Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мониторинг динамики подкожной соединительной ткани, вызванной иглоукалыванием, в подкожной соединительной ткани в режиме реального времени с помощью лазерной конфокальной визуализации in vivo

560 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69173

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, Jianghan University, 2School of Medicine, Jianghan University, 3Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование устанавливает лазерную конфокальную визуализацию in vivo в качестве метода отслеживания в реальном времени морфологической динамики, вызванной иглоукалыванием, такой как вазодилатация и ремоделирование коллагена, у живых крыс. Используя флуоресцеиновое мечение натрия, этот подход фиксирует как немедленные, так и отсроченные реакции тканей, предлагая новый инструмент для количественной оценки физиотерапии, включая иглоукалывание и прижигание.

Аннотация

Динамический мониторинг эффектов иглоукалывания в режиме реального времени имеет решающее значение для выяснения его биологических механизмов, однако традиционные гистологические методы не в состоянии зафиксировать переходные реакции в живом микроокружении. Здесь мы создали методологическую основу, основанную на лазерной конфокальной визуализации in vivo , что позволяет в режиме реального времени наблюдать за морфологическими изменениями в местных тканях после иглоукалывания. После внутривенного введения флуоресцеина натрия крысам отслеживались динамические изменения в микроциркуляции и внеклеточном матриксе (например, расположение коллагеновых волокон) во время иглоукалывания. Результаты показали, что этот метод четко различает немедленные (например, вазодилатация) и отсроченные (например, воспалительная реакция) тканевые реакции, индуцированные иглоукалыванием, с пространственным разрешением 0,5 мкм и временным разрешением 3,5 кадра в секунду. Последующий количественный анализ позволил объективно измерить морфологические параметры. Этот протокол, описанный в данном исследовании, предоставляет инструмент визуализации для изучения in vivo механизмов иглоукалывания и служит техническим справочником для оценки эффектов других физических стимулов (например, прижигания).

Введение

Иглоукалывание, являясь краеугольным камнем традиционной медицины, оказывает терапевтическое воздействие посредством сложных реакций на уровне тканей 1,2,3,4. Тем не менее, механистические представления остаются ограниченными традиционной гистологией, которая фиксирует статические снимки, но не в состоянии определить динамику морфологических адаптаций в реальном времени (например, вазомодуляция, ремоделирование внеклеточного матрикса) в живых тканях5. В то время как прижизненная микроскопия обладает динамическим потенциалом визуализации, ее применение в исследованиях иглоукалывания ограничено, особенно для количественной оценки пространственно-временных реакций на физические стимулы 6,7. В отличие от этого, этот подход к конфокальной визуализации позволяет количественно извлекать структурные и динамические параметры, такие как скорость изменения скорости движения эритроцитов и расположение коллагена, в глубоких тканях (например, мышечных слоях и акупунктурных точках ST 36/GB 34), преодолевая ограничения традиционной прижизненной микроскопии в пространственном разрешении, объемной визуализации и долгосрочномотслеживании.

Лазерная конфокальная визуализация стала мощным инструментом для визуализации in vivo с клеточным разрешением 9,10,11,12,13. Тем не менее, существующие исследования в основном сосредоточены на поверхностных тканях (например, коже или роговице), и лишь немногие из них направлены на цели глубокой акупунктуры или интегрируют количественный морфологический анализ. Важно отметить, что, насколько нам известно, не существует стандартизированной методологии, позволяющей соотнести манипуляции с иглоукалыванием с кинетическими изменениями живых тканей.

В этой статье мы восполняем этот пробел, создавая методологическую платформу на основе конфокальной визуализации для отслеживания морфологических событий, вызванных иглоукалыванием, в режиме реального времени. Используя флуоресцеин натрия (вводимый внутривенно в концентрации 1% концентрации, 0,1 мл/100 г массы тела) в качестве контрастного вещества, мы достигаем мониторинга с высоким разрешением (0,5 мкм пространственное/3,5 кадра в секунду по времени) микроциркуляторных и матриксных изменений в поле зрения 450 мкм × 450 мкм на глубине до 400 мкм - от немедленной вазодилатации до отсроченных воспалительных каскадов - во время стимуляции иглоукалыванием. Этот подход также позволяет проводить 3D-реконструкцию и количественное определение параметров выравнивания коллагеновых волокон, преодолевая ограничения гистологии конечных точек.

