Методическая статья

Стратифицированная геномная структура прогнозирования серотипов сальмонеллы : оценка MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S и SISTR на юго-западе Китая

503 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69117

⸱

9 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол устанавливает стратифицированный геномный рабочий процесс для прогнозирования серотипов сальмонеллы , используя MLST или SeqSero2S для рутинного наблюдения, SISTR с основным геномом MLST для обнаружения вспышек и SeqSero2S для быстрого скрининга. Протокол был подтверждён с помощью многоцентрового анализа для усиления наблюдения в Китае.

Аннотация

Точная серотипизация сальмонеллы необходима для эффективного наблюдения и расследования вспышек, поскольку разнообразие серотипов напрямую влияет на патогенность и оценку рисков для общественного здоровья. Однако традиционные методы агглютинации слайдов ограничены низкой воспроизводимостью, трудоёмкостью и высокими затратами, что мешает их применению в высокопроизводительных программах мониторинга. Для устранения этих ограничений мы разработали и валидировали геномный рабочий процесс, интегрировавший Multilocus Sequence Typing (MLST), Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR), SeqSero, SeqSero2 и SeqSero2S для прогнозирования серотипов с использованием данных секвенирования всего генома. Этот протокол был оценён с помощью многоцентрового анализа 315 изолятов сальмонеллы , собранных из пищевых и человеческих источников на юго-западе Китая. Результаты этого исследования показали значительно более высокую согласованность геномных подходов (до 100%/99,1%/90,1% в обучающей группе и 100%/97,1%/93,1% в валидационном наборе SISTR/MLST/SeqSero2S соответственно) по сравнению с традиционным серотипированием. Рабочий процесс включает рекомендации по выбору подходящих методов прогнозирования на основе контекста наблюдения, с акцентом на MLST и SeqSero2S для рутинного мониторинга, SeqSero2S для быстрого скрининга и SISTR с основным геномом MLST для расследования вспышек. Этот подход способствует интеграции геномной серотипизации в практику общественного здравоохранения, снижая зависимость от традиционной серологии и улучшая воспроизводимость и масштабируемость в программах мониторинга сальмонеллы .

Введение

Сальмонелла является одним из самых значимых пищевых патогенов в мире, вызывая значительную заболеваемость исмертность 1,2. В Китае он остаётся ведущей причиной пищевых заболеваний, при этом ограниченное число серотипов составляет большинствоинфекций. 3. Точная идентификация серотипов имеет решающее значение для наблюдения и расследования вспышек, поскольку разнообразие серотипов тесно связано с патогенностью и риском для общественного здоровья. Это хорошо известно в распространённых серотипах, таких как Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium, но некоторые менее изученные серотипы, такие как Salmonella Panama, также являются значительной причиной глобального распространения и инвазивных заболеваний4, что подчеркивает общую необходимость надёжных возможностей серотипирования. Традиционные методы серотипизации, долгое время признанные золотым стандартом, являются трудоёмким и дорогостоящим процессом, требующим более 150антисывороток 5. Они дополнительно ограничены низкойвоспроизводимостью 6, трудоёмкими рабочимипроцессами 7 и присущей изменчивостью из-за субъективной интерпретации агглютинационныхреакций 8, что делает их недостаточными для высокопроизводительных мониторинговыхпрограмм 9.

