Методическая статья

Трехмерная модель органоида опухоли, полученная пациентом для скрининга Т-клеток химерных рецепторов антигена in vitro

545 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69113

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол устанавливает модель ко-культуры in vitro с использованием опухолевых органоидов и клеток химерного антигенного рецептора T (CAR-T) для оценки специфической цитотоксичной активности клеток CAR-T против солидных опухолевых клеток.

Аннотация

Терапия клеточными клетками с помощью химерных антигенных рецепторов T (CAR-T) достигла впечатляющей клинической эффективности при гематологических злокачественных опухолях, однако терапия CAR-T-клеточными клетками при солидных опухолях всё ещё требует дальнейшей разработки. Опухолевые органоиды, полученные от пациентов, являются моделями in vitro заболеваний, сохраняющими гетерогенность пациентов и использовались для проверки эффективности и безопасности химиотерапии и таргетных препаратов. Этот метод описывает модель тестирования эффективности in vitro при сокультурировании опухолевых органоидов с клетками CAR-T. Образцы колоректального рака у пациентов конструируются в органоиды опухолей с трёхмерной (3D) структурой в матриксе базальной мембраны. Опухолевые органоиды могут стабильно расти и постоянно проходить через них. Зрелые опухолевые органоиды отделяются от матрица путём промывания и центрифуга, а CAR-T-клетки добавляются с разным соотношением эффектора к цели (E:T) для формирования системы иммунно-органоидной кокультуры. Через 6–24 часа морфология и межклеточные структуры органоидов наблюдаются с помощью яркополевой визуализации. В этом эксперименте также проводится окрашивание мёртвых клеток в системе кокультуры, что может отражать жизнеспособность органоидов и оценивать цитотоксическое воздействие CAR-T-клеток на опухолевые органоиды. Этот эксперимент позволяет эффективно наблюдать взаимодействие между клетками CAR-T и трёхмерными органоидами опухоли, а результаты могут быть использованы для оценки способности клеток CAR-T-клеток убивать опухоли.

Введение

Терапия клеточными клетками с помощью химерных антигенных рецепторов T (CAR-T) показала выдающийся клинический успех в лечении гематологическихзлокачественных опухолей. 1. Однако его применение в солидных опухолях остаётся ограниченным из-за ряда основных препятствий, включая гетерогенность опухолей и потерю антигена, физические и химические барьеры внутри опухолевой массы, а также иммуносупрессивную микросредуопухолей 2,3. Эти трудности способствуют ограниченной эффективности терапии CAR-T-клетками в условиях солидных опухолей.

Оценка эффективности CAR-T-клеток in vitro является критически важным этапом доклинической разработки. Наиболее часто используемые модели — это опухолевые клеточные линии, которые могут либо экспрессировать специфические с опухолями антигены, либо быть модифицированными для передачи репортерных генов, таких каклюцифераза 4,5. В результате результаты традиционных анализов на основе клеточных линий часто не предсказывают клинические исходы. Опухолевые модели, полученные от пациентов, предлагают перспективную альтернативу для более точной оценки функции CAR-T в контексте солидных опухолей.