Практические соображения по реализации данного протокола заключаются в следующем: (i) рекомендуемое аппаратное обеспечение включает конфокальную систему с разрешением ≥0,5 мкм и скоростью регистрации ≥3 кадра в секунду, (ii) типичные ограничения включают фотообесцвечивание более 90 с непрерывной визуализации и чувствительность к движению дыхательных путей или тканей, и (iii) глубина проникновения может быть снижена в высокоплотных или рассеивающихся тканях. Насколько нам известно, эта работа не только предоставляет первый динамический атлас реорганизации тканей, вызванной иглоукалыванием, но и создает прецедент для оценки физических терапий (например, прижигания) в живых системах. Преобразуя переходные физиологические реакции в количественные показатели, мы предлагаем новую парадигму для механистических исследований нейромодулирующей терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Института акупунктуры и прижигания Китайской академии медицинских наук Китая (No D2023-01-29-01). Восемь самцов крыс породы Sprague Dawley (SD) (в возрасте 8 недель, 200-220 г) были получены компанией Biotechnology Co., Ltd. (лицензия No. SCXK (Jing) 2020-0001). Животные содержались в стерилизованных изоляционных вольерах в контролируемых условиях: 12-часовой цикл «свет-темнота», температура 21 ±± 2 °C, с неограниченным доступом к стандартным гранулам корма и воде. Все эксперименты проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию.

ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема, показывающая основные процедуры, показана на рисунке 1.

1. Препарат животного и индикатора: флуоресцеин натрия (ФС)

  1. Для приготовления 1% раствора для окрашивания флуоресцеина натрия (ФС) растворите 0,1 г ФС в 10 мл стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl). Храните раствор при комнатной температуре (RT) для последующего использования.
  2. Обезболивайте крыс с помощью индукции изофлурана (индукция: 5% изофлуран, поддерживающая терапия: 2,5% изофлуран). Удалите волосы в области черепа (за исключением головы) с помощью электрической машинки для стрижки, затем нанесите крем для депиляции на 5 минут. Удалите остатки крема и волос, смыв теплой водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите лезвие машинки для стрижки параллельно поверхности кожи во время работы, чтобы предотвратить повреждение кожи, которое может поставить под угрозу количественный анализ визуализации. Для ополаскивания необходимо строго использовать теплую воду, чтобы избежать переохлаждения животных, влияющего на результаты эксперимента.

2. Введение ФС

  1. Обезопасьте крысу.
    1. Обезболивание крыс с удаленным волосом путем внутрибрюшинной инъекции 10% уретана (1 г/10 мл в физрастворе) в дозировке 1,0 г/кг.
    2. По достижении полной анестезии закрепите животных в лежачем положении на операционной платформе. С помощью щипцов аккуратно защипните заднюю лапу и наблюдайте за отсутствием рефлекса отмены. Проверьте потерю роговичного рефлекса, слегка коснувшись роговицы влажным ватным наконечником.
    3. Перед началом процедуры убедитесь в устойчивом отсутствии реакции и стабильной частоте дыхания. Во время анестезии поддерживайте температуру тела животного с помощью грелки 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная анестезия должна быть подтверждена, чтобы предотвратить непроизвольные движения, которые могут поставить под угрозу перемещение окна визуализации.
  2. Внутривенно ввести 1% раствор ФС через хвостовую вену в дозировке 0,1 мл на 100 г массы тела.
    1. Выполните инъекцию в хвостовую вену с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 27 G. Осторожно протрите хвост теплой водой, чтобы способствовать расширению сосудов, с последующей дезинфекцией 70% этанолом.
    2. Вставьте иглу скосом вверх под небольшим углом (≤15°) вдоль продольной оси вены. Вводите раствор медленно со скоростью 0,1-0,2 мл/мин.
    3. Обеспечить отсутствие технического сопротивления потоку, отсутствие периваскулярного отека, а также подтвердить успешную инъекцию путем желтого обесцвечивания зрачков, ушных раковин и лап.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует строго избегать случайных внутриартериальных инъекций.

