Эффективное производство Т-клеток химерных антигенных рецепторов (CAR) с трансгенами более 10 кб с использованием лентивирусных векторов

Краткое содержание

Здесь мы представляем оптимизированный рабочий процесс для получения Т-клеток химерного антигенного рецептора (CAR) с крупными трансгенами объёмом более 10 кб с использованием лентивирусных векторов.

Аннотация

Разработка множественных рецепторов в Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR) стала мощной стратегией для предотвращения рецидивов антиген-отрицательного и снижения токсичности на целевой и вне опухоли. Однако производство мультирецепторных CAR T-клеток остаётся сложной задачей, поскольку увеличение размеров лентивирусных трансгенов значительно снижает титры вируса и скорость трансдукции Т-клеток. Современные производственные процессы часто опираются на сортировку клеток для обогащения трансдуцированных Т-клеток из продукции с низким выходом. Тем не менее, методы сортировки клеток не увеличивают абсолютное количество Т-элементов CAR и не добавляют дополнительной сложности уже сложному производственному процессу. В результате эти ограничения затрудняют клиническую трансляцию мультирецепторных CAR-Т-клеток и ограничивают разработку иммунотерапии следующего поколения.

Здесь мы представляем подробный, пошаговый производственный рабочий процесс, оптимизированный для генерации CAR T-клеток с крупными лентивирусными трансгенами. Используя этот рабочий процесс, мы демонстрируем увеличение эффективности трансдукции, зависящее от размера, при этом наиболее выраженное усиление наблюдается до 14,8 раза для лентивирусного вектора с объёмом 10,1 кб. Важно, что рабочий процесс поддерживает надёжное расширение Т-ячеек и устраняет необходимость сортировки ячеек. Преодолевая существующие ограничения по размеру при переносе генов лентивируса, этот рабочий процесс позволяет эффективно генерировать мультирецепторные CAR T-клетки, тем самым способствуя разработке передовых иммунотерапии.

Введение

Т-клетки химерных антигенных рецепторов (CAR) произвели революцию в области иммунотерапии. Однако, несмотря на выдающиеся успехи, остаются критические проблемы, включая иммуносупрессию, опосредованную микроокружением опухолей (ТМЭ), рецидивы опухолей отрицательных к антигену и токсичность на цель/вне^{опухоли 1,2}. Разработка CAR T-клеток с множеством синтетических рецепторов, таких как двойные CAR, комбинированные CAR и TCR-конструкции или цитокиновые переключающие рецепторы, имеет потенциал преодолеть эти^{препятствия 3,4}. При рака крыви оснащание эффекторных Т-клеток двойными CAR позволяет одновременно нацеливаться на два различных антигена, таких как CD19 и CD20⁵, что снижает риск выхода опухолевых антигенов. В солидных опухолях токсичность целевой и вне опухоли может быть снижена путём, например, включения, например, синтетических цепей рецепторов Notch (synNotch), которые обеспечивают логически контролируемую экспрессию CAR и повышают точность^{таргетирования} 6,7,8,9,10,11,12,13 . Однако производство CAR T-клеток с несколькими рецепторами остаётся сложной из-за увеличения размера трансгена. Самоинактивирующие лентивирусные векторы третьего поколения, полученные от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1, являются современным золотым стандартом производства CAR T-клеток на исследовательском и клиническом^{уровне 14}. Для генерации CAR T-клеток лентивирусные векторы разрабатываются с помощью специализированных CAR-экспрессионных кассет, окружённых длинными конечными повторами (LTR), которые опосредуют интеграцию в геном Т-клеток. Максимальная эффективная упаковочная ёмкость (EPC) текущих лентивирусных векторов составляет примерно 9,2 килобазы (кб) от LTR к LTR, что соответствует размеру родного генома ВИЧ-1. По мере того как титры лентивируса уменьшаются полулогарифмически с увеличением длины^{вектора 15}, инженерия крупных трансгенов с множественными рецепторами резко снижает выработку лентивируса и в конечном итоге затрудняет производство CAR^{T-клеток 16}. Хотя методы сортировки клеток, такие как магнитно- или флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (MACS или FACS соответственно), могут использоваться для обогащения CAR T-клеток за счёт низкого выхода, эти методы не увеличивают абсолютное количество CAR T-клеток и не добавляют дополнительной сложности уже сложному производственному процессу. В результате производственные трудности CAR T-клеток с крупными лентивирусными трансгенами остаются серьёзным препятствием как для доклинических исследований, так и для клинического применения.

Недавно мы создали рабочий процесс производства Т-клеток CAR Т-клеток, оптимизированный для эффекторных Т-клеток, несущих крупные лентивирусные трансгены, такие как система с одним векторным synNotch (svsNotch)¹⁷. Здесь мы подробно описываем методологию в пошаговом протоколе для облегчения её широкого применения. В качестве доказательства концепции мы демонстрируем увеличения эффективности трансдукции в зависимости от размера лентивирусных трансгенов от 5,7 кб до 9,2 кб и 10,1 кб. В целом, такой оптимизированный рабочий процесс увеличивает скорость трансдукции до 14,8 раза, что устраняет необходимость сортировки клеток и позволяет эффективно генерировать эффекторные Т-клетки с размером трансгенов более 10 кб.

Протокол

Человеческие Т-клетки закупались через Центр человеческой иммунологии Пенсильванского университета, который работает по принципам Хорошей лабораторной практики с установленными стандартными операционными процедурами и/или протоколами приема, обработки, заморозки и анализа образцов, соответствующими этическим рекомендациям MIATA и Университета Пенсильвании.

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический обзор оптимизированного рабочего процесса для производства лентивирусов и CAR T-клеток показан на рисунке 1. Сравнение ключевых шагов оптимизации с текущим стандартным рабочим процессом приведено в таблице 1. Все клеточные культуры поддерживались при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_СО2 с использованием T-клеточной среды (TCM), состоящей из RPMI-1640, дополненной 10% термоинактивированной сывороткой плода (FBS), буфером HEPES 10 мм, 2 мМ L-аланил-L-глутамин (см. Таблицу материалов), 100 U/mL пенициллина и 100 U/mL стрептомицином.