Хотя несколько исследований начали использовать PDTO для оценки CAR-T-клеток, остаются проблемы с разработкой стандартизированных, надёжных и доступных протоколов совместной культуры, которые эффективно балансируют сохранение 3D-архитектуры опухоли с эффективным взаимодействием иммунной клетки и опухоли. Опухолевые органоиды (PDTO), полученные пациентами, — это трёхмерные (3D) модели экс-виво заболеваний, полученные из опухолевых тканей или клеток пациента. PDTO успешно установлены для широкого спектра типов опухолей, включая колоректальный, молочной железы, поджелудочной железы и рак легких. Эти структуры сохраняют гистологическую архитектуру, молекулярные профили и функциональную гетерогенность исходнойопухоли 6. Наряду с первичными опухолями и ксенотрансплантатами (PDX), PDTO представляют собой ценную платформу для моделирования специфических для пациента признаковзаболевания 7. По сравнению с традиционными опухолевыми клеточными линиями или первичными культурами, PDTO более точно воспроизводят опухолевую среду in vivo, демонстрируя сложный клеточный состав и структурнуюорганизацию 8. Они также сохраняют геномную стабильность и сохраняют паттерны экспрессии генов на протяжении длинных проходов, что позволяет более точно оценить терапевтическиеответы 9,10. PDTO успешно применяются в исследованиях биологии опухолей, скрининга лекарственных препаратов и прецизионной медицины, и всё больше признаются за свою полезность в тестировании иммунотерапии, включая выявление новых мишеней для CAR, оптимизацию конструкции CAR и оценкуцитотоксичности 6,11,12,13 . Распространённым ограничением культуры органоидов является её зависимость от компонентов внеклеточного матрикса (ECM), таких как Matrigel (далее — матрица базальной мембраны [BMM]) для поддержания 3D-структуры, что может затруднять проникновение иммунных клеток в совместных анализах. Для обеспечения согласованности и оптимального взаимодействия клеток в совместной культуре обычно выбираются органоиды в определённом размерном диапазоне (например, диаметр 100–200 мкм).

Этот протокол описывает платформу совместного выращивания для оценки цитотоксичности CAR-T-клеток с использованием PDTO, полученных от колоректального рака. Образцы опухолей пациентов ферментативно диссоциируются и культивируются в BMM для получения 3D-органоидов. После созревания и расширения органоиды одинакового размера изолируются и флуоресцентно маркуются. Они засеиваются в многоколодцевых пластинах и совместно культивируются с CAR-T-клетками при различных соотношениях эффектор-мишень (E:T). Ключевой особенностью такого подхода является целенаправленное удаление PDTO из BMM перед совместным культивированием, что обеспечивает прямой и беспрепятственный доступ CAR-T-клеток к опухолевых органоидам при сохранении их 3D-целостности в подвешенном состоянии. Через 24 часа микроскопия с ярким полем выявляет прогрессирующую дезинтеграцию PDTO, характеризующуюся нарушением 3D-морфологии, уменьшением опухолевых клеток и потерей жизнеспособности. Живоклеточная визуализация и флуоресцентная микроскопия дополнительно визуализируют взаимодействия между флуоресцентно маркированными CAR-T-клетками и опухолевыми мишенями. Для оценки цитотоксичности используются количественные анализы клеточной гибели. Эта органоидная иммунная кокультура предоставляет надёжную и индивидуальную для пациента платформу для оценки противоопухолевой эффективности CAR-T-клеток ex vivo, что позволяет терапевтически оптимизировать и поддерживать клиническую трансляцию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использовались органоиды, полученные пациентами с колоректальным раком. Фрагменты опухолевой ткани были получены у пациентов с гистологически подтверждённой первичной колоректальной аденокарциномой (КРК), не подготовившихся к лечению. Все ткани были получены из эндоскопических биопсийных образцов, собранных в ходе стандартных диагностических процедур в больнице Шэньчжэнь Цяньхай Шэкоу в зоне свободной торговли. Все донорские ткани были подтверждены как CRC посредством гистопатологического обследования институциональными патологами. Протокол следует институциональным рекомендациям. От всех пациентов были получены письменные информированные согласия. Исследование было одобрено Этическим комитетом больницы зоны свободной торговли Шэньчжэнь Цяньхай Шэкоу (2024KY-009-01K).

