Методическая статья

Усовершенствованный аэрозольный метод доставки внутритрахеального блеомицина для воспроизводимых и малоинвазивных мышиных моделей лёгочного фиброза

DOI:

10.3791/69131

⸱

16 января 2026 г.

 ,  , 
1State Key Laboratory of Common Mechanism Research for Major Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол моделирования лёгочного фиброза у мышей с использованием аэрозольного блеомицина, доставляемого через трахею. Этот оптимизированный метод обеспечивает равномерную, количественную и точную доставку без хирургического разреза, повышая воспроизводимость и надёжность фиброза, вызванного блеомицином.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лёгочный фиброз характеризуется постепенным отложением фиброзной рубцовой ткани в паренхиме лёгких, что приводит к резкому нарушению газообмена. Он лежит в основе спектра хронических интерстициальных заболеваний лёгких, в частности идиопатического лёгочного фиброза — состояния, связанного с крайне плохим прогнозом. Учитывая отсутствие эффективных методов терапии, надёжные модели на мышях критически важны для выяснения основных патологических механизмов и оценки новых антифиброзных вмешательств. Лёгочный фиброз, вызванный блеомицином, остаётся самой широко используемой экспериментальной моделью. Распространённые методы введения у мышей включают внутривенные и внутрибрюшнические инъекции, инвазивную инстилляцию в открытую трахею и неинвазивное капельное заточение трахеи. Однако инвазивные хирургические методы часто приводят к вторичному повреждению тканей, что потенциально снижает воспроизводимость и стабильность моделей. Напротив, неинвазивное капливо трахеи обычно приводит к неравномерному распределению блеомицина по долям лёгких и создает риск удушья, что снижает воспроизводимость и увеличивает технические сложности. Для устранения этих ограничений разработан усовершенствованный аэрозольный метод внутритрахеальной подачи, который операционно проще, минимально инвазивен, высоковоспроизводимый и этически превосходен, значительно снижая страдания животных. С помощью ларингоскопа мелких животных для прямого визуализации rima glottidis в трахею вводится специализированная аэрозольная игла, значительно уже, чем диаметр трахеи мыши. Раствор блеомицина подаётся под точно контролируемым давлением, образуя мелкий аэрозоль. Это обеспечивает равномерное и эффективное распределение агента по всей паренхиме лёгких. Кроме того, можно избирательно нацеливаться на левое или правое лёгкое, направляя иглу в соответствующий бронх. Доза-ответная связь этой оптимизированной модели широко характеризуется систематическим мониторингом изменений функции лёгких, гистопатологических проявлений и содержания гидроксипролина в легких. Ожидается, что этот усовершенствованный экспериментальный протокол облегчит стандартизацию лабораторий, в конечном итоге ускоряя разработку и доклиническую валидацию новых антифиброзных терапевтических средств.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лёгочный фиброз (ПФ) — это группа летальных заболеваний, характеризующихся прогрессирующей паренхимальной болью лёгких и нарушением восстановления, из которых идиопатический легочный фиброз (ИПФ) составляет 30%–40%, медианный возраст диагностики пациентов — 65 лет, и более 80% из них — 60 лет старше 60лет. 1, 2. По мере усиления глобального старения заболеваемость IPF растет из года в год, с глобальным уровнем заболеваемости IPF от 3 до 9 на 100 000 в год, и согласно исследованию в США среди людей старше 65 лет, заболеваемость в этой популяции выросла до 93,7 на 100 000 вгод 3,4.

Первой исторически разработанной моделью легочного фиброза была модель, индуцированная блеомицином, которая часто используется в академической среде, с лучшей характеристикой и наиболее широко используемой животноймоделью в настоящее время 5, которая повторяет многие признаки ИПФ и других фиброзных ILD, включая воспаление лёгких, повреждение эпителия, пролиферацию фибробластов и чрезмерное отложение внеклеточного матрикса(ECM) 6. Кроме того, можно моделировать как острый, так и хронический лёгочный фиброз в зависимости от дозы и частоты введения блеомицина. Сообщается, что лёгкие входят в острую воспалительную фазу в течение 5-7 дней после воздействия блеомицина, за которой начинается фиброзная фаза, начинающаяся примерно на 7-й день. К 21-му дню обычно наблюдается выраженное фиброзное ремоделирование, позволяющее модели обобщать как ранний воспалительный ответ, так и позднюю стадию фиброзной патологии во временнойформе 7 (рисунок 1A). Это позволяет изучать весь процесс заболевания от начальной травмы до фиброзной стадии, что крайне важно для разработки лекарств и изучения механизмов на всех стадиях 8,9.