Рисунок 1: Оптимизированный рабочий процесс для производства лентивирусов и CAR T-клеток с крупными трансгенами. Схематическое представление производства лентивируса (вверху) и генерации CAR T-клеток (внизу), выделяющее ключевые шаги и оптимизации, повышающие титры вируса и эффективность трансдукции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

		Стандартный рабочий процесс	Оптимизированный рабочий процесс
Вирус	Вирусная оболочка	VSV-G	Cocal-G
	Трансфекция	L2000	L30001
	Сбор LV	24 часа2 + 48 ч. 2	30-36 ч. 3
Т-ячейка	Судно	Фляга T25	96-колодцевая плоская нижняя пластина
	Соотношение поверхности и объёма	Переменная	5,12см 2/мл4
	Адъювант	Нет	SF1085
13 мкл L3000 на 1 мкг ДНК, без изменения среды
2центрифугирования при 106 800 x g на 2,5 часа, круглая трубка
3центрифугирования при 12 300 г ночью, коническая нижняя трубка
4Дополнительные добавки после трансдукции
555 мкг/мл

Таблица 1: Сравнение стандартных и оптимизированных рабочих процессов. Ключевые оптимизации улучшенного рабочего процесса по сравнению с текущим стандартным рабочим процессом. Эта таблица была адаптирована с разрешения Роммеля и ^др.17.

1. Производство лентивируса

1. Поддержание HEK293T клеток
   1. Убедитесь, что HEK293T клетки равномерно распределены, свободны от сгустков и имеют 50-70% совпадения (типичный выход: 1,0-1,5 × 10⁷ клеток на колбу T150).
   2. Аспирируйте супернатант, добавьте 20 мл PBS комнатной температуры (RT) на верхнюю сторону колбы, чтобы избежать смещения клеток, аккуратно покрутите PBS над клетками и аспирируйте промывку.
   3. Добавьте 3 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубируйте 15-30 секунд при RT, наклоняя колбу из стороны в сторону. Контролировать отделение клеток.
   4. Добавьте 7 мл холодного ТКМ, суспензируйте клетки у дна колбы для получения суспензии на одну ячейку и перенесите в трубку объемом 50 мл. Помой колбу с 10-20 мл холодного ТКМ и добавь стирку в ту же трубку.
   5. Центрифугуйте клетки (300 × г, 5 минут, 4 °C), аспирируйте супернатант, ресуспензируйте 10 мл ТКМ и подсчитывайте клетки.
   6. Пластины HEK293T клетки в термофляжках T150 по 3 × 10⁶ клеток на колбу для передачи каждые 2 дня (например, в понедельник и среду) или по 1 × 10⁶ клеток на колбу для передачи каждые 3 дня (например, покрывание в пятницу для пассажа в выходные) с использованием 30 мл ТКМ, предварительно нагретого до 37 °C.
2. Трансфекция HEK293T клеток для производства лентивируса
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите небольшой пилотный эксперимент, чтобы определить плотность посева, которая стабильно даёт 70-80% слияния через 2 дня. Убедиться, что HEK293T слияние клеток не превышает 80% на момент трансфекции (см. Обсуждение). Трансфекция была оптимизирована с использованием минимально необходимых веществ с редуцированной сывороткой и коммерческих реагентов для липофекции (L3000 и P3000, см. таблицу материалов).
   1. Собирайте HEK293T клетки методом трипсинизации, как описано выше, и на пластине 4 × 10⁶ клеток на колбу T150 с 30 мл ТКМ, предварительно нагретым до 37 °C.
   2. Через 2 дня убедитесь, что культуры равномерно распределены и сливаются на 70-80%.
   3. Разогрейте 50 мл минимально необходимой среды с уменьшенной сывороткой до RT. Разморозьте лентивирусные плазмиды, аккуратно перемешайте и быстро открутите. Импульсный вихрь, реагенты для липофекции, быстрое вращение и оставьте их на RT.
   4. Готовьте мастер-миксы ДНК. Для каждой колбы комбинируйте в следующем порядке: 2 мл минимально необходимой среды с редуцированной сывороткой, 39 мкг лентивирусных упаковочных плазмид (18 мкг pTRP Gag-Pol, 18 мкг pTRP RSV-Rev, 3 мкг pTRP Cocal-G), 15 мкг переносной плазмиды и 108 мкл реагента P3000 (2 мкл P3000/мкг ДНК). Масштабируйте по мере необходимости и увеличивайте итоговые суммы как минимум на 10%, чтобы учесть потери от пипетирования. Импульсный вихрь, быстрое вращение и хранение в RT.
   5. Подготовьте мастер-миксы L3000. Для каждой колбы комбинируйте в следующем порядке: 1,84 мл минимальной существенной среды с редуцированной сывороткой и 162 мкл L3000 (3 мкл L3000/мкг ДНК). Масштабируйте по мере необходимости и увеличивайте итоговые суммы как минимум на 10%, чтобы учесть потери от пипетирования. Импульсный вихрь, быстрое вращение и инкубация на RT в течение 5 минут.
   6. Через 5 минут добавьте по 2 мл мастер-смеси L3000 на колбу в соответствующую ДНК-мастер-смесь для примерно 1:2 разбавления. Медленно добавляйте смесь L3000, начиная с нижней части трубки, не касаясь её боков. Тщательно перемешайте с помощью пипетки и инкубуйте 15 минут при RT.
   7. Тем временем аккуратно удаляйте 6 мл супернатанта из каждой HEK293T культуры и маркируйте каждую колбу.
   8. Через 15 минут проведите трансфекцию каждой культуры, наклоняя колбу вверх и медленно выпуская 4 мл смеси трансфекции в верхнюю часть колбы, чтобы избежать смещения клеток. Медленно дважды вверх/вниз пипеткой, верните флягу в исходное положение, аккуратно покрутите, поместите обратно в инкубатор и запишите время.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставляйте культуры нетронутыми до сбора лентивируса. В отличие от рекомендации производителя заменить HEK293T супернатант, содержащий смесь трансфекции L3000, на свежую культурную среду после^{трансфекции 18}, опущение этого шага сохраняет более высокие лентивирусные^{титры 17}.
3. Сбор, концентрация и замораживание лентивирусных супернатантов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните лентивирусные супернатанты на льду или при 4 °C во время всех этапов обработки, чтобы предотвратить их разрушение.
   ВНИМАНИЕ: Лентивирусные векторы классифицируются как инфекционные вещества. Соблюдайте соответствующие меры биобезопасности, включая использование средств индивидуальной защиты (например, двойные перчатки, одноразовые лабораторные халаты). Дезинфицируйте все рабочие поверхности 10% отбеливателем, а затем 70% этанолом. Дезинфицировать загрязнённые расходные материалы и жидкие отходы 10% отбеливателем перед утилизацией как биологически опасных отходов в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности.
   1. Очистите оборудование ультрацентрифуг (ведра, конические трубки и конические адаптеры) 10% отбеливателем, затем прополосните водой. Кратковременное сушение на воздухе, затем опрыскивание 70% этанола и сушка на воздухе под вытяжкой для культуры тканей.
   2. Предварительно охладите ультрацентрифугу с вставленным ротором до 4 °C.
   3. Собирайте лентивирусные супернатанты через 30-36 часов после трансфекции, перемещая их в пробирки объемом 50 мл. Очистить супернатанты центрифугированием (500 × г, 5 мин, 4 °C), профильтровать через поровый фильтр 0,45 мкм и хранить на льду.