3. Настройка зондовой конфокальной лазерной эндомикроскопии (pCLE) in vivo

  1. Активируйте систему pCLE и проверьте чистоту разъема сканирующего датчика и дистального наконечника.
  2. Очистите дистальный кончик зонда (также называемый наконечником для сканирования) с помощью ватного тампона, смоченного физиологическим раствором, затем аккуратно вытрите насухо хрусталиком.
  3. Расположите лазерный зонд в месте наблюдения за целью (например, в медиальной области бедра). Закрепите зонд конфокальной визуализации с помощью регулируемого зажима, обеспечивающего стабильный контакт с поверхностью ткани без артефактов сжатия, и зафиксируйте его, затянув регулировочную ручку.
  4. Подключите зонд к системе pCLE и настройте параметры сбора данных (например, поле зрения [FOV], каталог хранения). В этом эксперименте использовались следующие конкретные параметры:Глубина: 18 мкм; Лазер: 219 мВт; Яркость: 76%; Скорость: 1920 × 540; Прирост: 2400; Увеличение: 1× (464 мкм); Фильтр: LP 515; Таблица поиска: Серое сканирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры визуализации (глубина сканирования/мощность лазера) были итеративно оптимизированы до тех пор, пока не была достигнута четкая визуализация архитектуры ткани. Постоянная интенсивность имеет решающее значение для сопоставимости продольных изображений. Добавление капель физиологического раствора с температурой 37 °C на границе зонда-ткани устраняло потерю сигнала, наблюдаемую в начальных итерациях. Мощность лазера, использованного в этом исследовании, ниже общепринятого порога фототоксичности при конфокальной визуализации in vivo .

4. Визуализация организационной структуры с помощью pCLE и сбора данных

  1. Расположите зонд на поверхности кожи и начните сбор данных для визуализации архитектуры ткани.
    1. Держите щуп в виде карандаша; Переместите его к целевым областям (например, к областям с сосудистой или фиброзной соединительной тканью в поле зрения), поместите дистальный кончик непосредственно в зону визуализации, а затем стабилизируйте с помощью щупа.
  2. Сначала необходимо получить исходную тканевую архитектуру в течение 1 минуты в физиологических условиях, а затем в течение 5 минут во время иглоукалывания. Прекратите приобретение после вмешательства. Файлы данных автоматически сохраняются в директорию, указанную в шаге 3.3-3.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы сохраняются в виде стеков слоев (.tiff) и отдельных кадров (.tiff).

5. Иглорефлексотерапия

ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор данных на этапе визуализации выполняется во время вмешательства.

  1. Вставьте одноразовую иглу из нержавеющей стали в 1 цунь (китайская единица измерения длины составляет примерно 13 мм) в акупунктурную точку, прилегающую к ткани, за которой проходит зондирование. Подсоедините один провод к игле из нержавеющей стали, а другой закрепите электрод сравнения на хвосте крысы.
  2. Применяют стимуляцию электроакупунктурой (ЭА) с использованием следующих параметров: интенсивность 1 мА, плотно-дисперсная волна (2/15 Гц), в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте достаточное расстояние (>3 мм) между местом введения иглы и зондом, чтобы предотвратить вызванный ЭА кожный тремор, который нарушает стабильность изображения.

6. Анализ изображений

  1. Откройте полученные стеки изображений в ImageJ. Преобразуйте пространственную калибровку в микрометры и преобразуйте формат изображения в 8-битный для совместимости с плагинами (Image > Type > 8-бит).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры изображения по умолчанию указаны в дюймах (настройка для конкретной системы).
  2. Определите область интереса (ROI) для: микроциркуляции: одного капиллярного сегмента, структуры матрицы: области коллагеновых волокон. Поддерживайте одинаковые показатели ROI для последовательных изображений для обеспечения продольной согласованности.
  3. Анализ микроциркуляции
    1. Выберите область, содержащую эритроциты, которые необходимо осмотреть, и обрежьте изображение, чтобы удалить другие мешающие области (Прямоугольник > Изображение > Кадрирование). Используйте инструмент порога для сегментации исключительно эритроцитов (эритроцитов) (Изображение > Настройка > помощью инструмента Порог).
    2. Загрузите плагин MTrack2 . Установите подходящие параметры слежения в зависимости от размера эритроцитов (в данном эксперименте 10-42 пикселя), чтобы исключить помехи и обеспечить точное отслеживание эритроцитов (Плагин > Tracking > MTrack2).
  4. Матричный структурный анализ
    1. Загрузите плагин «Направленность», выберите режим «Компоненты Фурье» и выполните статистический анализ доли распределения коллагеновых волокон в ориентации от 0° до 180° (Анализ направленности >).