1. Культура PDTO

  1. Подготовка тканей
    1. Поместить фрагменты опухолевой ткани, полученные с помощью колоноскопической биопсии у пациентов с гистологически подтверждённой первичной колоректальной аденокарциномой (КРК), в стерильную трубку диаметром 50 мл.
    2. Добавьте 30 мл холодного раствора для промывки тканей, состоящего из сбалансированного соляного раствора Хэнкса (HBSS), 1% бычьей сыворотки альбумина (BSA), 100 U/mL пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, 50 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина B и 10 мкм ингибитора киназы Rho-ассоциированного (Y-27632).
    3. Положите тюбик на лёд и аккуратно покачивайте 5 минут, чтобы промыть салфетку.
    4. Повторите шаг 1.1.3. Ещё два раза с новым раствором для промывания салфеток.
  2. Переваривание тканей
    1. Отрежьте некротическую или жировую ткань и разрежьте опухоль на фрагменты ткани.
    2. Тёплая 8 мл среды для пищеварения (среда DMEM, 500 U/mL коллагеназы IV, 1,5 мг/мл коллагенази II, 20 мкг/мл гиалуронидазы, диспаза 0,1 мг/мл типа II, 10 мкм Y-27632 и 1% плодовой бычьей сыворотки) до 37 °C.
    3. Переместить фрагменты в буфер для пищеварения и инкубировать при 37 °C в водяной бане. Аккуратно покрутите трубку вручную в течение ~10 секунд каждые 5 минут, чтобы облегчить проникновение ферментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируйте объём буфера пищеварения в зависимости от размера блока ткани. Обычно 8-10 мл достаточно для эндоскопической биопсии.
    4. Наблюдайте под микроскопом через 15 минут, чтобы проверить статус диссоциации. Если фрагменты ткани остались, продолжайте пищеварение максимум до 30 минут.
    5. Когда видны скопления, аккуратно (5-10 раз) используйте пипетку объёмом 10 мл для механической диссоциации. Центрифугу при 350 × г в течение 5 минут.
    6. Отбросить супернатант; Ресуспензировать гранулы в 10 мл раствора для промывки и центрифугу при 350 × г в течение 5 минут. Повторяйте стирку дважды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PDTO обычно начинали формировать компактные сферические структуры в течение 3-5 дней после посевывания. Органоиды демонстрировали устойчивое пролиферирование и достигали подходящего размера для экспериментов (примерно 100–200 мкм в диаметре) к 10-14 дням. Пассирование проводилось каждые 7-10 дней для поддержания здорового роста и предотвращения пересечения или центрального некроза. Обычно на каждую биопсию используется буфер для пищеварения 8-10 мл (фрагменты 2 мм³), обеспечивая концентрацию TrypLE Express в конечной рабочей концентрации 1×.

2. Конструкция PDTO

  1. Вложение матриц
    1. Поместите 200 мкл BMM (предварительно охлаждённого при 4 °C) в чистую трубку и пипетируйте ячеточную гранулу вверх-вниз не менее 10-15 раз с помощью предварительно охлаждённого кончика пипетки, пока суспензия не станет однородной, без видимых комков.
    2. Впустите примерно 30 мкл капель в каждую яме пластины на 24 лунки. Инкубировать при 37 °C в течение 10 минут, чтобы затвердеть.
    3. Добавьте 500 мкл органоидной культурной среды (продвинутая среда DMEM/F12, содержащая 50 мкг/мл R-спондина 1, 10 мкг/мл Ноггин, 500 мкг/мл EGF, 100x HEPES, 100x глутамакс, 500x нормоцина, 500x гентамицина/амфотерицина B, 50x N2, 100x B27, 500 мМ н-ацетилцистеина, 1 млн ниацинамид, 5 мМ ингибитора алькового 4/5/7, ингибитора p38 30 М, 100 мкм гастрина, и 100 мкм простагландина E2) на одну скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте примерно 30 мкл BMM на каплю; Корректируйте в зависимости от плотности клеток.
  2. Содержание культуры
    1. Выращивание органоидов при 37 °C с 5%CO2; Меняйте среду каждые 3 дня.
    2. Ежедневно следите за формированием органоидов. Ожидайте появления мелких сфероидов к третьему дню.
    3. Оцените успешное формирование органоидов в течение 6-10 дней. Время образования (от 3 до 14 дней) зависит от жизнеспособности ткани и её ствола.

