финансируемым Европейским союзом — NextGenerationEU, проектом «D3 4 HEALTH-Цифровая диагностика, прогнозы и терапия для устойчивого здравоохранения». PNC0000001, Спик 3 Linea tematica 2, миссия 4, компонент 2 CUP: B53C22006120001. Эта работа также была поддержана Фондом AIRC в рамках проекта IG 2020-ID. 24521, P.I. Поззи Даниэла.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 ML Белоковый LoBind TUBEЭппендорф22431081
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610732
ЦентрифугаLabortechnikZ 216 MK HermleИспользовался при 18 620 RCF в течение 20 минут при 4 градуса; C
Система визуализации ChemiDocБио-Рад12003153Используется для получения гелевого изображения
ХлороформСигма ОлдричC2432-1LРастворитель для DOTAP
Corning 1-200 & micro; Наконечники пипетов L Universal Fit Bulked PackedКорнинг4845
Criterion TGX без пятен из сборных гелейBiorad5678095
Дистиллированная вода 6 x 1LТермо Фишер15230001
ДОТАП (1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан)Avanti Polar Lipids890890P-200мгИспользуется для подготовки катионных липосом; растворяется в хлороформе, испаряется, гидратируется и экструдируется
Эндуро 300В блок питания и nbsp;Labnet E0303-230V
Считыватель микропластин GloMax DiscoverPromegaGM3000
Золотые наночастицы (цитрат-стабилизированные)Сигма-Олдрич742031-25MLИспользуется как наноматериал; Используется без дальнейшей очистки
Градиентный полиакриламидный гель (4– 20% TGX)Био-Рад5678095Используется для SDS– СТРАНИЦА
Grant Instrument  Термошейкер HC24N (24 микротрубки по 1,5 мл)Фишер СайентификPHMT-PSC24N
Раствор оксида графена (GO)ГрафенеяGO-4-1000Используется как наноматериал; разбавлены до 0,25 мг/мл и соникированы
Человеческая плазма (HP)Сигма-ОлдричP9523-5MLИспользуется для инкубации наночастиц
Программное обеспечение ImageLabBio-Rad. Версия 6.1.0.07/Используется для экспорта гелевого изображения в формате tiff-файлов
Буфер загрузки Laemmli 2xBiorad1610737Используется для повторного взвешивания пеллет
MATLABMathWorks. Версия R2022a/Используется для обработки изображений, анализа данных и вычисления профилей
Мини-экструдерAvanti Polar Lipids610020Используется для подготовки липосом
Образец редуцирующего агента NuPAGE (10 раз)Thermo ScientificNP004
Фосфатный солёный буферCorning 21-031-смИспользуется для сэмплав DOTAP-HP
Белковый анализ Pierce BCA, 1 комплект (1 л)ThermoFisher23225
Наконечники пипеты прозрачны 0,5-10ulAxygenТ-300-СТК
PIPETMAN L P10L, 0.5-10 и микро; L, металлический эжекторГилсонFA10002M
PIPETMAN P20, 2-20 и микро. L, металлический эжекторГилсонF144056M
PIPETMAN P200, 20-200 и микро; L, металлический эжекторГилсонF144058M
Автоматизированная система пипетирования PIPETMAXГилсонGSYS0021Используется для автоматизированной обработки образцов
Поликарбонатный фильтр (0.1 и микро; m)Avanti Polar Lipids610005-1EAИспользуется для экструзии липосом
Стандарты белка Precision Plus Protein All BlueBiorad1610373
Precision Plus Protein Unstained Standards Biorad1610363EDU
Vibra cell sonicator VC505Sonics and Materials Inc.VC505
ZetaSizerМалвернZS90Используется для измерений динамического рассеяния света (DLS) и микроэлектрофореза (ME)

Ссылки

  1. Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
  2. Caputo, D., et al. Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection. Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).
  3. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study. ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).
  4. Hajipour, M. J., et al. Personalized protein coronas: A "key" factor at the nanobiointerface. Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).
  5. Quagliarini, E., et al. Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection. Sens Int. 1, 100025(2020).
  6. Caracciolo, G., et al. Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients. Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).
  7. Barrán-Berdón, A. L., et al. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery. Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).
  8. Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation. Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).
  9. Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. Evolution of the nanoparticle corona. Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).
  10. Caputo, D., et al. A protein corona-enabled blood test for early cancer detection. Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).
  11. Pozzi, D., Caracciolo, G. Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).
  12. Vence, M. G., et al. Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles. Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).
  13. Di Domenico, M., et al. Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer. J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).
  14. Papi, M., et al. Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection. Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).
  15. Di Santo, R., et al. Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study. Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).
  16. Caputo, D., et al. Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer. Cancers. 13 (1), 93(2020).
  17. Colapicchioni, V., et al. Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients. Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).
  18. Di Santo, R., et al. Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients. Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).
  19. Digiacomo, L., et al. Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles. Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).
  20. Caputo, D., Caracciolo, G. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).
  21. Caracciolo, G., et al. Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology. Nano Today. 27, 6-10 (2019).
  22. Ashkarran, A. A., et al. Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities. Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).
  23. Pederzoli, F., et al. Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).
  24. Otoo, J. A., Schlappi, T. S. REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast. Biosensors. 12 (2), 124(2022).
  25. Papi, M., Caracciolo, G. Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection. Nano Today. 21, 14-17 (2018).
  26. Giulimondi, F., et al. Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results. Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).
  27. Renzi, S., et al. Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery. Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).
  28. Van Dorpe, S., et al. Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility. J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).
  29. Quagliarini, E., et al. The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics. J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).
  30. Jiříčková, A., et al. Synthesis and applications of graphene oxide. Materials. 15 (3), 920(2022).
  31. Saorin, A., et al. A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide. ACS Nanosci Au. , (2025).
  32. Digiacomo, L., et al. Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification. Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).
  33. Caputo, D., et al. Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study. Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).
  34. Quagliarini, E., et al. A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics. Nano Today. 47, 101657(2022).
  35. Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. Current applications of graphene oxide in nanomedicine. Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).
  36. Caputo, D., et al. Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins. Cancers. 14 (19), 4658(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BCA

Похожие статьи