   4. Вставьте конические адаптеры в ведра, перенесите фильтрованные супернатанты в конические ультрацентрифугные трубки и загрузите их в ведра. Сбалансируйте противоположные ведра холодным ТКМ, чтобы разница в весах была ниже 0,1 г.
   5. Концентрируйте супернатанты ультрацентрифугированием при 12 300 × г ночью при 4 °C.
   6. На следующее утро аккуратно уберите ведра и уберите их на льду.
   7. Подготовьте коробку с сухим льдом для заморозки и маркированными криовиалами для алицитирования.
   8. Под капюшоном для культуры тканей откройте каждое ведро и выньте ультрацентрифугную трубку внутри щипцем. Для каждой трубки следует следующее:
   9. Аккуратно аспирируйте супернатант до 0,5 дюйма от дна трубки и декантуйте оставшуюся жидкость в пластину с шестью ячеями. Аккуратно постукуйте по трубке, чтобы удалить часть остатков жидкости.
   10. Добавьте 300 мкл холодного ТКМ, аккуратно подвесьте на 30 секунд и перенесите суспензию в криовиал.
   11. Промой трубку с 200 мкл холодного ТКМ и добавь стирку в тот же криовиал.
   12. Аккуратно смешайте и аликвотируйте 60 мкл для титрирования лентивируса (см. шаг 1.4), несколько аликвотов по 100 мкл для производства CAR T-клеток и ещё одну трубку с оставшимся объёмом. Сразу же заморозьте аликвоты на сухом льду. Переведите аликвоты до -80 °C для длительного хранения.
4. Титрирование концентрированного лентивируса с помощью первичных Т-клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: примерно 1 × 10⁵ Т-клетки требуются за разбавление на лентивирус. Например, шесть лентивирусов с восемью разбавлениями требуют: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4,8 × 10⁶ Т-клетки. Дополнительные ячейки должны быть готовы для учёта потерь при пипетировании. Т-клетки стимулируются с помощью магнитных шариков активации, покрытых антителами к анти-CD3 и анти-CD28 (см. таблицу материалов).
   1. Активация Т-клеток (день 0)
      1. Предварительное условие: Держать очищенные человеческие CD4⁺ и ^CD8+ Т-клетки в ТКМ готовыми.
      2. Посчитайте CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки и объедините их в соотношении 1:1.
      3. Промывайте активационные шарики следующим образом: добавьте 1 мл ТКМ в трубку, повторно подвесьте шарики с помощью вихря и перенесите необходимое количество для достижения соотношения шариков к Т-клеткам 3 к 1. Поместите трубку в магнитную подставку и дайте шарикам образовать гранулу вдоль стенки трубки. Через 30 секунд аккуратно аспирируйте супернатант, снимите трубку с магнитной стойки и снова подвесите шарики в 1 мл ТКМ. Повторите стирку ещё два раза.
      4. Добавьте активационные шарики к Т-клеткам и отрегулируйте конечную концентрацию до 1 ×^{10 6} клеток/мл при предварительном нагреве ТКМ до 37 °C.
      5. Перемешайте скважину и перенесите суспензию в реагентный резервуар. Пластинчатые ячейки в пластинах с плоским дном на 96 лунок с 100 мкл ТКМ на каждую скважину с использованием многоканальной пипетки. Тщательно перемешивайте каждые 1-2 минуты, чтобы бусина не осела.
   2. Трансдукция Т-клеток (день 1)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для лентивирусов с крупными трансгенами (например, 9 кб LTR-to-LTR) подготовьте 6 условий с использованием последовательных разбавлений 1:2 (без разбавления, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Для лентивирусов с меньшими трансгенами (например, 7 кб от LTR к LTR) требуется 8 состояний с последовательными разбавлениями 1:4. Используйте оставшиеся скважины в качестве нетрансдукированных (UTD) контроллеров.
      1. Разморозьте 60 мкл каждого концентрированного лентивируса в RT и храните на льду.
      2. Подготовьте серию разбавления в пластине с круглым дном на 96 колодцах: добавьте 60 мкл лентивируса в верхний ряд, 30 мкл холодного ТКМ в каждый ряд ниже, перенесите 30 мкл сверху на второй ряд и перемешайте (разбавление 1:2), перенесите 30 мкл со второго на третий ряд и перемешайте (разбавление 1:4). Продолжайте, пока не приготовите всего шесть условий (неразбавленные, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Используйте сразу для трансдукции.
      3. В течение 23-26 часов после стимуляции шариками трансдуцировать Т-клетки с 25 мкл лентивируса на каждую яму, используя многоканальную пипетку. Добавьте 25 мкл ТКМ в контрольные скважины UTD.
   3. Кормление Т-клетками (день 3)
      1. Аккуратно добавьте 125 мкл ТКМ, предварительно подогреного до 37 °C, в каждую скважину с помощью многоканальной пипетки.
   4. Анализ цитометрии Т-клеток и анализ проточной цитометрии (день 5)
      1. Подготовьте три комплекта трубок с винтовыми крышками по 1,5 мл для каждого состояния и снимите крышки. Два из трёх комплектов поместите в магнитную подставку.
      2. Подвесьте каждую ямочку и перенесите клетки в первый набор трубок, чтобы шарики могли образовать гранулу вдоль стенки трубки. Через 30 секунд аккуратно перенесите супернатанты во второй комплект трубок. Подождите 30 секунд (бусины больше не должны быть видны), затем перенесите супернатанты в третий комплект тюбиков и храните на льду.
      3. Окрашивайте Т-клетки на подходящий маркер трансдукции (например, анти-CD19 CAR или анти-HER2 synNotch) антителами (см. таблицу материалов) и анализируйте экспрессию маркеров с помощью потоковой цитометрии.
      4. Определить состояния с частотой трансдукции ниже 30%, что примерно соответствует линейному диапазону между объёмом вируса и скоростью передачи.
      5. Вычислите титры лентивируса по следующей формуле:
         Титр (TU/mL) = (начальное количество Т-клеток x процент трансдуцированных клеток x фактор разбавления)/объём вируса (mL)
         например, 20% экспрессии CAR с разбавлением лентивирусного запаса в соотношении 1:32:
         (100 000 ячеек x 0,2 x 32) / (0,025 мл) = 2,56 × 10⁷ ТУ/мл

2. Производство Т-элементов CAR

ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные начальные количества для производства CAR T-клеток составляют 1-5 × 10⁶ Т-клеток на группу. Увеличить количество клеток в контрольной группе UTD на 50%, так как эта группа также будет использоваться для нормализации уровней трансдукции в последующих экспериментах. Ожидайте удвоение населения на 5-6 человек в течение расширения. Трансдукция Т-клеток была оптимизирована с использованием блочного сополимера в качестве энхансера (см. Таблицу материалов) и с определёнными соотношениями поверхности к объёму культуры в пластинах с плоским дном на 96^{лунок 17}.

1. Приготовление раствора усилителя массой 100 мг/мл
   1. Добавьте 5 г сополимерного энхансера в пластиковую бутылку, затем 45 мл ультрачистой воды. Перемешивайте на ночь в RT.
   2. Переливайте раствор в градуированный цилиндр и регулируйте объём до 50 мл с помощью ультрачистой воды.
   3. Фильтруйте раствор через поровый фильтр диаметром 0,22 мкм и храните при 4 °C.
2. Активация Т-клеток (день 0)
   1. Предварительное условие: Держать очищенные человеческие CD4⁺ и ^CD8+ Т-клетки в ТКМ готовыми.
   2. Посчитайте CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки и объедините их в соотношении 1:1.
   3. Бусины для активации стирки следующим образом.
      1. Добавьте 1 мл ТКМ в трубку, повторно подвесьте шарики путём вихря и перенесите необходимое количество для достижения соотношения шариков к Т-клеткам 3 к 1. Поместите трубку в магнитную подставку и дайте шарикам образовать гранулу вдоль стенки трубки.
      2. Через 30 секунд аккуратно аспирируйте супернатант, снимите трубку с магнитной стойки и снова подвесите шарики в 1 мл ТКМ. Повторите стирку ещё два раза.
   4. Добавьте активационные шарики к Т-клеткам и отрегулируйте конечную концентрацию до 1 ×^{10 6} клеток/мл при предварительном нагреве ТКМ до 37 °C.
   5. Перемешайте скважину и перенесите суспензию в реагентный резервуар. Пластинчатые ячейки в пластинах с плоским дном на 96 лунок с 50 мкл ТКМ на каждую скважину с использованием многоканальной пипетки. Тщательно перемешивайте каждые 1-2 минуты, чтобы бусина не осела.
3. Трансдукция Т-клеток (день 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте количество лентивируса на основе результатов предыдущей титрации, чтобы конечные уровни передачи были сопоставимы между группами (обычно от 20% до 30%). Чтобы избежать множественных интеграций лентивируса, поддерживайте максимальный уровень трансдукции ≤ 30%. Лентивирусы с крупными трансгенами обычно требуют либо неразбавлённого вируса, либо разбавления 1:4-1:8. Корректируйте размер групп, чтобы избежать остатков лентивируса, так как каждый цикл заморозки-оттаивания снижает титры лентивируса. Используйте мастер-смеси лентивируса сразу после приготовления.
   1. Разморозьте необходимые количества концентрированного лентивируса на RT и храните на льду.
   2. Подготовьте рабочий приклад усилителя 2 мг/мл в холодном ТКМ, смешав, например, 100 мкл энхансера (100 мг/мл запаса) с 4,9 мл ТКМ.
   3. Подготовьте мастер-смеси лентивируса на основе результатов титрирования и добавьте энхансер к конечной концентрации 275 мкг/мл. Увеличите конечные объёмы как минимум на 10%, чтобы учесть потери от пипетирования. Например, для достижения разбавления 1:16 при 100 скважинах:
      Общий объём: 100 скважин × 12,5 мкл лентивируса × 110% = 1 375 мкл
      Разбавление 1:16: 1 375 мкл/ 16 = 85,9 мкл лентивируса
      Усилитель: 189 мкл (финальный 275 мкг/мл)
      Итоговая мастер-смесь: 1 100 мкл ТКМ + 85,9 мкл лентивируса + 189 мкл энхансера = 1 375 мкл
   4. В течение 23–26 часов после стимуляции шариками трансдуцируются Т-клетки с 12,5 мкл на каждую яме мастер-смеси лентивируса с помощью многоканальной пипетки, что приводит к конечной концентрации энхансера 55 мкг/мл. Добавьте 12,5 мкл ТКМ в контрольные скважины UTD.
4. Кормление Т-клетками (день 3)
   1. Аккуратно добавьте 125 мкл ТКМ, предварительно подогреного до 37 °C, в каждую скважину с помощью многоканальной пипетки.
5. Удаление Т-клеток (день 5)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте стерильный резервуар и три комплекта трубок по 50 мл для каждой культуры. Ограничите общий объём промывания ≤ 20% от объёма культуры Т-клеток, чтобы избежать разбавления клеток ниже 8 × 10⁵ клеток/мл.
   1. Сберите каждую культуру в стерильный резервуар с помощью многоканальной пипетки, промыйте исходные пластины ТКМ и добавьте промывку в резервуар. Перенесите каждую подвеску ячейки на первый набор трубок по 50 мл.
   2. Поместите трубки в магнитную подставку, чтобы шарики могли образовать гранулу вдоль стенки трубки. Через 30 секунд аккуратно перенесите супернатанты во второй комплект трубок и поместите их в магнитную подставку. Подождите 30 секунд (бусины больше не должны быть видны), затем перенесите супернатанты в третий комплект трубок и храните их в инкубаторе.
   3. Посчитайте каждую культуру и нормализуйте до 8 × 10⁵ клеток/мл с предварительной температурой ТКМ до 37 °C. Помещайте в соответствующий сосуд в зависимости от итогового объёма (Таблица 2).
   4. Дайте Т-клеткам отдохнуть 1 день, затем начните ежедневное кормление с 7-го дня (см. следующий шаг).
6. Кормление Т-клетками (7-й день и ежедневно после этого)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Т-клетки удваиваются примерно каждые 24-36 часов и удваиваются на 5-7 популяций перед отдыхом. Мониторинг объёмов Т-ячеек с помощью счётчика ячеек на основе электрического импеданса (см. таблицу материалов), чтобы определить оптимальную точку времени криоконсервации.
   1. Объедините каждую культуру, хорошо перемешайте и посчитайте клетки.
   2. Нормализуйте каждую культуру до 8 × 10⁵ клеток/мл с предварительной температурой ТКМ до 37 °C и переполните в соответствующий сосуд (Таблица 2).
   3. Продолжайте расширение до тех пор, пока средний объём ячейки не опустится ниже 320^мкм3, затем переходите к этапу криосохранения.
7. Валидация трансдукции Т-клеток с помощью потоковой цитометрии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трансдукция Т-клеток может быть оценена в любой момент между пятым днём и днём криоконсервации. Уровни экспрессии будут снижаться в ходе расширения, чтобы раннее измерение обеспечило чёткое разделение отрицательных и положительных фракций при анализе потоковой цитометрии.
   1. Берите по 2 × 10⁵ Т-клеток из каждой культуры.
   2. Окрашивайте Т-клетки на подходящий маркер трансдукции (например, анти-CD19 CAR или анти-HER2 synNotch) антителами (см. таблицу материалов) и анализируйте экспрессию маркеров с помощью проточной цитометрии
8. Криоконсервация Т-клеток (обычно между 10-12 днями)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервируйте расширенные Т-клетки непосредственно до или после их состояния покоя, чтобы повысить жизнеспособность во время оттаивания. Средний объём 320 мкм³ может служить границей криоконсервации. Когда объём клетки опускается ниже 300^мкм3, Т-клетки перестают делиться, и их общее количество начинает уменьшаться. Убедитесь, что у всех групп на момент криоконсервации сопоставимые объемы, что может потребовать дополнительного дня культуры для некоторых групп. Замораживайте ячейки с постоянной скоростью -1 °C в минуту, используя соответствующие контейнеры для замораживания (например, безалкогольные контейнеры для заморозки клеток, см. Таблицу материалов).
   1. Каждую культуру объедините в соответствующую трубку (например, 500 мл), посчитайте клетки и храните их в инкубаторе.
   2. Рассчитайте общее количество ячеек и желаемое количество аликвотов.
   3. Центрифугные клетки (300 × г, 10 мин, 4 °C) аспирируют супернатанты и ресуспендируют каждую культуру в замерзающей среде, содержащей 50% среды без сыворотки, 40% термоинактивированного FBS и 10% диметилсульфоксида (DMSO) при 2 × 10⁷ клеток/мл (см. таблицу материалов).
   4. Аликвотные клетки в криовиалы (от 250 мкл до 1 мл, что соответствует 5-20 × 10⁶ клеток на флакон). Поместите криовиалы в контейнер для заморозки клеток и храните их при -80 °C на ночь.
   5. Перенесите криовиалы в жидкий азот для длительного хранения.
9. Оттаивание Т-клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой группы Т-клеток подготовьте одну трубку с 50 мл ТКМ, предварительно нагретым до 37 °C, чтобы разбавить ДМСО в замерзающей среде после размораживания. Разогрейте дополнительное ТКМ для подачи.
   1. Быстро разморозить криовиалы при 37 °C в водяной бане или под проточной теплой водой.
   2. Как только жидкость становится видимой, переходите к вытяжке для культуры тканей, добавьте 500 мкл предварительно нагретого ТКМ, аккуратно перемешайте и перенесите клетки в подготовленные трубки с 50 мл ТКМ.
   3. Промой криовиал 500 мкл ТКМ и добавь стирку в ту же трубку.
   4. Инкубировать клетки в течение 10 минут при RT.
   5. Центрифугные клетки (300 × г, 10 минут, комнатной температуры) аспирируют супернатанты и реуспендируют их при 4 ×^{10 6} клеток/мл.
   6. Поместить клетки в соответствующий сосуд для культуры (Таблица 2).
   7. Отдыхните клетки на ночь в инкубаторе перед тем, как продолжить эксперименты по следующему потоку.