7. Доработка данных

  1. Экспортируйте проанализированные данные в форматы TIFF/XSL, используя соглашение об именовании: [Group]_[Date].extension. Резервное копирование всех необработанных и обработанных файлов на назначенный защищенный сервер. Записывайте количественные результаты в сводную таблицу для статистического анализа.

8. Безопасность и обращение с отходами

  1. Средства индивидуальной защиты (СИЗ): Надевайте нитриловые перчатки, лабораторный халат и защитные очки при работе с уретаном, изофлураном или флуоресцеином натрия.
  2. Обращение с анестезией: Выполняйте процедуры с использованием уретана или изофлурана в вытяжном шкафу, чтобы свести к минимуму воздействие при вдыхании.
  3. Меры предосторожности при обращении с острыми предметами: Немедленно утилизируйте все иглы и острые предметы в специально отведенных контейнерах для острых предметов, устойчивых к проколам.
  4. Безопасность электроакупунктуры (ЭА): проверьте электрическую изоляцию оборудования ЭА и обеспечьте надежное подключение проводов для предотвращения токов утечки или короткого замыкания.
  5. Утилизация отходов: Выбрасывайте бутылки с изофлураном как медицинские отходы в соответствии с рекомендациями учреждения. Утилизируйте загрязненные красителями материалы (например, тампоны, салфетки) отходы в герметичных контейнерах для опасных отходов. Собирайте острые предметы в сертифицированных ящиках для утилизации острых предметов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны соответствовать правилам безопасности и гигиены окружающей среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол демонстрирует полезность pCLE для динамической оценки влияния иглоукалывания на микроциркуляцию и архитектуру внеклеточного матрикса в режиме реального времени. После внутривенного введения флуоресцеина натрия через хвостовую вену изменения оценивали путем наблюдения за изменениями скорости эритроцитов в локальных капиллярах и реорганизацией расположения коллагеновых волокон.

Репрезентативные результаты через 5 мин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как показано в результатах, протокол конфокальной визуализации in vivo , разработанный в этом исследовании, позволяет проводить одновременный количественный анализ динамики микроциркуляторного и внеклеточного матрикса во время акупунктурного вмешательства с использованием стандартного коммерчески доступного оборудования и рутинной флуоресцентной маркировки. Успех этого протокола зависит от двух важнейших этапов: точного времени введения флуоресцеина натрия, обеспечивающего устой...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данное исследование финансировалось Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2024YFA1209900, 2024YFA1209903, 2024YFA1209904); Специальные фонды Национального фонда естественных наук Китая (82050006); Исследовательский проект ТКМ Управления медицины ТКМ провинции Хубэй (ZY2025Z015); Исследовательский фонд Цзянханьского университета (2024JCYJ13).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 игла для акупунктуры CUNХвато, Сучжоу, КитайН/Д13 мм/0,25 мм
10% флуоресцеина натрияGuangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd, КитайH45021477
Аппарат для анестезии животныхRWD, Шэньчжэнь, КитайР620ИЭ
Монитор температуры телаRWD, Шэньчжэнь, Китай69026
Аппарат электроакупунктурыХвато, Сучжоу, КитайСДЗ-III
Крем для эпиляцииВет, Франция
ИзображениеJНациональные институты здравоохранения, СШАhttps://imagej.nih.gov/ij/
Зондовая конфокальная лазерная эндомикроскопия in vivoOptiscan, АвстралияПросмотрVivoB30Диаметр: ручной жесткий щуп 4 мм, устойчивый к изгибу и сохраняющий структурную целостность в течение долгого времени. Длина: ≥ 46 мм. Режим сканирования: возможность сканирования с увеличением.
ИзофлуранRWD, Шэньчжэнь, Китай<чел/> R510-22-16
УретанСигма-Олдрич, США94300