Маршруты моделирования блеомицина разнообразны и могут вводиться локально или системно, включая эндотрахеальные, носововые, внутривенные и внутрибрюшинные пути. Наиболее часто используется эндотрахеальная инъекция. Недостаток в том, что он создаёт разрезы у мышей, что влияет на выживаемость моделируемыхмышей 10. Позже были внесены улучшения, позволяющие использовать встроенную иглу для интубации трахеи и капельной инъекции умышей 11. Однако препарат, проталкиваемый шприцом, может распределяться в лёгких только в виде блокади, что может привести к неравномерному распределению блеомицина в каждой доле лёгких, вызывая локальную избыточную плотность и влияя на стабильность мышиной модели. Кроме того, для подачи блеомицина использовались камерные небулайзерные картриджи, но количество вдыхаемого аэрозоля блеомицина в каждой мыши невозможно точно измерить, а время одиночной индукции составляет12. Поэтому разработан усовершенствованный аэрозольный метод доставки блеомицина на основе внутритрахеального использования для воспроизводимых и малоинвазивных мышиных моделей лёгочного фиброза. Блеомицин аэрозолизируется, обеспечивая равномерное расселение и отложение в лёгких, тем самым лучше воспроизводя патологию заболеваний лёгких. Надеются, что появление этого метода ускорит исследования препаратов, способных полностью вылечить лёгочный фиброз.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных проводились в соответствии с институциональными рекомендациями, утверждёнными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC). В ходе эксперимента были внедрены соответствующие меры по благополучию животных. Для эксперимента были отобраны самцы мышей C57BL/6 возрастом от 6 до 8 недель, весом примерно 25 г. Таблица материалов содержит список всех животных, реагентов и оборудования, использованных в этом исследовании, а также их коммерческих источников.

1. Отбор животных и акклиматизация

  1. Все мыши содержатся в определённых условиях, свободных от патогенов, с 12-часовым циклом свет/темнота и импровизациям доступа к еде и воде.
  2. Привыкайте мышей к объекту в течение 5-7 дней перед запуском аэрозольной модели.

2. Приготовление раствора блеомицина

ВНИМАНИЕ: Блеомицин — цитотоксичный противоопухолевой агент. Выполняйте все действия в сертифицированном шкафу для биобезопасности, нося соответствующие средства индивидуальной защиты.

  1. Используя стерильный шприц объёмом 1 мл, извлеките 3 мл стерильного хлорида натрия 0,9% и введите его в флакон с 15 U блеомицина гидрохлорида.
  2. Аккуратно помешайте флакон до полного растворения порошка, чтобы получить настоящий раствор с концентрацией 5 U/mL.
  3. Аликота раствор в стерильные микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл. Подготовьте рабочие растворы с содержанием 3,75 U/mL и 2,5 U/mL, разбавляя стерильным физиологическим раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для мыши весом 25 г эти концентрации соответствуют дозам 7,5 U/кг и 5 U/кг соответственно. Корректируйте концентрацию, если вес мыши меняется.
  4. Храните рабочие растворы при 4 °C до 1 недели или при -80 °C до месяца. Разморозьте и доведите до комнатной температуры перед использованием.