3. Передача PDTO

  1. Деагрегация
    1. Заранее охладите центрифугу до 4°C. Снимите среду и добавьте 1 мл ледяного HBSS и аккуратно нанесите пипетку 3-5 раз, чтобы нарушить BMM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо выросшие органоиды можно наблюдать невооружённым глазом в виде маленьких белых точек.
    2. Переместите подвеску в стерильную трубку объёмом 15 мл и центрифугу при 350 × г на 5 минут.
  2. Ферментная диссоциация
    1. Отбросьте супернатант и добавьте 1 мл TrypLE. Поместите его в водяную ванну при 37 °C на 2 минуты.
    2. Добавьте 2 мл HBSS для нейтрализации TrypLE; центрифуга при 350 × г в течение 5 минут.
    3. Удалите супернатант и снова суспендуйте в 2 мл HBSS. Снова центрифугу при 350 × г в течение 5 минут.
  3. Повторное встраивание
    1. Добавьте свежий BMM в гранулу в соотношении 1:3-1:6 (органоидные гранулы: BMM, v/v); Аккуратно подвесьте. Каждая капля содержит примерно 30 мкл конечного объёма. Поместить капли в новую пластину на 24 лунки; инкубировать при 37 °C в течение 10 минут.
    2. Добавьте 500 мкл посевной среды в каждую скважину и инкубуйте при 37 °C с 5%CO2.
    3. Проверяйте колодцы ежедневно; наблюдать 3D-сборку примерно за 48 часов.
    4. После 3-5 пассажей выберите здоровые органоиды для дальнейших анализов или криоконсервации.

4. Совместная культура CAR-T-клеток и PDTO

  1. Приготовление среды на основе ко-культуры
    1. Дополните базовую органоидную культурную среду 10 нг/л IL-2 и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола для поддержки жизнеспособности CAR-T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая среда поддерживает 3D-структуру и жизнеспособность PDTO.
  2. Подготовка к PDTO
    1. Удалите капли BMM с зрелыми PDTO (например, на 4-6 день) из посевной пластины с помощью стерильного скребка или наконечника пипетки.
    2. Переложите смесь BMM/PDTO в коническую трубку объемом 15 мл.
    3. Добавьте в пробирку 5-10 мл ледяного раствора HBBS или раствора для промывания салфеток (как описано в шаге 1.1.2). Аккуратно инвертируйте 5-10 раз, чтобы вывести органоиды из BMM.
    4. Дайте смеси постоять на льду 5 минут. BMM станет ликвидным, а диссоциированные PDTO останутся в приостановке.
    5. Аккуратно аспирируйте супернатант, содержащий BMM, оставляя PDTO-гранулу позади. Избегайте беспокойства гранулы.
    6. Повторите шаги 4.2.3–4.2.5 ещё два раза, чтобы полностью удалить BMM.
    7. После финальной промывки соберите супернатант с PDTO и центрифугу при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    8. Аспирируйте супернатант и ресуспензируйте гранулу PDTO в 1-2 мл органоидной культурной среды или ко-культурной среде.
    9. (Необязательно для счёта) Подготовьте подвеску на одну ячейку.
      1. Если требуется точный подсчёт, перенесите повторно суспензированные органоиды в новую трубку и инкубируемые с предварительно нагретым TrypLE Express при 37 °C в течение 3-5 минут, после чего проводите мягкую пипетацию для достижения суспензии с одной ячейкой. Продолжайте подсчёт клеток (например, с помощью гемоцитометра или автоматического счётчика клеток).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап расщепляет органоиды и предназначен только для подсчёта перед повторным покрытием.
    10. Выбор и стандартизация размера: Для обеспечения единого размера органоидов для совместного выращивания пропустите суспензионные PDTO (начиная с шага 4.2.8) через 70-мкм-клеточное сито, установленное поверх конической трубки объёмом 50 мл. Этот этап удаляет крупные органоидные агрегаты и мусор, представляя собой стандартизированную долю размера, подходящую для равномерного совместного выращивания.
    11. Центрифугуйте стандартизированную органоидную подвеску при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    12. Аспирируйте супернатант и повторно подвесьте стандартизированные PDTO в соответствующем объёме предварительно нагретой кокультурной среды.
    13. Считайте стандартизированные PDTO (например, используя гемоцитометр под микроскопом, считая количество органоидов на поле).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчёт основан на номере органоидов, а не по номеру ячейки.
    14. Посеять стандартизированные PDTO в нужную многоколодную пластину (например, пластину с U-дном на 96 лунок) по целевому номеру на скважину.
    15. Добавляйте CAR-T-клетки в скважины при желаемом соотношении эффектора к целевой (E:T).
  3. Маркировка PDTO
    1. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C. Аспирировать среду; Добавьте 1 мл HBSS, чтобы убрать капли.
    2. Перенесите в центрифугную трубку на 15 мл, добавьте 4 мл HBSS и аккуратно нанесите пипетку. Центрифугу при 350 × г в течение 5 минут.
    3. Сбросьте супернатант, добавьте 5 мл HBSS и аккуратно пипетить. Снова центрифугуйте при 350 × г в течение 5 минут.
    4. Подготовьте рабочее решение Hoechst 33342.
    5. Ресуспензировать гранулы в растворе Hoechst 33342 1 мл (конечная концентрация 5 мкг/мл). Аккуратно перемешайте инверсией 3-5 раз, чтобы обеспечить равномерное проникновение красителя. Защитите от света, обмотав трубку алюминиевой фольгой. Инкубировать при 37 °C в течение 10 минут. После окрашивания дважды стирайте с помощью HBSS, чтобы удалить лишний краситель.
  4. Обшивка PDTO
    1. Оценить плотность органоидов при соотношении гель-капель к скважине 1:5; ресуспензия в кокультурной среде примерно 1 × 103 органоидов/мл.
    2. Добавьте 100 мкл на каждую скважину в пластину на 96 луц; включать не менее тройных вариантов на каждое условие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе не проводите подсчёт ячеек; Органоиды остаются целыми.
  5. Ко-культура CAR-T
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол направлен на совместное выращивание и оценку эффективности CAR-T-клеток с помощью PDTO. Генерация и характеристика CAR-T-клеток, использованных в этом исследовании, описаны в разделе 8.
    1. Собирайте CAR-T-клетки в логарифмической фазе. Покрасьте Trypan Blue для подтверждения жизнеспособности >95%.
    2. Центрифугные ячейки при 350 × г в течение 5 минут; Повторная суспензия в ко-культурной среде.
    3. Отрегулируйте концентрацию на 4 × 106/мл, 2 × 106/мл и 1 ×10 6/мл.
    4. Добавьте 100 мкл подвески CAR-T на каждую скважину согласно экспериментальной конструкции. Добавьте 100 мкл среды для контроля скважин.
    5. Инкубировать пластину при 37 °C, 5%CO2 в течение 6-24 часов.

5. Окрашивание мёртвых клеток

  1. Зелёная окраска SYTOX
    1. Для каждых 1 ×10 5 ячеек подготовьте 100 мкл раствора окрашивания Nuclear Green, разбавляя 1 мкл SYTOX Green (1000x) в 1 мл буфера для анализа.
    2. В 6- и 24-часовые периоды совместного выращивания добавьте 100 мкл раствора SYTOX Green на каждую скважину. Инкубировать при 37 °C в течение 20 минут в темноте.

6. Получение изображений

  1. Аспирируйте супернатант и добавьте 100 мкл DMEM/F12.
  2. Захват ярких и флуоресцентных изображений с помощью микроскопа (например, конфокальных):
    Hoechst 33342 (PDTO): возбуждение (Ex)/излучение (Em) = 350 нм/461 нм
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 нм/610 нм
    SYTOX Green (мёртвые клетки): Ex/Em = 504 нм/528 нм
  3. Захватывайте как минимум тройные изображения на каждую скважину, сосредотачиваясь на центральном поле.

7. Анализ данных

  1. Запустить ImageJ (версия 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); импортировать изображения канала SYTOX Green. Вручную установите порог для различия флуоресцентных сигналов от фона (изображение > Adjust > Threshold).
  2. Используйте функцию Analyze > Measure для расчёта интегрированной плотности. Экспортировать данные как .csv для последующего статистического анализа в соответствующем программном обеспечении для статистического анализа (например, GraphPad Prism).
  3. Установите порог для отделения флуоресцентных сигналов от фона.
  4. Выберите всё поле; run Analyze > Measure для вычисления суммарной интенсивности флуоресцентного сигнала.
  5. Экспортировать данные и проводить статистический анализ для сравнения обработанного и контролируемого в течение 24 часов.

8. Генерация и характеристика клеток CAR-T

  1. Конструкция конструкции CAR
    ПРИМЕЧАНИЕ: CAR-T-клетки, используемые в этом исследовании, нацелены на B7-H3 (кодируемого геном CD276), антиген, часто переэкспрессируемый при колоректальномраке 14. Конструкция CAR состоит из:
    Внеклелярный домен: Одноцепочечный переменный фрагмент (scFv), полученный из моноклонального антитела против клона B7-H3 376.96.
    Шарнирный и трансмембранный домен: шарнирный и трансмембранный домен CD8α.
    Костимулирующий домен: человек CD28.
    Домен сигнализации: человек CD3ζ.
  2. Генерация CAR-T-клеток
    1. Изоляция: Изолировать периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) из здоровых донорских буффи-оболочек с помощью центрифугирования плотностиФиколла-Пака 14.
    2. Активация: Активировать человеческие PBMC антителами к пластинчатой связи против CD3/CD28 в течение 48 часов в Т-клеточной среде с добавлением 10 нг/мл IL-7 и 5 нг/мл IL-15. Подготовьте Т-клеточную среду, смешивая равные объемы (по 250 мл каждая) RPMI 1640 и Click's Media, а также дополняйте 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS), 1x GlutaMAX и 1% пенициллин-стрептомицином (Pen/Streprep).
    3. Трансдукция: Трансдуцировать активированные Т-клетки ретровирусным супернатантом с помощью пластины, покрытой ретронектином, как описано выше15.
    4. Расширение: Собирать и культивировать Т-клетки через 3 дня после трансдукции в полной человеческой Т-клеточной среде, содержащей IL-7 и IL-15, в течение дополнительных 7-9 дней до характеристики и проведения функциональных анализов.
  3. Характеристика клеток CAR-T
    1. Экспрессия CAR: Оценить экспрессию CAR через 5–7 дней после трансдукции с помощью потоковой цитометрии с использованием рекомбинантного белка B7-H3-Fc, а затем флуоресцентно маркированного вторичного антитела против человеческого Fc14. Типичная эффективность трансдукции (CAR+ элементы) варьируется от 80% до 90%.
    2. Фенотип: Характеризуйте подмножества Т-клеток (например, CD4+, CD8+ и др.) с помощью проточной цитометрии с использованием антител против CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7 идр. 14.
    3. Функциональная валидация (необязательная пред-ко-культура): Перед проведением экспериментов с совместной культурой валидируйте CAR-T-клетки функционально, сокультивируя с B7-H3-положительными и B7-H3-отрицательными целевые клеточные линии и измеряя высвобождение цитокинов (например, IFN-γ с ELISA) или цитотоксичность (например, с помощью проточнойцитометрии 15).
  4. Подготовка к совместной культуре (PDTO Assay)
    1. Используйте CAR-T-клетки для совместной культуры во время их лог-фазового расширения (обычно между 10-14 днями после активации). Перед использованием промыйте клетки дважды HBSS, чтобы удалить IL-7/IL-15, и снова суспензировать их в среде для совместной культуры, описанной на шаге 4.1.
    2. Подтвердите жизнеспособность >95% с помощью окраски Trypan Blue.
    3. Визуальные контрольные точки: проверьте наличие небольших сферических скоплений (50-100 мкм) на 3-5 день и зрелых сфероидов (100-200 мкм) на 10-14 днях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Органоиды колоректального рака были успешно получены из эндоскопических биопсийных образцов (Рисунок 1), при этом идентичность опухоли была подтверждена патологическим диагнозом (Рисунок 2). Фрагменты опухоли, культивируемые в BMM, начали формировать трёхмерные структуры в течение 24 часов. Органоиды первого поколения (P0) проходили в период с 7 по 14 день. Органоиды обладали разнообразными морфологиями, включая сферические, кис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье представлен метод оценки цитотоксического эффекта CAR-T-клеток на PDTO, сочетая яркополевые изображения и флуоресцентное окрашивание для оценки жизнеспособности органоидов. Этот двухмодальный подход позволяет надёжно визуализировать гибель опухолевых клеток в 3D-модельной системе и обеспечивает полуколичественную оценку цитотоксичности CAR-T.

Ключевым элементом этого протокола является культурная среда. Поскольку CAR-T-клетки и опухолевые органои...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), Научно-техническим проектом в Наньшаньской медицинской и медицинской системе (NSZD2024046, NS2024105) и Шэньчжэньским медицинским исследовательским фондом (D2401023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трубка объёмом 15 млСЕЙНИНГ3030100
24-колодцевая пластинаКОРНИНГ3524
Трубка объемом 50 млСЕЙНИНГ3030000
96-колодцевая пластинаКОРНИНГ3599
Продвинутый DMEM/F12GibcoC11330500BT
Ингибитор Alk 4/5/7MCEHY-10432 
B27Gibco17504044
Шкаф биобезопасности (класс II)Термо ФишерН/Д
Бычий сывороточный альбуминСигма ОлдричA9056
Антенна для клеточной культурыBIOFILTCD010060
ЦентрифугаЭппендорф5810R
Медиа Click'sFUJI FILM9195
CO2-инкубаторЯматаIP610
Коллагеназа IISolarbioC8150
Коллагеназа IVСигма ОлдричC9407
Конфокальный лазерный микроскопZeissLSM900
Криоконсервативная средаЗЕНОАКCELLBANKERTM2
Буфер пищеваренияРеагенты подготовлены внутри компанииН/ДКомпозиция, представленная в рукописи
Digital ShakerMIULABHS-25
Диспейз типа IIСигма-олдрихD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads Человеческий Т-активатор CD3/CD28Термо Фишер11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Сыворотка плода крупного рогатого скотаGibco1631389
ГастринGlpBioGA20228
Гентамицин/амфотеритин BGibcoR0151
ГлутамаксGibco35050061
Сбалансированный сольный раствор ХэнксаGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342 BeyotimeC1027
ГиалуронидазаSolarbioh8030
ИЛ-15Peprotech200-15-10UG
IL-2НовопротеинCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (с открытым исходным кодом)https://imagej.nih.gov/ij/
Инвертированный  флуоресцентный микроскопMshotMF52-N
МатригельКорнинг356231
N2Gibco17502048
n-ацетилцистеинСигма ОлдричA7250-5G
НиацинамидСигма ОлдричN0636-100G
НоггинPeproTech120-10C-20
НормоцинInvivoGenANT-NR-1
Органоидная культурная средаРеагенты подготовлены внутри компанииН/ДКомпозиция, представленная в рукописи
Ингибитор p38MCEHY-10295 
Пенициллин-стрептомияGibco15140122
Простагландин E2MCEHY-101952 
Ингибитор киназ, ассоциированный с Rho&nsp;Стволовые клетки72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
Наполнители для пипеток S1Thermo Scientific9501
Серологический пипеттBIOFILGSP-010-050
Одноканальная пипеткаЭппендорф3123000063
Одноканальная пипеткаЭппендорф3123000055
Одноканальная пипеткаЭппендорф3123000098
Одноканальная пипеткаЭппендорф3123000022
Стерильные одноразовые скальпелиTech-SSSD10
SYTOX GreenBeyotimeC1181S
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196
Водяной бак с термостатомБлюпардBWS-10
Trypan BlueФайджинPH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
&бета;-меркаптоэтанолGibco21985023

Ссылки

  1. Lu, J., Jiang, G. The journey of CAR-T therapy in hematological malignancies. Mol Cancer. 21 (1), 194(2022).
  2. Maalej, K. M., et al. CAR-cell therapy in the era of solid tumor treatment: Current challenges and emerging therapeutic advances. Mol Cancer. 22 (1), 20(2023).
  3. Albelda, S. M. CAR T cell therapy for patients with solid tumours: Key lessons to learn and unlearn. Nat Rev Clin Oncol. 21 (1), 47-66 (2024).
  4. Shi, H., et al. IL-15 armoring enhances the antitumor efficacy of claudin 18.2-targeting CAR-T cells in syngeneic mouse tumor models. Front Immunol. 14, 1165404(2023).
  5. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  6. Qu, S., et al. Patient-derived organoids in human cancer: A platform for fundamental research and precision medicine. Mol Biomed. 5 (1), 6(2024).
  7. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
  8. Qu, J., Kalyani, F. S., Liu, L., Cheng, T., Chen, L. Tumor organoids: Synergistic applications, current challenges, and future prospects in cancer therapy. Cancer Commun. 41 (12), 1331-1353 (2021).
  9. Mo, S., et al. Patient-derived organoids from colorectal cancer with paired liver metastasis reveal tumor heterogeneity and predict response to chemotherapy. Adv Sci. 9 (31), 2204097(2022).
  10. Nam, C., Ziman, B., Sheth, M., Zhao, H., Lin, D. -C. Genomic and epigenomic characterization of tumor organoid models. Cancers. 14 (17), 4090(2022).
  11. Taurin, S., et al. Patient-derived tumor organoids: A preclinical platform for personalized cancer therapy. Transl Oncol. 51, 102226(2025).
  12. Tao, B., et al. Organoid-guided precision medicine: From bench to bedside. MedComm. 6 (5), e70195(2025).
  13. Ning, R. -X., et al. Application status and optimization suggestions of tumor organoids and CAR-T cell co-culture models. Cancer Cell Int. 24 (1), 98(2024).
  14. Du, H., et al. Antitumor responses in the absence of toxicity in solid tumors by targeting B7-H3 via chimeric antigen receptor T cells. Cancer Cell. 35 (2), 221-237.e8 (2019).
  15. Sun, S., et al. Preclinical evaluation of antitumor activity and toxicity of TROP2-specific CAR-T cells for treatment of triple-negative breast cancer. J Immunother Cancer. 13 (9), e012442(2025).
  16. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 38 (12), e100928(2019).
  17. Zou, F., et al. The CD39+ HBV surface protein-targeted CAR-T and personalized tumor-reactive CD8+ T cells exhibit potent anti-HCC activity. Mol Ther. 29 (5), 1794-1807 (2021).
  18. Yu, L., et al. Patient-derived organoids of bladder cancer recapitulate antigen expression profiles and serve as a personal evaluation model for CAR-T cells in vitro. Clin Transl Immunol. 10 (2), e1248(2021).
  19. Wang, X., et al. Dynamic profiling of antitumor activity of CAR T cells using micropatterned tumor arrays. Adv Sci. 6 (23), 1901829(2019).
  20. Dekkers, J. F., et al. Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nat Biotechnol. 41 (1), 60-69 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CAR T

Похожие статьи