Судно	Минимальный объём	Максимальный объём
96-колодец	0,1 мл/скважину*	0,25 мл/скважина
48-колодец	0,2 мл/скважина	1 мл/скважина
24-колодец	0,5 мл/скважина	2 мл/скважина
12-колодец	1 мл/скважина	4 мл/скважина
6-well	2 мл/скважина	6 мл/скважина
T25 (горизонтальный)	3 мл	8 мл
T75 (горизонтальный)	8 мл	20 мл
T150 (горизонтальный)	20 мл	60 мл
* объём культуры временно уменьшается до 50 мкл/скважина для усиления трансдукции Т-клеток

Таблица 2: Рекомендуемые объёмы культурных сред для расширений CAR T-клеток. Минимальные и максимальные объемы культурных сред в широко используемых форматах сосудов при расширении Т-элементов.

Результаты

Чтобы продемонстрировать улучшения, достигнутые оптимизированным рабочим процессом (рисунок 1) в широком диапазоне размеров трансгенов, мы выбрали три размера лентивирусных векторов: 5,7 кб (CD19 CAR), 9,2 кб (HER2-MSLN svsNotch) и 10,1 кб (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (рисунок 2A). Лентивирусы производились либо в стандартных, либо при оптимизированных условиях (рисунок 2B: ЗПП против ОПТ и Таблица 1).

Для самого маленького вектора с массой 5,7 кб в одной производственной партии наблюдалось лишь умеренное улучшение трансдукции Т-клеток (рисунок 2B: верхняя часть — 73% против 88% при использовании неразбавлённого вируса). Стабильно титры лентивируса увеличивались лишь умеренно примерно в 1,5 раза (рисунок 2C: верх, 2,86 × 10⁸ TU/mL против 4,35 × 10⁸ TU/mL). В отличие от этого, вектор с объемом 9,2 кб показал значительно улучшенную производительность: максимальная скорость трансдукции Т-клеток увеличивалась примерно на 5,4 или 3,8 раза в зависимости от партии (рисунок 2B: средняя — 8,3%/16,6% против 45,1%/63,1% при использовании неразбавленного вируса), а функциональные титры улучшились примерно в 3,3 раза (рисунок 2C: середина; 3,1 × 10⁶ TU/mL против 10,1 × 10⁶ TU/mL). Самый сильный эффект наблюдался с вектором 10,1 кб, где скорость трансдукции увеличилась примерно в 12,4 или 9,8 раза (рисунок 2B: нижняя часть — 1,4%/1,5% против 17,3%/14,7% при использовании неразбавлённого вируса), а функциональные титры улучшились примерно в 10 раз (рисунок 2C: вниз, 0,24 × 10⁶ TU/mL против 2,41 × 10⁶ TU/mL).

Далее Т-клетки здоровых доноров трансдуцировались лентивирусными векторами, полученными в стандартных или оптимизированных условиях, с использованием соответствующих рабочих процессов (см. рисунок 3 и таблица 1). Для сравнения эффективности трансдукции в каждом рабочем процессе использовалось одинаковое количество лентивируса, а дозировка вируса была скорректирована так, чтобы поддерживать скорость трансдукции на уровне 30% или ниже, чтобы предотвратить множественные интеграционные события. По сравнению с Т-клетками, трансдуцированными при стандартных условиях и с использованием стандартного производства лентивируса, трансдукция в среднем увеличилась в 5,1 раза для вектора 5,7 кб, в 13,3 раза для вектора 9,2 кб и в 14,8 раза для вектора 10,1 кб (рисунок 3A и дополнительная таблица 1). Выбранные культуры Т-клеток, полученные с помощью оптимизированного рабочего процесса, дополнительно расширялись до достижения состояния покоя (рисунок 3B,C). Удвоение популяций варьировалось от 5,3 до 6,7 в зависимости от донора Т-клеток (рисунок 3B). Ежедневные измерения объёма Т-клеток показали минимальные остатки клеток, что не указывало на признаки токсичности во время расширения. До криоконсервации скорости трансдукции оценивались с помощью окрашивания на экспрессию рецепторов CAR/synNotch или измерения флуоресценции mTag-BFP2¹⁹ (рисунок 3C и дополнительный рисунок 1). Частоты трансдукции составили 31,2% для вектора 5,7 кб (чёрный; разбавление лентивируса 1:512), 29,8% для вектора 9,2 кб (красный; разбавление лентивируса 1:16), и 20,2% для вектора 10,1 кб (синий; разбавление лентивируса 1:4). Дополнительные функциональные данные, подтверждающие работу сгенерированных Т-клеток svsNotch и CAR T-клеток, представлены в нашем сопутствующем^{исследовании 17}. Важно, что эффекторные Т-клетки, полученные по оптимизированному протоколу, не демонстрировали различий в удвоении популяций или фенотипе Т-клеток по сравнению с теми, что были получены стандартным рабочим^{процессом 17}.

Рисунок 2: Производство Lentivirus по стандартным и оптимизированным рабочим процессам. (A) Схематический обзор лентивирусных векторов с соответствующими размерами^{трансгенов 17}. Верх: CAR против CD19 (CD19 CAR) экспрессируется промотором человеческого фактора удлинения-1 альфа (EF1α), с общим размером трансгена примерно 5,7 кб. Средняя и нижняя часть: рецептор HER2 synNotch соэкспрессируется либо с синим флуоресцентным репортерным белком (BFP2) (середина), либо с зелёной люциферазой щелчкового жука (CBG) (внизу) через саморасщепляющийся пептид 2A (P2A) промотором EF1α. Экспрессия мезотелинового (MSLN)-нацелённого CAR (MSLN CAR) контролируется GAL4-специфическим минимальным цитомегаловирусным (CMV) промотором (GAL4-CMV). Общие размеры трансгена составляют примерно 9,2 кб для HER2-MSLN svsNotch (средняя часть) и 10,1 кб для HER2-MSLN-CBG svsNotch (низу). SIN = самоинактивирующий вектор; LTR = длинная конечная последовательность повторов. (B) Трансдукция Т-клеток с помощью последовательных разбавлений лентивируса, возникающих при стандартных (std) и оптимизированных (opt) условиях с использованием векторов, описанных в (A). Два независимых продукта (круги и треугольники) на вектор с двумя партиями в каждом, и два отдельных донора Т-клеток на партию. Частоты трансдукции были усреднены у доноров Т-клеток. (C) Функциональные титры стандартных (ЗПП, открытые круги) и оптимизированные (opt, замкнутые круги) производства вирусов, показанные в (B). Данные были получены из двух независимых производств лентивируса, каждая из которых состояла из двух партий, с использованием двух разных доноров Т-клеток в каждой партии. Все индикаторы ошибки указывают среднее ± SD. Статистическая значимость была рассчитана с помощью двухстороннего парного t-теста. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Эта цифра была адаптирована с разрешения Роммеля и ^др.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Производство Т-элементов CAR со стандартными и оптимизированными рабочими процессами. (A) Увеличение скоростей трансдукции Т-ячеек в краты при оптимизированном (opt) рабочем процессе по сравнению со стандартным (std) рабочим процессом (см. также таблицу S1). Данные были получены из двух или трёх независимых расширений Т-клеток с использованием различных доноров и двух независимых продуктов лентивируса. (B) Удвоение популяций расширений Т-ячеек, генерируемых с помощью оптимизированного рабочего процесса. Для каждого вектора показываются два независимых расширения Т-клеток от различных нормальных доноров (ND), каждая из которых использует отдельную лентивирусную продукцию. (C) Графики потоковой цитометрии, показывающие экспрессию рецепторов CAR, BFP2 и synNotch в расширенных эффекторных Т-клетках на 7-й день (10,1 кб) или 10-й день (5,7 кб и 9,2 кб) (см. также дополнительный рисунок 1). Все индикаторы ошибки указывают среднее ± SD. Статистическая значимость рассчитывалась с помощью двухстороннего парного t-теста. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Эта цифра была адаптирована с разрешения Роммеля и ^др.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Стратегия гейтинга для оценки экспрессии CAR, synNotch рецептора и BFP2, связанная с рисунком 3C. Репрезентативные графики потоковой цитометрии, показывающие стратегию гейтинга, используемую для определения экспрессии CAR, synNotch и BFP2 в расширенных культурах Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Скорости трансдукции при отдельных расширениях Т-клеток, связанные с рисунком 3A. Скорости трансдукции расширений Т-элементов генерируются с помощью стандартных и оптимизированных рабочих процессов. Эта таблица была адаптирована с разрешения Роммеля и ^др.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Здесь мы представляем пошаговый протокол, подробно описывающий оптимизированный производственный процесс для CAR T-клеток с крупными лентивирусными трансгенами, такими как svsNotch T-клетки. Такой рабочий процесс устраняет необходимость сортировки клеток и позволяет эффективно генерировать эффекторные Т-клетки, несущие крупные лентивирусные трансгены. Используя этот рабочий процесс, мы регулярно производим эффекторные Т-клетки с лентивирусными трансгенами 9-10 кб и максимальными скоростями трансдукции 60-70% (9 кб) или 15-20% (10 кб).

При диагностике проблем с низкими титрами вируса или частотами трансдукции следует учитывать несколько ключевых факторов. Во-первых, качество HEK293T клеток. Важно, чтобы HEK293T клетки проходили по стабильному графику и никогда не позволяли расти более 50-70% слияния. По нашему опыту, лентивирусные векторы, полученные из HEK293T ранее переросших клеток, демонстрируют сниженный титр, даже если клетки выглядят морфологически восстановленными. Мы регулярно генерируем вирусные векторы с высоким титром, используя HEK293T клетки за пределами 30-го прохода, что указывает на то, что при правильном уходе клетки допускаются более высокие показатели. Помимо качества клеток, критическим фактором является слияние HEK293T клеток в момент трансфекции. Мы наблюдали снижение титров лентивируса при трансфекции HEK293T клеток при высокой слиянии (90-100%).

Во-вторых, строгое соблюдение сроков, концентраций и объёмов, указанных в этом протоколе, крайне важно, поскольку многие этапы были тщательно оптимизированы в предыдущем^{исследовании 17}. Например, усилитель сополимера (см. Таблицу материалов) был титрирован для максимизации скоростей трансдукции без обнаружения токсичности. Хотя более высокие концентрации могут дополнительно увеличить трансдукцию, они также вызывают токсичность и снижают расширение Т-клеток. Аналогично, сбор лентивирусных супернатантов вне рекомендуемого окна 30-36 часов (например, на 24 или 48 часах) дал более низкие титры в соответствующем эксперименте с^{временем 17}. В отличие от этого, строгое соблюдение соотношения CD4 к CD8 Т-клеток 1:1 не требуется, поскольку мы не наблюдали значительных различий в эффективности трансдукции при использовании объёмных Т-клеток с переменным распределением CD4/CD8. Однако отклонения от этого отношения могут влиять на продолжительность расширения и количество удвоения населения. Поэтому обычно мы сохраняем соотношение CD4 к CD8 1:1 для согласованности между экспериментами.

Будущие усилия по оптимизации могут быть сосредоточены на дополнительных стратегиях для улучшения трансдукции Т-клеток с помощью ещё более крупных лентивирусных трансгенов, таких как специализированные формулы среды или индивидуальные схемы цитокинов. Расширение этого процесса на другие типы иммунных клеток, включая натуральные киллеры и макрофаги, может расширить его терапевтические применения. Важно, что клиническая трансляция этого рабочего процесса также может помочь снизить производственные затраты на продукты клеточной терапии, модифицированной лентивирусом.