Появление секвенирования целого генома (WGS) изменило характеристику патогенов, позволив быстрое и высокоразрешающее предсказание серотипов 10,11,12. Были разработаны несколько инструментов in silico, включая Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15 и Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15. В то время как MLST предлагает стандартизированное долгосрочное эпидемиологическоеотслеживание 16, SeqSero2 и SeqSero2S позволяют прямой анализ исходных данных и способствуют высокопроизводительному скринингу распространённых серотипов 14,15. В то же время SISTR требует собранных геномов, но интегрирует обнаружение генов антигена с типированием последовательностей основного генома (cgMLST), обеспечивая комплексное решение для исследований вспышек17. Хотя характеристика сальмонеллы на основе WGS всё чаще используется в качестве основного доказательствав исследованиях 16,18,19, её применение в масштабном наблюдении остаётся ограниченным, что частично объясняется нерешёнными практическими факторами, влияющими на пригодность методов. Глобальный опрос показал, что только 8% участвующих лабораторий используют WGS для рутинного наблюдения, при этом аналитическая сложность является главнымбарьером 20. Например, надежное предсказание серотипов зависит от достаточной глубины секвенирования (обычно >75× для экономической эффективности, желательно ~200× для высококачественного анализа) и высококачественных геномных сборок (N50 контингов > 30 кбит/с как минимальный экономический минимум, желательно >100 кбит), особенно для инструментов, зависящих от сборки, таких как SISTR 21,22,23. Кроме того, выбор инструментов должен соответствовать вычислительным ресурсам и экспертизе лаборатории: открытые инструменты, такие как SeqSero2S, предлагают более быстрые альтернативы для быстрого скрининга, анализируя исходные считывания и обходя вычислительно трудоёмкийсборку 15, тогда как лаборатории с ограниченными биоинформатическими возможностями могут испытывать трудности с анализом и хранением данных. В результате данных недостаточно, чтобы определить, можно ли сократить серологическое тестирование вмасштабном нагляде 20,24, что подчёркивает необходимость подходов, адаптированных к ресурсам. В частности, после пандемии COVID-19 существует значительное количество инструментов для секвенирования и qPCR на различных уровнях медицинских учреждений, что открывает возможность перепрофилировать эти возможности для геномного наблюдения.

Чтобы восполнить этот пробел, мы провели многоцентровую оценку вышеупомянутых инструментов геномной серотипизации с использованием 315 изолятов сальмонеллы, собранных из пищевых и человеческих источников на юго-западеКитая 25,26. На основе этих результатов мы разработали стратифицированный рабочий процесс, учитывающий различные лабораторные ресурсы и потребности в мониторинге, предоставляя чёткие критерии выбора инструментов в разных контекстах. Эта структура уделяет приоритет SeqSero2S для быстрого скрининга и SISTR в сочетании с cgMLST для расследования вспышек, что способствует внедрению геномных подходов и снижает зависимость от традиционных методов серотипирования. Здесь мы подробно описываем каждый этап рабочего процесса, включая идентификацию изолятов, секвенирование, анализ данных и критерии выбора инструментов прогнозирования в различных контекстах наблюдения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Сбор и обработка образцов фекалий человека проводились по утверждению Этического комитета Четвёртой западно-китайской больницы Сычуаньского университета (номер протокола: HXSY-EC-2022093) в соответствии с Хельсинкской декларацией и хорошей клинической практикой. Информированное согласие было отменено в соответствии с национальными нормами общественного здравоохранения.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с живыми культурами сальмонеллы и образцами человеческих фекалий, должны проводиться в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2) персоналом, обученным стандартным микробиологическим практикам и процедурам биобезопасности. Всегда носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Регулярно дезинфицируйте и меняйте заражённые перчатки. Деконтаминировать все рабочие поверхности до и после экспериментов соответствующим дезинфицирующим средством (например, 70% этанола, 1% натрия гипохлорита). Деконтаминировать все жидкие и твердые отходы, содержащие биологические материалы, путём автоклава (например, при 121 °C не менее 30 минут) перед утилизацией. Избегайте образования аэрозолей и брызг. Выполняйте все процедуры, способные создавать аэрозоли (например, центрифугирование, интенсивное встряхивание) внутри сертифицированного биологического защитного шкафа.