3. Внутритрахеальная доставка блеомицина на основе аэрозолей

  1. Подготовка и применение анестезии
    1. Приготовьте рабочий раствор анестетика, растворив 0,1 г порошка пентобарбитала натрия в 10 мл стерильного физиологического физиологического раствора. Фильтр с помощью мембранного фильтра PES диаметром 0,22 мкм. Храните раствор при 4 °C в защищённой от света среде и используйте в течение 3 дней после приготовления.
    2. Вводите раствор пентобарбитала натрия через внутрибрюшинную инъекцию с использованием шприца объёмом 1 мл с иглой 26 калибра при дозе 60 мг/кг массы тела. Если глубина или длительность анестезии недостаточны, корректируйте дозу в зависимости от реакции животного под руководством лечащего ветеринара.
    3. Оцените глубину анестезии через несколько минут после инъекции, крепко защемнив палец и подтвердив отсутствие отменного рефлекса перед последующим проведением процедур.
  2. Подготовка аппарата для доставки аэрозолей
    1. Подготовьте аппарат для подачи аэрозолей, убедившись, что игла для небулайзера, шприц и столб дозировки присутствуют и стерильны (рисунок 1B).
    2. Погрузите аэрозольный шприц в стерильный физиологический раствор. Медленно вдыхайте жидкость и сделайте паузу на 8 секунд. Быстро выведите жидкость. Повторите это три раза, чтобы заполнить и промыть систему.
    3. После окончательного удаления наполните шприц физиологическим раствором. Прикрепите аэрозольную стрелку, убедившись, что соединение заполнено физиологическим раствором.
    4. Погрузите собранную иглу в физиологический раствор и повторите цикл аспирации-паузы-выведения, чтобы устранить пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения готовности выделяйте физиологический раствор на тёмном фоне. Убедитесь, что быстро выбрасывающийся физиологический раствор образует веерообразный туман на тёмном фоне.
  3. Процедура доставки внутритрахеального аэрозоля
    1. Наполните аэрозольную иглу с рабочим раствором блеомицина, вдыхая и выделяя её три раза с 8 секунд пауз.
    2. Вставьте дозировочный столб объемом 25 мкл поверх стойки 50 мкл для калибровки объёма. Аспирировать необходимый объём (50 мкл). Выведите лишнюю жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта конфигурация дозирования обеспечивает стабильную доставку, минимизируя человеческую ошибку.
    3. Поместите анестезиированную мышь на платформу для интубации, зацепив верхние резцы и закрепив конечности для стабилизации (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите ритмичные движения грудной клетки. Если животное появляется активным, введите дополнительную дозу анестетика.
    4. Используйте изогнутые щипцы, чтобы аккуратно вытащить язык. Вставьте ларингоскоп для мелких животных, чтобы обнажить гортанку (рисунок 1D).
    5. Введите аэрозольную иглу вертикально через гортанную гортанку. Быстро доставьте аэрозоль блеомицина (рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоните кончик иглы к нужному лёгкому для целенаправленной породы. Избегайте глубокого вставки, чтобы избежать травмы. Кончик иглы небулайзера должен находиться близко к точке бифуркации (первой бифуркации) трахеи мыши, но не касаться её, чтобы добиться наилучшего эффекта моделирования. Если кончик вводится только в середину трахеи, аэрозоль может попасть только в стенку трахеи, образуя крупные капли, которые откашливаются или проглатываются. Если кончик находится слишком близко к бифуркации трахеи, существует риск повреждения трахеи.

4. Восстановление после процедуры

  1. Положите мышь на подогрев, чтобы поддерживать температуру тела. Наблюдайте за мышью непрерывно, пока она не восстановится после анестезии (обычно 1-2 часа).
  2. Сделайте щипку пальца ног, чтобы проверить рефлексы и убедиться, что мышь жива.
  3. Проводите ежедневный клинический мониторинг в течение 21 дня, включая вес тела, уровень активности, уход за собой и респираторные симптомы.
  4. Эвтаназия животных при выполнении любого из следующих критериев: (i) >20% потери массы тела по сравнению с исходным уровнем до лечения, или ≥15% потери с другими клиническими признаками стресса; (ii) стойкая тяжёлая дыхательная недостаточность в состоянии покоя (затруднённое или брюшное дыхание, выраженное тахипноэ или брадипноэ, обострение носа или дыхание открытым ртом), с цианозом конечностей или без неё; (iii) неспособность получать пищу или воду, выраженную вялость или умирающий вид (отсутствие реакции на обращение и/или потерю рефлекса выпрямления); или (iv) тяжёлое обезвоживание, гипотермия или другие признаки необратимого ухудшения, по мнению лечащего ветеринара. Когда достигнут эти гуманные цели, усыпить животных передозировкой пентобарбитала натрия (≥150 мг/кг, i.p.), а затем провести вторичный физический метод (например, вывих шейки матки), чтобы обеспечить смерть и минимизировать боль и страдания.