Комплексный пошаговый протокол, представленный здесь, служит практическим ориентиром для получения CAR T-клеток с крупными лентивирусными трансгенами и закладывает основу для разработки новых CAR T-клеток против солидных и кровяных раков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела — анти-CD19 CAR	Цитоарт	200101	Anti-CD19 CAR (идиотип), AF647-конъюгированный, 1:100
Антитела — анти-HER2 synNotch	R& D Systems	FAB95471G	Анти-Трастузумаб (идиотип), AF488-конъюгированный, 1:80
Отбеливатель	Клорокс	Бактерицидный отбеливатель
Контейнер для заморозки ячеек	Биоцизия	FTS30	Без алкоголя
Центрифуга (большая)	Thermo Scientific	Legend XTR
Центрифуга (мини)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Центрифуга (маленькая)	Эппендорф	5425
Счетчик Култера	Бекман Коултер	Multisizer 4	Счётчик клеток на основе электрического импеданса, определяющий количество клеток и объём клетки
Криолампы	Thermo Scientific	375418
Диметилсульфоксид (DMSO)	Технология клеточной сигнализации	12611P
DPBS (без кальция, без магния)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	Активационные шарики, используемые для стимуляции Т-клеток
Этанол	Лаборатории Decon	200 доказательств
FBS (инактивирован теплом)	Avantor (VWR)	97068-091
Потоковый цитометр	BD	LSRFortessa (647177)
Морозильник (-80 и градус; C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Морозильник (жидкий азот)	MVE HEco	1500-190
Холодильник (4 и °; C)	Fisher Scientific	Изотемп
Перчатки (нитрил)	Halyard	55082
Добавка GlutaMAX	Gibco	35050-061	L-аланиил-L-глутамин
HEPES (1 М)	Gibco	15630-080
Лёд (сухой)	Н.А.	Н.А.
Лёд (мокрый)	Н.А.	Н.А.
Ведро для льда	Fisher Scientific	07-210-108
Лабораторный халат (одноразовый)	Kappler	PVS112WH-MD
Лентивирусные упаковочные плазмиды	Проприетарный	Н.А.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Лентивирусные переносные плазмиды	Проприетарный	Н.А.	например, pTRPE svsNotch
Реагент для трансфекции липофектамин 3000	Инвитроген	L3000015	Коммерческий реагент для липофекции; содержит липофектамин 3000 (L3000) и его энхансерный реагент (P3000)
Магнитная подставка (большая)	Стволовые клетки	EasySep 18103	Для 5 мл/15 мл
Магнитная подставка (маленькая)	Инвитроген	DynaMag-2 12321D	Для трубок 1,5 мл
Магнитная перемешивающая планка	Fisher Scientific	14-513-82	Набор для перемешивания
Магнитная перемешивающая платформа	Thermo Scientific	S88857100
Измерительный цилиндр (100 мл)	VWR	76019-316
Вода MQ	Merck	Q-POD	Ультрапуэ; использует финальный фильтр Millipak 40 Express, 0,22 микрона (MPGP04001)
Многоканальная пипетка	Fisher Scientific	см. комментарии	30-300 и микро; L:  FBE1200300; 5-50 и микро; L:  FBE1200050
Opti-MEM (с L-глутамином, Phenol Red)	Gibco	31985-070	Минимально существенная среда с редуцированной сывороткой, используемая для трансфекции ДНК
Пенициллин-стрептомицин (10 000 U/mL, 10 000 и микро; g/mL)	Gibco	15140-122
Пипетки	Фишербранд	см. комментарии	50 мл: 13-678-11F; 25 мл: 13-678-11; 10 мл: 13-678-11E; 5 мл: 13-678-11D
Пипетки (аспираторные)	Falcon	357558	2 мл
Пипетт	Гилсон	ПИПЕТМАН P10/P20/P200/P1000
Контроллер Pipette	Хиршманн	Пипет Z314951
Кончики пипеток	Томас Сайентифик	см. комментарии	1000 и микро; L: 1159M42; 200 и микро; L: 1159M40; 20 & микро; L: 1159M43; 10 & микро; L: 1159M41
Пластиковая бутылка для хранения (500 мл)	Корнинг	430282
Реагентный резервуар	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (с L-глутамином, фенол красный)	Gibco	11875-085
Масштаб	Охаус	Пионер	Минимальная точность — 0,1 г
Фильтр Steriflip (0.45 & micro; m)	Миллипор	SE1M003M00
Synperonic F 108 (SF108)	Сигма-Олдрич	07579-250G-F	Блочный сополимер, используемый для усиления трансдукции Т-элементов
Фляга для культуры тканей — T150	Корнинг	430825
Колба для культуры тканей — T25	Корнинг	430639
Колба для культуры тканей — T75	Корнинг	430641U
Капюшон для культуры тканей	Thermo Scientific	Серия 1300 A2
Инкубатор для культуры тканей	Thermo Scientific	Heracell 150i
Пластина для культуры тканей — 6-колодец	Корнинг	3516
Пластина для культуры тканей — 96 лунок с плоским дном	Falcon	353072
Пластина для культивирования тканей — 96-колодцевая, круглая, дно и nbsp;	Falcon	353077
Трипсин-ЭДТА (0,05%)	Gibco	25300-054
Трубки — винтовые колпачки по 1,5 мл	Сарштедт	72692005
Трубки — 15 мл	Falcon	352099
Трубки — 5 мл	MSP	62-1028-2
Трубки — 500 мл	Корнинг	431123
Трубки — 50 мл	Falcon	352098
Ультрацентрифуга	Бекман Коултер	Optima XPN-100
Ультрацентрифугный ротор с ведрами	Бекман Коултер	SW 32 Ti
Ультрацентрифугные адаптеры для ламп (для конических ламп)	Seton Scientific	4230
Ультрацентрифугные трубки (конические)	Seton Scientific	5067
Вихрь	Fisher Scientific	02215414
Водяная баня (37 градусов; C)	Fisher Scientific	Изотемп 210	Используется с Lab Amor Beads (Gibco) вместо воды
X-VIVO-15	Лонза	04-418Q	Безсывороточные среды, используемые для замораживания Т-клеток