Ссылки

  1. Mo, Y., et al. Acupuncture as adjunctive treatment for linezolid-induced peripheral neuropathy: a case series report. Front Neurol. 21 (15), 1388544(2024).
  2. Roynard, P., Frank, L., Xie, H., Fowler, M. Acupuncture for small animal neurologic disorders. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 48 (1), 201-219 (2018).
  3. Zhou, L., Li, X., Ao, J., Duan, N. Acupuncture and cellular mechanisms: the role of foxo transcription factors in autophagy and senescence. J Pak Med Assoc. 74 (12), 2150-2154 (2024).
  4. Chen, Y., Zhang, F., Zheng, P., Cui, D., Fan, X. Postpartum stress urinary incontinence: current advances in non-pharmacological therapies. Arch Esp Urol. 78 (1), 1-9 (2025).
  5. Dietel, M. 20 years of pathology: from conventional histology to next-generation pathology. Pathologie. 45 (3), 167-172 (2025).
  6. Cao, L., Kobayakawa, S., Yoshiki, A., Abe, K. High resolution intravital imaging of subcellular structures of mouse abdominal organs using a microstage device. PLoS One. 7 (3), e33876(2012).
  7. Vaghela, R., Arkudas, A., Horch, R. E., Hessenauer, M. Actually seeing what is going on-intravital microscopy in tissue engineering. Front Bioeng Biotechnol. 9 (17), 627462(2021).
  8. Zhang, H., He, Z., Jin, Z., Yan, Q., Wang, P., Ye, X. The development and clinical application of microscopic endoscopy for in vivo optical biopsies:endocytoscopy and confocal laser endomicroscopy. Photodiagnosis Photodyn Ther. 38, 102826(2022).
  9. Streba, C. T., et al. Utility of confocal laser endomicroscopy in pulmonology and lung cancer. Rom J Morphol Embryol. 57 (4), 1221-1227 (2016).
  10. Chaw, S. Y., Wong, T. T. L., Venkatraman, S., Chacko, A. M. Spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy. J Vis Exp. (175), e62685(2012).
  11. Tian, S., et al. The role of confocal laser endomicroscopy in pulmonary medicine. Eur Respir Rev. 32 (167), 220185(2023).
  12. Villard, A., et al. Confocal laser endomicroscopy and confocal microscopy for head and neck cancer imaging: recent updates and future perspectives. Oral Oncol. 127, 105826(2022).
  13. Sievert, M., et al. Systematic interpretation of confocal laser endomicroscopy:larynx and pharynx confocal imaging score. Acta Otorhinolaryngol Ital. 42 (1), 26-33 (2022).
  14. Ren, W., et al. Expanding super-resolution imaging versatility in organisms with multi-confocal image scanning microscopy. Natl Sci Rev. 11 (9), nwae303(2024).
  15. Xia, Q., Li, D., Yu, T., Zhu, J., Zhu, D. In vivo skin optical clearing for improving imaging and light-induced therapy: a review. J Biomed Opt. 28 (6), 060901(2023).
  16. Zhang, C., Feng, W. Assessment of tissue-specific changes in structure and function induced by in vivo skin/skull optical clearing techniques. Lasers Surg Med. 54 (3), 447-458 (2022).
  17. Leal-Campanario, R., Martinez-Conde, S., Macknik, S. L. In vivo fiber-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) of hippocampal capillaries in awake mice. J Vis Exp. (194), e57220(2023).
  18. Huo, Z. J., et al. The ameliorating effects of long-term electroacupuncture on cardiovascular remodeling in spontaneously hypertensive rats. BMC Complement Altern Med. 14, 118(2014).
  19. Yunshan, L., Chengli, X., Peiming, Z., Haocheng, Q., Xudong, L., Liming, L. Integrative research on the mechanisms of acupuncture mechanics and interdisciplinary innovation. Biomed Eng Online. 24 (1), 30(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Динамика иглоукалываниявизуализация in vivoизменения микроциркуляциирасположение коллагеновых волоконвнеклеточный матрикссосудистая реакция вазодилатацииколичественная морфология
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.