1. Сбор образцов пищевых продуктов и идентификация штаммов

  1. Собирайте образцы пищи на розничных рынках или на перерабатывающих предприятиях. Изолировать сальмонеллу из образцов пищевых продуктов в соответствии с национальным стандартом безопасности пищевых продуктов GB 4789.4 и протоколами конфиденциальности Программы мониторинга пищевых заболеваний.
  2. Предварительное обогащение:
    1. Весите ровно 25 г каждого образца пищи. Добавьте 225 мл буферной пептонной воды (BPW) в образец (коэффициент разбавления 1:10) и используйте вихрь в течение 30 секунд для полной гомогенизации и погружения.
    2. Инкубировать образец в BPW при 36°C ± 1°C в течение 8-18 часов в встряхивающем инкубаторе, установленном на 150 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное обогащение в неселективном бульоне значительно увеличивает нагрузку патогенов. Обращайтесь со всеми последующие материалами (контейнеры, пипетки и т.д.) как с очень заразными.
  3. Селективное обогащение: после предварительного обогащения пересадите 1 мл образца в тетратионатный бульон (TTB). Инкубировать TTB при 42 °C в течение 18-24 часов без встряхивания.
  4. Изоляция: После инкубации обогатённую культуру разнесите на следующие селективные агарные пластины: Хектоенский энтериальный (HE) агар, ксилозный лизин дезоксихолат (XLD) агар и CHROMagar Salmonella . Инкубировать пластины при 36 °C в течение 18-24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нанесении полос на пластины будьте осторожны, чтобы избежать образования аэрозолей и перекрёстного загрязнения. На HE агаре предполагаемые колонии сальмонеллы обычно имеют сине-зелёный или синий цвет, с чёрными центрами или без. Окружающий агар может приобретать похожий зеленоватый оттенок. На агаре XLD предполагаемые колонии сальмонеллы обычно красные с чёрными центрами. На CHROMagar предполагаемые колонии сальмонеллы характеризуются их пурпурно-лиловым цветом, указанным производителем. На каждой селективной пластине ожидайте хорошо изолированные колонии через 18–24 часа инкубации. Заросшие пластины (>300 колоний) могут потребовать разведения и повторного нанесения полос.
  5. Идентификация: Проверьте пластины на предмет подозрений на колонии сальмонеллы . Идентифицировать подозреваемые штаммы с помощью автоматизированной системы идентификации с идентификационной картой Gram-negative (GN), следуя инструкциям производителя для анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что номера партий карт GN действительны и в пределах срока действия.
    1. Приготовьте бактериальную суспензию из чистой колонии до заданной мутности (стандарт Макфарланда 0,50-0,63) с использованием солевого раствора 0,45%.
    2. Загрузите подвеску в GN-карту и проведите тест. Убедитесь, что система настроена на автоматическую инкубацию карты при 35,0 °C ± 2,0 °C и контролируйте биохимические реакции до 8 часов.
    3. Примите результат Salmonella enterica ssp. enterica с вероятностью ≥ 95% и отличным рейтингом уверенности.
  6. Серотипизация: После ночной инкубации при температуре 37 °C выбирайте отдельные колонии из пластины Роя. Проведите тесты агглютинации слайдов для обнаружения O-антигенов и H-антигенов. Используйте коммерчески доступные наборы против сыворотки против сальмонеллы (см. таблицу материалов) для тестирования.

2. Сбор образцов у человека и идентификация штаммов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения сальмонеллы из образцов фекалий человека следите протоколам конфиденциальности Программы мониторинга пищевых заболеваний.