5. Измерение терминальной функции лёгких и сбор тканей

  1. На 21-й день анестезируйте мыши 90 мг/кг того же раствора анестезии, чтобы вызвать глубокую анестезию и подавить дыхание.
  2. Подтвердите полную анестезию с помощью защемления пальца. Обнажите трахею, разрезав кожу и разделив мышцы.
  3. Сделайте небольшой скошенный разрез в трахее и введите иглу для интубации. Закрепите хирургической лигатурой.
  4. Переключите мышь на компьютерно управляемый автомат лёгких мелких животных. Инициируйте искусственную вентиляцию и убедитесь, что не спонтанное дыхание. Используйте систему ИВЛ для измерения параметров функции лёгких.
  5. Проведите правую желудочковую перфузию с помощью 5-10 мл стерильного физиологического раствора до тех пор, пока лёгкие не покажутся бланшированными.
  6. Вскрыть всё лёгкое. Зафиксируйте левое лёгкое в нейтральном буферном формалине на 24 часа.
  7. Внедрить фиксированную ткань лёгких в парафин, разрезать её и выполнить окрашивание по методу H&E, трихромное окрашивание Массона и иммуногистохимическое окрашивание для COL1A1 и α-SMA.
  8. Поместите правое лёгкое в 2 мл гомогенизационную трубку с шариками. Добавьте воду согласно протоколу комплекта гидроксипролин. Уберитесь и приступите к анализу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы предложили аэрозольный метод доставки внутрибронхиального организма для индуцирования фиброза лёгочных у мышей с помощью блеомицина. В предварительных экспериментах зелёный краситель был аэрозолен и введён в лёгкие разных мышей. Краситель показал пятнистую схему распределения по всему лёгкому, что указывает на то, что аэрозольная интрабронхиальная система позволяла равномерно распределять вещество по всем долям лёгких (рисунок 1F). Под...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании была предложена оптимизированная неинвазивная модель небулайзерной трахеи для индуцированного блеомицином лёгочного фиброза у мышей. Для обнаружения гортанки использовался ларингоскоп для маленьких животных, а в дыхательные пути мыши вводили маленькую иглю для небулайзера. Давление вручную применялось для небулайзеризации лекарства в лёгкие, что уменьшало дискомфорт и удушье, связанные с удержательной иглой, используемой при неинвазивнойинъекции 13...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано Проектом поддержки специальных фондов реформы образования и преподавания Центрального университета 2024 года (название проекта: OSF — респираторная система; Проект No2024bkjg036), Фонд инноваций в области медицинских наук Китайской академии медицинских наук (2021-I2M-1-014) и Национальный фонд естественных наук Китая (81570077). Спонсоры не участвовали в проектировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решений о публикации или подготовке рукописей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 и мю; Полиэфирсульфоновый шприцовый фильтрЦитошкиCSTPE3320
1 мл одноразовый шприцBD300481
Микроцентрифугная трубка объёмом 1,5 млServicebioEP-150-M
2,0 мл усиленной лизисной трубкиServicebioHT-200-M
4 и °; Лабораторный холодильник CМэйлинBCD-402WPCX
Коническая центрифугная трубка объёмом 50 млServicebioEP-5001-J
-80 и градус; Морозильник с ультранизкой температурой CHaier BiomedicalDW-86L828J
Абсолютный этанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092683
Кислотный дифференциационный растворServicebioG1039
Аэрозольный микрораспылитель для интубации мелких животныхShanghai Yuyan Instruments Co., LtdЯн-30012
Базовый набор хирургических инструментовShanghai Yuyan Instruments Co., LtdЯН-21А3
Раствор гидрохлорида блеомицинаФармацевтическая компания ХаньхуэйH20055883
Синий реагентServicebioG1040
Компьютерно управляемый механический аппарат лёгких мелких животныхEMKA Biotech Beijing Co., Ltd.FX-2
Электрическая изоляционная лента3M1500
Раствор для окрашивания Eosin YZhuhai Baso Biotech Co., LtdBA4022
Зелёные маркировки чернилПилотТику-рин
Раствор для окрашивания гематоксилиномServicebioG1004
Набор для количественного анализа гидроксипролинаAbcamab222941
Ламинарная вытяжкаHDLDL-CJ-1N
Ларингоскоп для процедур с мелкими животнымиShenzhen Bilead Biology Technology CO., LTDDXSHJ0
Световой микроскопNikonE100
Раствор для девоска с низкотоксичностьюServicebioG1128
Трихромный набор для окрашивания МассонаZhuhai Baso Biotech Co., LtdBA4079B
Считыватель микропластин с обнаружением поглощенияAgilentСинергия H1
Нейтральный буферизованный формалинServicebioG1101-3ML
Нейтральная монтажная средаSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Рекомбинантный моноклональный анти-COL1A1 антител RabbitХуабиоHA722517
Рефрижераторная центрифугаЭппендорф5424R
Вода без РНазыГенералбиолTYJC002
Платформа для интубации трахеи мелких животныхShanghai Yuyan Instruments Co., LtdCG-02M
Стерильный раствор хлорида натрия 0,9%China Otsuka Pharmaceutical Co., LtdH12020024
Гомогенизатор тканейServicebioKZ-III
КсилолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10023418
Шлифовальные бусины из цирконияServicebioG0203