  1. Сбор: Собрать примерно 2 г свежеочищенных образцов человеческих фекалий. Поместите образцы фекалий в чистые, сухие контейнеры с широким горлом. Транспортируйте образцы фекалий в лабораторию в течение 1 часа с помощью изолированных транспортных коробок для поддержания целостности образца.
    ВНИМАНИЕ: Образцы фекалий человека могут содержать несколько патогенов, помимо сальмонеллы. Обрабатывайте все образцы как потенциально инфекционные и соблюдайте стандартные меры предосторожности при обращении с биологическими материалами.
  2. Инокуляция: Инокулировать собранные образцы фекалий непосредственно на следующие селективные агарные пластины: CHROMagar Salmonella, Salmonella-XLD агар и Shigella (SS) agar.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. шаг 1.4 для характерной морфологии колонии CHROMagar Salmonella и XLD agar. На SS agar предполагаемые колонии сальмонеллы обычно выглядят бесцветными, непрозрачными или бежевыми с чёрными центрами. Сам агар остаётся относительно неизменным.
  3. Идентификация: Определить подозреваемые колонии сальмонеллы , описанные в шаге 1.5.
  4. Серотипирование: Выполните серотипизацию с помощью агглютинации слайдов, как описано в шаге 1.6.

3. Подготовка библиотеки и секвенирование целого генома

  1. Бактериальная культура: Полоска сальмонеллы на LB агаре, инкубируется при 37 °C в течение 12 часов. Выберите колонию, инокулируйте в бульон весом 200 мл фунтов и встряхните при 150 об/мин (37 °C, 12 часов). Центрифугу при 12 000 × г в течение 10 минут для сбора клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы центрифугации с помощью герметичных роторов или защитных чаш, чтобы предотвратить образование аэрозолей.
  2. Экстракция ДНК: Экстракция геномной ДНК с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК (см. таблицу материалов), следуя протоколу производителя.
    ВНИМАНИЕ: Реагенты в коммерческих наборах для экстракции ДНК (например, буферы для лизис, протеиназа K) могут быть вредны при вдыхании или при контакте с кожей и глазами. Если используются летучие реагенты, проводите экстракцию в выхлопной вытяжке или биологическом защитном шкафу, и носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
  3. Оценка качества ДНК: очистить геномную ДНК и измерить их с помощью флюорометра с помощью высокочувствительного теста dsDNA. Проверьте целостность ДНК с помощью электрофореза на 1% агарозном геле при 100 В в течение 45 минут; высококачественная ДНК выглядит как одна компактная полоса >20 кбит с минимальнымразмазыванием 27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Критический этап) Высококачественная геномная ДНК с высокой молекулярной массой (с соотношением A260/A280 ~1,8-2,0) имеет решающее значение для успешной подготовки и секвенирования библиотеки.
    ВНИМАНИЕ: Красители для окрашивания нуклеиновых кислот, используемые в электрофорезе агарозного геля (например, GelRed, Этидий бромид), являются мутагенными. Всегда носите перчатки при работе с гелями и растворами для окраски и утилизируйте их в соответствии с требованиями учреждения по опасным отходам.
  4. Фрагментация ДНК: Фрагментировать примерно 150 нг квалифицированной геномной ДНК до среднего размера ~350 bp с использованием системы фокусированного ультразвука согласно протоколу производителя.
  5. Постройте библиотеку секвенирования из срезанных фрагментов ДНК с помощью коммерческого комплекта для подготовки библиотеки (см. таблицу материалов). Выполните восстановление концов и 5'-фосфорилирование срезанных фрагментов ДНК. Затем добавьте одну базу буквы 'A' на концы трёхдюймовых концов и перевязывайте индексные адаптеры секвенирования.
  6. Амплифицировать и обогатить фрагменты ДНК, связанные с адаптером, с помощью программы ПЦР с ограниченным циклом, как указано в наборе.
  7. Квалифицировать и количественно оценить итоговую библиотеку с помощью таких методов, как флюорометрия и капиллярный электрофорез.
  8. Выполнить парное секвенирование концов (2 × 150 bp) на платформе секвенирования согласно стандартным операционным процедурам.

4. Анализ данных

  1. Контроль качества исходных данных секвенирования: Выполните начальный контроль качества исходных FASTQ-файлов с использованием fastp (версия 0.23.0) с параметрами по умолчанию. Цель — удалить последовательности адаптеров и низкокачественные считывания, тем самым генерируя чистые данные FASTQ для дальнейшего анализа.
  2. Собрать высококачественные фильтрованные считывания в черновики с помощью SPAdes (версия 3.15.0) с аккуратным вариантом уменьшения несоответствий и короткихинделов 26.
  3. Используйте геномные последовательности (файлы FASTQ /FASTA) в качестве входных данных для прогнозирования различных серотипов.
    1. Для MLST импортируйте файл FASTQ в программное обеспечение BioNumerics (версия 7.6).
      1. В окне «Импорт шаблона » нажмите «Редактировать разбор » в расширенных настройках. Установите строку разбора данных и декорацию данных в [DATA]. Применяйте регулярные выражения DATA]_* и [DATA] для разбора имён файла. Сохраните шаблон, выберите его и нажмите « Далее », затем «Закончить». Подтвердите отправку в окне «Отправить задачу » для загрузки данных. Инструмент CEStoreUploader автоматически откроется для передачи исходных данных WGS в вычислительный движок.
      2. Выберите запись генома после загрузки. Перейдите в инструменты WGS и выберите «TraNetGenotype» для автоматического прогнозирования ST. В диалоговом окне TraNetGenotype выберите Salmonella как тип штамма, выберите Serotype Analysis, Virulence Analysis и Antimicrobial Susceptibility Analysis и нажмите Да.
    2. Для SISTR (версия 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; Параметры: все параметры по умолчанию), откройте терминал и перейдите в каталог, содержащий собранный геномный файл assembly.fasta.
      1. Выполните следующую команду для предсказания серовара и создания комплексного отчета в формате CSV: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. Эта команда генерирует отчёт с предсказанным сероваром.
        ПРИМЕЧАНИЕ: -qc: Проводит проверку качества сборки. -i assembly.fasta: Задаёт входный файл FASTA. -f csv: Определяет формат вывода как CSV. -o sistr_results: Устанавливает базовое имя для выходного файла (например, sistr_results.csv). -p 4: Использует 4 потока процессора для анализа с целью ускорения вычислений. --alleles-output: сохраняет последовательности аллелей и информацию в JSON-файл. --cgmlst-profiles: экспортирует профили аллелей cgMLST в CSV-файл.
    3. Для SeqSero (версия 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; Параметры: все параметры по умолчанию), переходите в каталог с входным файлом данных. Выполните следующую команду с параметрами по умолчанию для анализа: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. Инструмент создаёт каталог вывода, содержащий файл Seqsero_result.txt с предсказанным серотипом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: -m 4 указывает тип входа как сборку генома. -i определяет входный файл FASTA.
    4. Для SeqSero2 (версия 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; Параметры: все параметры по умолчанию). Выполните следующую команду: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. Инструмент выводит предсказанный серотип напрямую на терминальный экран после завершения. Выход даёт предсказанный серотип.
      ПРИМЕЧАНИЕ: -m k: задаёт рабочий процесс на основе k-mer для быстрого прогнозирования серотипов с использованием уникальных k-мер детерминантов серотипов. -t 4: обозначает тип входа как собранные последовательности.
    5. Для SeqSero2S (версия 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; Параметры: все параметры по умолчанию): Запустите с помощью предоставленного скрипта: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. Выход даёт предсказанный серотип.
      ПРИМЕЧАНИЕ: -m k позволяет анализировать исходные чтения или геномные сборки на основе k-mer. -t 4 определяет вход собранной последовательности.

5. Критические параметры и практические аспекты

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие факторы имеют решающее значение для успешной реализации этого геномного рабочего процесса, особенно в условиях ограниченных ресурсов.

  1. Проверьте, что исходные данные секвенирования достигают достаточной глубины покрытия. Глубина секвенирования примерно в 100x обычно достаточна для высококачественного анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лабораторий, ориентированных на экономическую эффективность, рекомендуется минимальная глубина секвенирования 75x как практический нижний порог для надёжного прогнозирования серотипов с использованием MLST или SeqSero221.
  2. Убедитесь, что качество исходных чтений высокое, с результатом Q30 (точность базового звонка 99,9%) обычно выше 90%.
  3. Оцените качество сборки de novo генома перед использованием инструментов прогнозирования серотипов, требующих собранных контигов. Используйте статистику N50 как ключевую метрику.
    ПРИМЕЧАНИЕ: N50 не менее 100 кбит/с рекомендуется22, а N50 больше 30 кбит/с — как минимальное требование для надёжногоанализа 23.
  4. Проверьте полноту сборки, обеспечив скорость отображения чтения не менее ≥98% при отображении отфильтрованных чтений обратно в собранный геном.

6. Рекомендуемый протокол прогнозирования серотипов для высокопроизводительного наблюдения за сальмонеллезами

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите методы прогнозирования серотипов на основе контекста наблюдения, необходимой точности и доступных лабораторных ресурсов. Для высокопроизводительного наблюдения за сальмонеллезой следуйте протоколу ниже:

  1. Предварительная идентификация: провести первичный скрининг в соответствии с GB 4789.4 для подтверждения изолятов как видов сальмонеллы .
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе нет необходимости определять конкретный серотип изолятов.
  2. Рутинное наблюдение (режим высокой пропускной способности): Для рутинного наблюдения, поскольку BioNumerics больше не обновляется, используйте открытые MLST28, SeqSero2S или другие проверенные, удобные для пользователя платформы геномного анализа, которые получают постоянную техническую поддержку и обновления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для MLST: схема из 7 генов предлагает стандартизированный, портативный и филогенетически информативный профиль (тип последовательностей, ST), который идеально подходит для долгосрочной эпидемиологии и глобального сравнения штаммов. Его простота обеспечивает быстрый анализ и минимальную вычислительную нагрузку. Для SeqSero2S: это обеспечивает двойное преимущество — быстрое предсказание серотипов и интегрированные результаты MLST за один запуск. Он может анализировать исходные чтения секвенирования напрямую, обходя сборку генома, чтобы сэкономить время и ресурсы. Даже с собранными данными FASTA он быстрее таких инструментов, как SISTR, поскольку выполняет предсказание серотипов независимо без использования вычислительного анализа.
  3. Быстрый скрининг (временно-чувствительные условия): для быстрых результатов или в лабораториях с ограниченной вычислительной возможностью используйте SeqSero2S для предварительного прогнозирования серотипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении предсказаний SeqSero2S рекомендуется интерпретировать «I_4,[5],12:i:-» как Salmonella Typhimurium.
  4. Расследование вспышек (режим высокой точки): Для отслеживания вспышек, требующих высокой разрешения, используйте SISTR, который использует cgMLST для дополнения прогнозирования серотипов и обеспечения высокоразрешающего кластерного анализа с целью отслеживания источников.
  5. Контроль качества и подтверждение непоследовательных результатов:
    1. Для распространённых штаммов секвенирования проводите случайную верификацию. Для нераспространённых вариантов используйте коэффициент верификации 20%. В случаях несогласованных результатов серотипирования изолаты направляются в более высокоуровневую или эталонную лабораторию для получения окончательного результата.
    2. Для подтверждающего анализа используйте несколько проверенных методов, включая: повторный геномный анализ с использованием как минимум двух различных инструментов прогнозирования in silico ; повторяется in silico предсказания как минимум двумя разными инструментами; филогенетическая контекстуализация с использованием методов высокого разрешения на основе WGS (например, cgMLST или анализ SNP целого генома)29.
    3. Присваивать окончательный серотип на основе консенсуса на основе этих всесторонних данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое соотношение верификации в 20% для нераспространённых серотипов основано на наблюдении, что геномные инструменты поддерживают высокую согласованность (93,3% для SISTR против MLST, 95,0% для SISTR против SeqSero2S) даже среди нераспространённых серотипов (Таблица 1). Этот порог экономически эффективен и обеспечивает достаточный запас безопасности для выявления низкой частоты расхождений между геномными инструментами в рутинном наблюдении.

7. Статистический анализ

  1. Выполняйте анализ данных с помощью программного обеспечения R (версия 4.1.2).
  2. Представить категориальные переменные в виде частот с процентами.
  3. Сравните группы с помощью χ2-тестов для категориальныхданных 30, рассмотрим P-значение <0,05 как статистически значимое.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол был валидирован с использованием 315 изолятов сальмонеллы из юго-западного Китая, из которых 213 изолятов (2/3) служили учебным набором для сравнения пяти методов прогнозирования серотипов на основе WGS (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 и SeqSero2S) с традиционными результатами серотипизации, а оставшиеся 102 изолята (1/3) использовались как валидационный набор для оценки эффективности MLST, SISTR и SeqSero2S.

Анализ обучающих множеств ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта масштабная оценка, включающая 315 изолятов сальмонеллы из юго-западного Китая, демонстрирует превосходную воспроизводимость методов серотипирования на основе WGS по сравнению с традиционными подходами (84,1% против 62,9%, P<0,001). Наши результаты подтверждают комплексный геномный рабочий процесс, при котором критически важные начальные этапы подготовки образцов и контроля качества ДНК (разделы 1-3) напрямую влияют на дальнейшую надёжность. Протокол делает акцент на высокока...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Бюро науки и технологий Тибета и Сычуани (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 для H.Z. и 2024NSFSC0033 для X.P.), программы науки и технологий Сычуани (2024JDRC0032 по Y.X.), проекта Института здравоохранения новой продуктивности (с HN240302C до H.Z.), проекта по возрождению дисциплин в лабораторных науках общественного здравоохранения (2023SY-04 по H.Z.), Западнокитайская школа общественного здравоохранения/Четвёртая больница Западного Китая, Сычуаньский университет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BioNumerics (версия 7.6)Прикладная математикаhttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/прогнозирование серотипов/филогенический анализ
Хромагарская сальмонеллаБектон, Дикинсон и компания214983Селективная хромогенная среда сальмонеллы
Fastp (версия 0.23.0)Открытый исходный кодhttps://github.com/OpenGene/fastpКонтроль качества чтения
Система секвенирования Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Платформа для секвенирования целого генома
Фокусированный ультразвуковой аппарат M220Коварис500295Сдвиг ДНК
Набор быстрой ДНК-анализы Magbeads для почвыMP BiomedicalsMP116560200Набор для экстракции геномной ДНК
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Управление данными
Набор NEXTFLEX Rapid DNA-SeqРеввити50-255-1124Подготовка библиотеки секвенирования
Флюорметр Кубит 2.0Термо Фишер СайентификQ32866Квантификация ДНК
Qubit dsDNA Набора для высокочувствительного анализаТермо Фишер СайентификQ32851Квантификация ДНК
R (версия 4.1.2)Фонд Rhttps://www.r-project.org/Статистические вычисления
Набор для противосыворотки против сальмонеллыИнститут сыворотки Статенса60898Обнаружение O/H-антигена
SeqSeroОткрытый исходный кодhttps://github.com/denglab/SeqSeroПредсказание серотипов
SeqSero2Открытый исходный кодhttps://github.com/denglab/SeqSero2Предсказание серотипов
SeqSero2SОткрытый исходный кодhttps://github.com/denglab/SeqSero2sПредсказание серотипов
SISTRОткрытый исходный кодhttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdПредсказание серотипов
SPAdes (версия 3.15.0)Открытый исходный кодhttps://github.com/ablab/spadesСборка генома
Рой АгарBD Biosciences211519Используется для инкубации серотипирования
Флюорметр TBS-380Turner BioSystemsP/N 3800-003Квантификация ДНК
Компактная система VITEK 2BioMé Rieux95061-768Автоматизированная система идентификации микроорганизмов

Ссылки

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MLST

Похожие статьи