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, J. E., Barkman, H. W., Waring, N. P. Idiopathic pulmonary fibrosis. Semin Respir Med. 5 (3), 255-263 (1984).
  2. Jo, H. E., Randhawa, S., Corte, T. J., Moodley, Y. Idiopathic pulmonary fibrosis and the elderly: diagnosis and management considerations. Drugs Aging. 33 (5), 321-334 (2016).
  3. Raghu, G., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis in US Medicare beneficiaries aged 65 years and older: incidence, prevalence, and survival, 2001-11. Lancet Respir Med. 2 (7), 566-572 (2014).
  4. Hutchinson, J., Fogarty, A., Hubbard, R., McKeever, T. Global incidence and mortality of idiopathic pulmonary fibrosis: a systematic review. Eur Respir J. 46 (3), 795-806 (2015).
  5. Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Exp Lung Res. 41 (2), 57-73 (2015).
  6. Horowitz, J. C., Thannickal, V. J. Epithelial-mesenchymal interactions in pulmonary fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 27 (6), 600-612 (2006).
  7. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83 (3), 111-119 (2002).
  8. Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Biochem Cell Biol. 40 (3), 362-382 (2008).
  9. Peng, R., et al. Bleomycin induces molecular changes directly relevant to idiopathic pulmonary fibrosis: a model for "active" disease. PLoS One. 8 (4), e59348(2013).
  10. Gul, A., et al. Pulmonary fibrosis model of mice induced by different administration methods of bleomycin. BMC Pulm Med. 23 (1), 91(2023).
  11. Barbayianni, I., Ninou, I., Tzouvelekis, A., Aidinis, V. Bleomycin revisited: A direct comparison of the intratracheal micro-spraying and the oropharyngeal aspiration routes of bleomycin administration in mice. Front. Med. (Lausanne). 5, 269(2018).
  12. Song, D., et al. A mouse model of pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization. J. Vis. Exp. (191), e64097(2023).
  13. Li, W., Hu, Y., Yuan, W., Li, L., Huang, W. Comparison of two mouse models of lung fibrosis induced by intratracheal instillation and intratracheal aerosol administration of bleomycin. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 32 (2), 221-225 (2012).
  14. Meng, J., Peng, Z., Tao, L. Murine pulmonary fibrosis model induced by repeated low-dose intravenous injection and intratracheal instillation of bleomycin. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 38 (12), 1228-1232 (2013).
  15. Kadam, A. H., Schnitzer, J. E. Highly calibrated relationship between bleomycin concentrations and facets of the active phase fibrosis in classical mouse bleomycin model. Int J Mol Sci. 25 (22), (2024).
  16. Orlando, F., et al. Induction of mouse lung injury by endotracheal injection of bleomycin. J Vis Exp. (146), e58922(2019).
  17. Morita, S., et al. Establishment of a stem cell administration imaging method in bleomycin-induced pulmonary fibrosis mouse models. Sci Rep. 14 (1), 18905(2024).
  18. Olsson, I. A., Hansen, A. K., Sandoe, P. Ethics and refinement in animal research. Science. 317 (5845), 1680(2007).
  19. Jenkins, R. G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 56 (5), 667-679 (2017).
  20. Degryse, A. L., et al. Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299 (4), L442-L452 (2010).
  21. Li, Q., et al. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis and resolution in bleomycin-induced pulmonary fibrosis mouse model revealed by spatial transcriptome analysis. Heliyon. 9 (12), e22461(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи