Методическая статья

Диссекция мышц непрямого полета Drosophila melanogaster для микроскопических подходов

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69185

⸱

7 ноября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

В этой статье

Краткое содержание

Дрозофила является мощной моделью для понимания фундаментальных механизмов миогенеза. Этот протокол для пресечения и подготовки полусекций грудной клетки позволяет проводить микроскопический анализ непрямых летательных мышц как на стадии куколки, так и на взрослой стадии. Этот протокол позволяет конфокальную визуализацию клеточной морфологии, локализации белка, структуры мышц и многих других аспектов миогенеза.

Аннотация

Мышцы непрямого полета (IFM) Drosophila melanogaster являются мощной генетической моделью для изучения основополагающих принципов миогенеза. Сократительный механизм и многие компоненты саркомеров сохраняются от мух до позвоночных, что позволяет изучать клеточные процессы от регуляции транскрипции и процессинга РНК до метаболизма и механобиологии, которые направляют и тонко настраивают развитие мышц. Многие из этих клеточных путей изменяются при миопатиях человека, и исследования IFM дают соответствующее представление о молекулярной этиологии мышечных заболеваний. В частности, мухи хорошо подходят для микроскопии для анализа морфологии и функционирования миофибры и саркомеров на протяжении всего процесса миогенеза IFM, от спецификации миобласта до формирования, созревания и поддержания миофибриллы. В данной работе представлен протокол препарирования ИФМ D. melanogaster в точках куколки и взрослого человека для микроскопических подходов. Представлены иллюстрированные протоколы для вскрытия гемиторакса поздних куколок и взрослых ИФМ, а также для вскрытия ранних куколок с открытой книгой. Описаны процедуры фиксации, окрашивания и монтирования образцов, а также распространенные артефакты диссекции, а репрезентативные данные демонстрируют совместимость инсекционирования IFM с различными реагентами для фиксации. Эти протоколы применяются для изучения гипоморфного аллеля SmnE33 РНК-связывающего белка выживания моторного нейрона (Smn) через 26 ч после образования пупария (APF), через 72 ч APF и у взрослых ИФМ, что дает новое представление о модели спинальной моторной атрофии (СМА) и иллюстрирует общую полезность этого протокола. Этот подробный протокол облегчает доступ к модельной системе IFM и получение высококачественных данных микроскопии для исследования принципов миогенеза.

Введение

У животных есть сотни мышц, которые контролируют различные движения, от передвижения до облегчения речи и хватания инструмента. Чтобы поддерживать такой широкий спектр функций, мышцы различаются по размеру, прикреплению, сократительной способности, метаболизмуи экспрессии генов. Основное внимание в области биологии мышц уделяется пониманию того, как эти структурные и функциональные различия возникают во время развития и изменяются при мышечных заболеваниях. Сокращение мышц обеспечивается саркомерами, построенными из актинсодержащих тонких нитей, закрепленных на Z-диске, которые соединяются с биполярными миозинсодержащими толстыми филаментами, закрепленными на М-линии3. Саркомеры организованы из конца в конец в миофибриллы, и это регулярное расположение в поперечнополосатых мышцах проявляется в виде чередующихся светлых и темных полос подмикроскопом, что обеспечивает практический визуальный метод для мониторинга изменений в сборке и организации саркомеров. В сочетании с генетическими и биохимическими подходами микроскопия позволила получить важную информацию о клеточных процессах, таких как регуляция транскрипции, процессинг РНК, метаболизм и механотрансдукция 5,6,7, которые инструктируют и тонко настраивают развитие и функцию мышц. Многие из этих клеточных процессов нарушаются при миопатиях и нервно-мышечных расстройствах человека 8,9, что подчеркивает важность понимания развития мышц для получения представления об этиологии мышечных заболеваний. Достижения в области генной инженерии, позволяющие манипулировать отдельными клетками и эндогенное мечение белков10,11 в сочетании с технологическими достижениями в получении изображений и разрешении12,13 обеспечивают непреходящее значение микроскопии для исследования мышц. Таким образом, модельные системы с четкими и легко реализуемыми протоколами рассечения мышц и подготовки образцов имеют ценность в мышечной области.

Мышцы непрямого полета (ИФМ) D. melanogaster являются мощной и хорошо охарактеризованной моделью для изучения основных принципов миогенеза8. IFM состоят из шести дорсально-продольных мышц (DLM) на гемиторакс, которые формируются на матрицах личиночных мышц, и семи дорсально-вентральных мышечных волокон (DVM), которые строятся de novo вовремя развития куколки. Из-за их доступности вблизи средней линии, многие исследования IFM сосредоточены на DLM, самой большой мышце у взрослых мух, охватывающей всю длину 1 мм грудной клетки15. В начале окукливания миобласты IFM мигрируют из своей ниши на шарнире диска крыла в грудную клетку, где они сливаются, образуя синцитиальные миотрубки16. После прикрепления сухожилий около 24 ч APF при 27 °C миоволокна IFM постепенно организуют свою цитоплазму и цитоскелет, уплотняются и инициируют миофибриллогенез с 30-32 ч APF17. К миофибриллам добавляются новые саркомеры, и миоволокна растут, заполняя грудную клетку примерно до 48 ч APF. Затем ИФМ подвергаются процессу созревания, согласующемуся с изменениями как в транскрипции, так и в сплайсинге, что способствует приобретению метаболических и сократительных свойств взрослого человека, а также активации растяжения18. Взрослые мухи удаляются от куколки между 90 ч и 100 ч APF при 27 °C и примерно через 100 ч APF (самки около 98 ч APF и самцы около 102 ч APF) при 25 °C19. ИФМ – это универсальная и актуальная модельная система. Они могут контролироваться на всех стадиях миогенеза, морфологически и функционально отличаются от других типов миоволокон у мухи и извлекают выгоду из широкого ассортимента доступных генетических инструментов и подходов к манипулированию 8,20. Сократительный механизм, базовая морфология саркомеров и многие структурные компоненты сохраняются от мух допозвоночных5, что позволяет транслировать миогенные принципы от мух к человеку. Действительно, модели нервно-мышечных заболеваний, таких как миотоническая дистрофия, спинальная моторная атрофия (СМА), миофибриллярные миопатии и актинопатии, предоставили этиологические и терапевтические представления21,22. Примечательно, что мухи хорошо подходят для микроскопии для анализа морфологии миофибры и саркомеров на протяжении всего миогенеза, от спецификации миобласта до миофибриллогенеза и созревания и поддержания саркомеров.

IFM дрозофилы используются в микроскопии уже более четырех десятилетий, внося большой вклад в понимание роста и развития мышц8. В течение этого времени протоколы препарирования IFM постоянно адаптировались по мере развития технологий, что привело к широкому спектру протоколов, представленных с различными уровнями детализации, которые являются оптимальными для одних и неоптимальными для других методов визуализации. Например, протоколы, разработанные для электронной микроскопии, предполагают строгие условия фиксации, ультратонкие срезы и контрастное окрашивание тяжелыми металлами 3,23,24,25, но не являются оптимальными для световой микроскопии. Протоколы, разработанные для быстрого препарирования ИФМ из грудной клетки для использования в биохимических анализах или молекулярных анализах 26,27, теряют тканевый контекст и могут нарушить структуру миофибриллы, и поэтому являются неоптимальными для микроскопии. Диссекционные подходы были разработаны для анализа личиночной мышцы или взрослой мышцы брюшной полости20,28, но не являются оптимальными для выделения интактных ИФМ. Подходы к визуализации в реальном времени требуют либо минимально инвазивных диссекций, либо специальных сред для сохранения жизнеспособности ткани IFM во время процесса визуализации29,30 и не включают в себя этапы фиксации, необходимые для сохранения мышц для иммуногистохимии. Существует несколько протоколов для встраивания парафина или криосреза тканей IFM, совместимых с гистохимией или окрашиванием антителами 27,31,32, но эти подходы обычно включают замораживание и обезвоживание тканей, которые могут изменить ультраструктуру мышц и ограничить распознавание определенных антигенов первичными антителами. Протоколы, которые непосредственно фиксируют ИФМ, сохраняют морфологию мышц и ограничивают изменения в конформации антигена и являются желательными длямногих иммуногистохимических экспериментов. Тем не менее, эти протоколы также нацелены на конкретные приложения, например, протоколы диссоциации ИФМ, позволяющие проводить анализ одного миофибрилла с помощью флуоресценции, криоЭМ или микроскопии сверхвысокого разрешения 20,33,34. Другие примеры включают протоколы для препарирования интактных волокон IFM из грудной клетки32,35 или для получения цельных или гемитораксовых препаратов 20,32,36, которые позволяют анализировать как миоволокна, так и саркомеры в интактном контексте. Новому пользователю может быть сложно разобраться в большом количестве существующих протоколов, большинство из которых основаны на тексте. Стажеры и исследователи из числа студентов получат пользу от подробного протокола препарирования IFM применительно к стандартным приложениям иммуногистохимии.

Данная статья включает в себя серию протоколов по препарированию и получению МФМ D. melanogaster на куколке и взрослой стадии для подходов иммуногистохимической микроскопии. Этот подход был использован в недавних публикациях, отслеживающих функции развития РНК-связывающих белков Bruno137 и Rbfox138 на протяжении миогенеза IFM. Протокол включает в себя подробные иллюстрации и пошаговые изображения, чтобы помочь потенциальным пользователям при рассечении гемиторакса взрослого человека и поздней куколки (от 48 ч до 96 ч APF) IFM, при котором грудная клетка рассекается пополам по средней линии, сохраняя структуру миоволокна нетронутой. Кроме того, этот протокол охватывает рассечение открытой книги на ранних стадиях куколки (от 8 ч до 48 ч APF), при котором вентральная часть грудной клетки разрезается и приподнимается, как при вскрытии книги, чтобы обнажить неповрежденные ИФМ, прикрепленные к дорсальному эпидермису. Дальнейшие шаги в протоколе включают фиксацию, окрашивание и монтирование образцов, и репрезентативные данные демонстрируют, что этот подход совместим с различными методами фиксации для подготовки тканей к иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии. Репрезентативные примеры приводятся для того, чтобы помочь новым пользователям в выявлении распространенных артефактов препарирования. Протокол применяется для анализа фенотипа развития ИФМ SmnE33, гипоморфного аллеля выживаемого моторного нейрона (Smn), используемого в качестве модели спинальной моторной атрофии (СМА) у мухи, через 26 ч APF, 72 ч APF и у взрослых ИФМ. Представленные здесь данные дают представление о мышечно-специфической функции Smn и подчеркивают применимость этого протокола диссекции для изучения развития мышц и этиологии мышечных заболеваний.

Протокол

Этическое заявление:
Во всех экспериментах по этому протоколу используется Drosophila melanogaster, голометаболическое насекомое. Беспозвоночные не подпадают под действие правил благополучия животных в Соединенных Штатах Америки, и их использование не требует этического одобрения. Все работы проводились в соответствии со стандартными рекомендациями по институциональной биобезопасности и лабораторной безопасности и были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Миссури в Канзас-Сити под номером протокола 21940 (22-11).

1. Вскрытие гемиторакса у взрослого ИФМ (Рисунок 1)

  1. Соберите необходимые принадлежности, в том числе два щипца Dumont #5 с биологическими наконечниками, щипцы Dumont #3, пружинные ножницы Vannas, пластиковую пипетку, кисть для рисования, 24-луночную пластину, безворсовые салфетки, предметное стекло для микроскопа и лезвия криостата (см. Таблицу материалов). Приготовьте 1x PBS, 0,05% PBS-T и фиксирующие растворы (см. Дополнительный файл 1). Доступен обзор блок-схемы следующих операций вскрытия гемиторакса у взрослых (дополнительный рисунок 1).
  2. Соберите взрослых особей нужного генотипа и возраста (например, только что выселенные, 1-дневная взрослая особь или 5-дневная взрослая особь). Обезболите образец мух наСО2 или льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи, используемые в этом протоколе, выращивались в течение 12-часового цикла день: 12-часовая ночь в инкубаторе с контролируемой температурой и влажностью. Дрозофилы обычно выращиваются при температуре 25 °C или 27 °C, а могут выращиваться при 18 °C, что продлевает цикл роста с 10 дней до примерно 20 дней.
  3. С помощью пластиковой пипетки перенесите каплю 1x PBS40 на предметное стекло микроскопа под стереоанализирующим микроскопом.
  4. Перенесите образец мухи в каплю PBS небольшими группами с помощью малярной кисти или щипцов (рисунок 1А). Удалите голову (рисунок 1B), крылья (рисунок 1C - D) и брюшную полость (рисунок 1E) с помощью пружинных ножниц Vannas. Оставьте ноги прикрепленными (рисунок 1F).
  5. Аккуратно перенесите грудные клетки с помощью кисти или щипцов в 500 мкл фиксирующего раствора в одну лунку 24-луночного планшета. Зафиксируйте на желаемое время (обычно 15-60 минут) на нутаторе/качающемся шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол совместим с несколькими фиксирующими буферами, включая параформальдегид, глутаральдегид, метанол, раствор глиоксаля и другие. Для получения подробной информации об оптимизации условий фиксации см. Репрезентативные результаты и Дополнительный файл 1 . С фиксаторами следует обращаться в перчатках и соответствующих средствах индивидуальной защиты (СИЗ) в соответствии с рекомендациями вашего учреждения по использованию опасных химических веществ.
  6. Снимите фиксатор с помощью пипетки объемом 200 мкл и промойте 1 мл 0,05% PBS-T на нутаторе/качающемся шейкере в течение 5 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте фиксатор в соответствии с рекомендациями учреждения по опасным химическим веществам. Для большинства антигенов фиксированные тораки могут храниться в 1 мл 0,05% PBS-T до 2 недель при 4 °C перед разрезанием и окрашиванием. Перед использованием следует протестировать более высокие концентрации Triton X-100, так как длительная инкубация в моющем средстве может привести к ухудшению структуры саркомера.
  7. Удалите буфер с помощью пипетки объемом 200 мкл и перенесите грудные клетки с помощью кисти или щипцов до капли 0,05% PBS-T на предметном стекле микроскопа под стереоскопом.
  8. Ориентируйте грудную клетку щитком вверх и стабилизируйте ее между парой щипцов Dumont #3 (Рисунок 1G-H).
  9. Проведите лезвием криостата по грудной клетке, чтобы сделать надрез на щитке (Рисунок 1H, J, L), а затем разрежьте его одним плавным движением вниз по средней линии (Рисунок 1I, J, L - N), чтобы создать полусекцию грудной клетки, обнажающую ИФМ (Рисунок 1K).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы кутикула была «надрезана» или треснула перед разрезанием IFM, чтобы избежать растягивающих артефактов, которые повреждают структуру саркомера. Не «пилите» лезвие вперед и назад, так как это движение механически повреждает ИФМ, что приводит к изношению миофибрилл. Слишком большой буфер дестабилизирует грудную клетку между щипцами и затрудняет разрез. Альтернативные подходы включают стабилизацию грудных клеток по одному на двойной стиковой ленте для облегчения разрезов, а также резку с вентральной стороны грудной клетки.
  10. Переместите две половины грудной клетки в положение на предметном стекле, где они останутся покрытыми буфером, чтобы избежать высыхания, но не будут мешать будущим разрезам. Повторяйте шаги 1.8-1.10 до тех пор, пока не будут обрезаны все грудные клетки.
  11. С помощью щипцов перенесите геми-срезы грудной клетки со предметного стекла микроскопа в 500 мкл 0,05% PBS-T в одну лунку 24-луночного планшета и продолжайте проводить блокаду и иммуноокрашивание (см. раздел 4 ниже).

2. Расслоение гемиторакса поздней куколки IFM (от ~48 ч до 96 ч APF) (Рис. 2, Рис. 3)

  1. Стадия куколок нужного генотипа и возраста до выбранного момента развития куколки (рисунок 2). Соберите самцов или самок белых предкуколок (рис. 2А, В) с помощью влажной кисти и инкубируйте на смоченной фильтровальной бумаге в чашке для клеточных культур диаметром 60 мм. Стадирование куколки и ее удаление из куколки было описано ранее20,26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Куколки с возрастом претерпевают множественные морфологические изменения, такие как выворачивание головы и пигментация куколочного корпуса, глаз и щетины19,41 (Рисунок 2C). Эти морфологические особенности могут быть использованы в качестве приблизительного ориентира для определения возраста куколки (рисунок 2D-E) и для выявления куколок, которые не могут нормально развиваться (рисунок 2F). Тем не менее, чтобы обеспечить точную временную шкалу стадии, рекомендуется собирать белых предкуколок в узкие временные окна, например, стадию каждые 30 минут или каждые 2 часа. Строго расположенные временные точки необходимы для того, чтобы различать основные изменения в структуре цитоскелета и длине миоволокон, которые происходят от 24 ч до 35 ч APF, а также различать различия в структуре саркомеров через 35 ч, 48 ч, 60 ч, 72 ч, 80 ч и 90 ч APF18,42.
  2. Соберите необходимые принадлежности, в том числе кисть для рисования, два щипца Dumont #5 с биологическими наконечниками, пару пружинных ножниц Vannas, ленту с двойным покрытием, предметное стекло для микроскопа, пластиковую пипетку, 24-луночную пластину, салфетки Kimwipes и лезвия для криостата (см. Таблицу материалов). Приготовьте 1x PBS, 0,05% PBS-T и фиксирующие растворы (см. Дополнительный файл 1). Доступен обзор блок-схемы следующей операции по вскрытию гемиторакса куколки (дополнительный рисунок 2).
  3. В нужный момент времени с помощью кисти перенесите куколки с фильтровальной бумаги на полоску двойной клейкой ленты, приклеенную к предметному стеклу микроскопа под стереоанализирующим микроскопом при 10-20-кратном увеличении (рис. 3A, B). Выстройте куколки на ленте лицом в одну сторону, брюшной стороной вниз.
  4. С помощью пары щипцов #5 откройте переднюю часть куколочного корпуса первой куколки, аккуратно удаляя оперкулум (область над головой) (рис. 3C, D, I).
  5. Осторожно с помощью щипцов #5 разрежьте куколку вдоль куколки дорсально к крылу и отклейте куколку от куколки с шагом 1-2 мм. Прикрепите куколку к двойной клейкой ленте, двигаясь от передней к задней (Рисунок 3E - G, I). Избегайте тыкания в саму куколку, лучше вставьте кончик щипца между куколкой и базальной мембраной/куколочным мешком, окружающим куколку.
  6. После того, как футляр будет снят, с помощью щипцов приподнимайте его (рис. 3H, I) и осторожно перенесите куколку из футляра в каплю 1x PBS на предметное стекло второго микроскопа (рис. 3J, K), чтобы избежать обезвоживания. Повторяйте шаги 2.4-2.6 (рисунок 3I) до тех пор, пока все куколки не будут удалены из куколочного корпуса.
  7. Удалите брюшную полость из рассеченных куколок с помощью пружинных ножниц Vannas (Рисунок 3L).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Брюшная полость удаляется для лучшего проникновения с помощью фиксатора на следующем этапе. Чтобы не повредить грудную клетку, делайте разрез непосредственно в области живота, оставляя до 30% живота, прикрепленного к грудной клетке.
  8. Аккуратно перенесите головку куколки вместе с грудной клеткой (рисунок 3М) с помощью щетки или щипцов на 500 мкл фиксирующего раствора в одну лунку 24-луночного планшета. Зафиксируйте в течение желаемого периода времени (обычно 15-60 минут) и промойте в 1 мл 0,05% PBS-T, как описано в шагах 1.5-1.6.
  9. Удалите буфер с помощью пипетки объемом 200 мкл и перенесите грудные клетки с помощью кисти или щипцов до капли 0,05% PBS-T на предметном стекле микроскопа под стереопрепарирующим микроскопом при 10-кратном увеличении.
  10. Отделите один образец от остальных и ориентируйте его вентральной стороной вниз и стабилизируйте между парой щипцов Dumont #3 (Рисунок 3N).
  11. Проведите лезвием криостата по грудной клетке до тех пор, пока базальная мембрана и кутикула не будут разрезаны, а затем разрежьте его одним плавным движением вниз по средней линии (Рисунок 3O), чтобы получить полусекции грудной клетки, обнажающие IFM (Рисунок 3P).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не «пилите» лезвие вперед и назад, так как это движение механически повреждает IFM, что приводит к изношению миофибрилл. Слишком большой буфер дестабилизирует грудную клетку между щипцами и затрудняет разрез. Грудная клетка куколки может быть разрезана с прикрепленной головой и ориентирована либо влево, либо вправо.
  12. Переместите две половины грудной клетки в положение на предметном стекле, где они останутся покрытыми буфером, чтобы избежать высыхания, но не будут мешать будущим разрезам. Повторяйте шаги 2.10-2.12 до тех пор, пока не будут обрезаны все грудные клетки.
  13. С помощью щипцов перенесите геми-срезы грудной клетки со предметного стекла микроскопа в 500 мкл 0,05% PBS-T в одну лунку 24-луночного планшета и продолжайте блокирование и иммуноокрашивание (см. шаг 4 ниже).

3. Открытое вскрытие ранней куколки ИФМ (от ~15 ч до 48 ч APF) (Рисунок 4)

  1. Этапируйте куколки нужного генотипа и возраста до выбранного момента развития куколки (рисунок 2), как описано выше (Шаг 2.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для вскрытия по открытой книге куколки следует препарировать группами не более чем по 8-10 мух.
  2. Соберите необходимые принадлежности, в том числе кисть для рисования, два щипца Dumont #5 с биологическими наконечниками, пару пружинных ножниц Vannas, двойной скотч, предметное стекло для микроскопа, пластиковую пипетку, черную силиконовую чашку для препарирования, черную стеклянную тарелку для окрашивания, булавки от насекомых и безворсовые салфетки (см. Таблицу материалов). Приготовьте 1x PBS, 0,05% PBS-T и фиксирующие растворы (см. Дополнительный файл 1). Доступен обзор блок-схемы следующей открытой книги вскрытия куколки (дополнительный рисунок 3).
  3. В нужный момент времени извлеките куколки из куколки, как описано в шагах 2.3-2.6. Перенесите куколки в черную силиконовую чашку для препарирования, наполненную 1x PBS после извлечения из куколки (рис. 4A).
  4. После того, как все куколки будут освобождены от куколочного корпуса, используйте щипцы Dumont #5 для преодоления поверхностного натяжения и аккуратно протолкните рассеченные куколки вниз к поверхности силикона. Разложите куколок в линию рядом с центром миски (рисунок 4B).
  5. Введите две иглы от насекомых с помощью щипцов Dumont #5 через брюшную полость каждой куколки, чтобы удержать ее на месте (рис. 4C, D). Убедитесь, что куколки ориентированы брюшной стороной вверх.
  6. С помощью пружинных ножниц Vannas разрежьте базальную мембрану и переднюю область головы каждой куколки (Рисунок 4E).
  7. Вставьте ножницы в отверстие и разрежьте по правой и левой сторонам каждой куколки (рисунок 4F, G, Q). Расположите ножницы и разрежьте чуть ниже развивающегося узелка обратно к месту соединения между грудной клеткой и брюшной полостью, чтобы удалить ноги и крылья с помощью вентральной части. Убедитесь, что ножницы вставлены горизонтально и не соприкасаются с тыльной частью грудной клетки (рисунок 4Q).
  8. С помощью щипцов Dumont #5 захватите и приподнимите вентральную часть куколки и удалите ее пружинными ножницами Vannas (рис. 4H, I, Q).
  9. Удалите головной мозг, вентральный нервный канатик (VNC), трахею и кишечник с помощью щипцов Dumont #5 (рис. 4J,K,Q). Будьте осторожны, чтобы не потревожить развивающиеся IFM, которые находятся непосредственно под трахеей и VNC, прикрепленные к эпидермису на дорсальной части грудной клетки.
  10. Зафиксируйте наконечник наконечника для дозатора объемом 200 μл, чтобы создать более широкое отверстие. С помощью пипетки объемом 200 мкл с обрезанным кончиком аккуратно промойте 1x PBS буфер на грудной клетке, чтобы удалить большую часть оставшихся жировых тел и обнажить IFM (рис. 4L, M). Будьте осторожны, чтобы не порвать сухожильные прикрепления, которые соединяют миоволокна с эпидермисом.
  11. С помощью пружинных ножниц Vannas разрежьте среднюю линию тыльной поверхности грудной клетки, создав два «листочка», содержащих IFM (Рисунок 4N).
  12. Срежьте ножницами створки тыльной части грудной клетки от брюшной полости (рисунок 4O, Q), а листочки перенесите в черную стеклянную чашку с помощью щипцов Dumont #5 (рисунок 4P). Возьмитесь щипцами за листочки в верхней части корпуса, чтобы не повредить миоволокна или сухожилия IFM.
  13. Зафиксируйте на желаемый период времени (обычно 15 минут). С помощью пипетки объемом 200 мкл осторожно снимите фиксатор и промойте 500 мкл 0,05% PBS-T. Приступайте к блокированию и иммуноокрашиванию (см. шаг 4 ниже).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не наносите образцы нутата или камня в посуду из черного стекла. Мышечно-сухожильные прикрепления на ранних стадиях куколки очень хрупкие и рвутся при постоянном буферном возбуждении, что приводит к потере IFM. Медленно и осторожно проводите пипеткой по краям буфера в чашке, чтобы избежать засасывания образцов в наконечник пипетки при смене раствора.

4. Иммуноокрашивание и гистохимия фиксированных образцов IFM

  1. Соберите необходимые принадлежности, включая пипетку, наконечники для пипеток и необходимые антитела или красители. Приготовьте 0,05% PBS-T, блокирующий раствор и смеси антител/красителей (см. Дополнительный файл 1).
  2. Сотрите с образцов промывочный раствор (0,05% PBS-T) и добавьте раствор для блокировки. Образцы инкубировать в блокирующем растворе не менее 30 минут при комнатной температуре (с раскачиванием на этапах 1-2, без укачивания на этапе 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы образцы могут быть заблокированы на ночь при температуре 4 °C. В этом протоколе образцы блокировались в 5% нормальной сыворотке крови коз (NGS) в 0,05% PBS-T. Более подробная информация о вариантах решения блокировки представлена в Дополнительном файле 1.
  3. Удалите блокирующий раствор из грудной клетки с помощью пипетки. Добавьте первичную смесь антител и инкубируйте не менее 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C (с раскачиванием на этапах 1-2, без раскачивания на этапе 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол совместим с большинством первичных антител. Антитела следует разводить в блокирующем растворе. Первичные разведения антител, протестированные по этому протоколу, варьируются от 1:10 до 1:2000 и определяются экспериментально для каждого отдельного антитела. Более подробная информация об оптимизации окрашивания первичными антителами представлена в Дополнительном файле 1.
  4. Удалите первичную смесь антител с помощью пипетки и промойте образцы 3 раза в течение 10 мин каждый с содержанием 0,05% PBS-T.
  5. Добавьте в образец вторичное антитело или смесь красителей. Накройте образец куском алюминиевой фольги, чтобы свести к минимуму отбеливание. Выдерживать не менее 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C (с раскачиванием на этапе 1-2, без раскачивания на этапе 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство вторичных антител и флуоресцентных клеточных красителей могут быть использованы с этим протоколом. Многие вторичные антитела используются в разведении 1:500. В приведенных ниже репрезентативных данных (см. Репрезентативные результаты) ядра мечили DAPI (1 мг/мл в массе, разведенной 1:1000 в 0,05% PBS-T) и F-актином с родаминовым фаллоидином (300 ед/мл в массе, разведенной в 1:500 в 0,05% PBS-T).
  6. Удалите смесь для вторичного загрязнения с помощью пипетки и промойте образцы 4 раза по 10 минут каждый в 0,05% PBS-T при комнатной температуре. Приступайте к монтажу (шаг 5) непосредственно после мойки.

5. Крепление окрашенных образцов на предметные стекла для микроскопического анализа (Рисунок 5)

  1. Соберите необходимые принадлежности, включая кисть для рисования, щипцы, матовые предметные стекла для микроскопа, покровные стекла (толщина #1), прозрачный лак для ногтей, монтажный материал и безворсовые салфетки (см. Таблицу материалов).
  2. Пометьте матовую область письма предметного стекла микроскопа соответствующим номером образца или предпочтительной идентифицирующей информацией (дата, генотип, антитела, номер предметного стекла и т. д.).
  3. Добавьте распорки покровных стекол (покровные стекла #1), оставив около 1 см между покровными стеклами для размещения образца (Рисунок 5A-C). Используйте небольшую каплю 50% глицерина, чтобы удерживать спейсеры на месте (рисунок 5A, D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Распорки предотвращают искажение образца при монтаже толстых образцов. Взрослым грудным животным обычно требуется 2-х толстая раскладушка, 48-часовая толстая прокладка APF толстой прокладке, а открытой книжной листовке без распорки.
  4. Добавьте каплю монтажной среды в лунку между покровными прокладками или в центр предметного стекла микроскопа при монтаже ранних образцов куколки (рис. 5C-D). Поместите предметное стекло под стереоскоп для препарирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны несколько типов монтажных носителей. Если вы используете самоуверждаемый материал, рассмотрите материал со временем отверждения в несколько часов, чтобы дать достаточно времени для правильной ориентации образцов до того, как фильтрующий материал затвердеет. Было показано, что монтажные среды влияют на размеры саркомера 43,44,45, поэтому для всех образцов в эксперименте следует использовать один и тот же реагент.
  5. С помощью пипетки удалите как можно больше буфера для промывки из образцов. Немедленно перенесите образцы с помощью щипцов или кисти на каплю монтажного материала на предметное стекло (рисунок 5E).
  6. Используя щипцы Dumont #5, организуйте образцы в ряды и столбцы, убедитесь, что образцы не перекрываются, и ориентируйте грудные клетки так, чтобы IFM были обращены вверх (рис. 5F, J, Q, S). Для ориентации может потребоваться тщательное переворачивание образцов в местах, где щетина/кутикула обращены вверх (рис. 5G, H, K, L, R). Будьте осторожны, не прикасайтесь к ИФМ, так как контакт может повредить структуру саркомера (см. Репрезентативные результаты).
  7. Осторожно добавьте покровное стекло #1 (18 x 18 мм или 22 x 22 мм) поверх образцов грудной клетки (Рисунок 5M). Если вы используете прокладки, осторожно нажмите на покровную крышку, пока она не соприкоснется с прокладками по обе стороны от образцов (Рисунок 5N).
  8. С помощью наконечника пипетки или пипетки заполните область отбора проб монтажной средой до тех пор, пока все грудные клетки не будут закрыты (Рисунок 5O). Избегайте образования пузырьков воздуха, которые могут нарушить процесс получения изображения.
  9. Используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы запечатать мокрое крепление. Не забудьте загерметизировать как образец покровного стекла, так и покровное стекло распорки (Рисунок 5P,S).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования верхнего покрытия или быстросохнущего лака для ногтей, так как они плохо герметизируют и при испарении монтажной среды будут образовываться пузырьки воздуха.
  10. Просушите предметные стекла в течение 10 минут при комнатной температуре. Хранить в футляре при температуре 4 °C. Слайды можно визуализировать в течение нескольких дней или недель.
  11. Изображение образцов на флуоресцентном микроскопе, конфокальном микроскопе или другой системе в соответствии с планом эксперимента. Протоколы для сбора данных и анализа изображений доступны в других разделах 14,30,46,47,48.

Результаты

Представленный выше протокол диссекции может быть использован для получения высококачественных образцов для микроскопического анализа морфологии миоволокна и саркомера IFM уже через 8 ч после формирования пупария (APF) методом открытой книги (шаг 3) до взрослых стадий с использованием метода гемиторакса (шаги 1 и 2). Эти вскрытия были применены для исследования формирования мышц и саркомеров 18,42,49, функции транскрипционного фактора 50,51 и регуляции РНК37,38, среди прочего. Репрезентативные результаты, представленные ниже, демонстрируют совместимость этого протокола с различными методами фиксации, подробно описывают общие артефакты диссекции и используют фенотип мутанта SmnE33, чтобы проиллюстрировать полезность этого протокола для решения морфологических и клеточных биологических вопросов в модели IFM.

Диссекция IFM совместима с несколькими методами фиксации

Важнейшим аспектом пробоподготовки для гистохимических или иммунофлуоресцентных образцов является точное сохранение клеточных структур за счет фиксации. Фиксаторы сохраняют структуру и морфологию тканей, предотвращая деградацию и стабилизируя белковые и липидные структуры посредством сшивки52,53. Различные классы фиксаторов, например, на основе альдегида по сравнению с органическими растворителями, имеют различную эффективность проникновения и сшивания и по-разному влияют на распознавание антител-мишеней путем нацеливания на различные функциональные группы53,54. Диссекция IFM совместима с несколькими методами фиксации, включая фиксацию 4% параформальдегида (PFA), 9% глиоксаля и метанола (Рисунок 6), что подчеркивает общую полезность этого протокола диссекции.

Для сравнения размеров и морфологии саркомеров с применением различных методов фиксации проводили вскрытие гемиторакса взрослой особи за 1 день и1118 мух. Сравнивали 4% фиксацию PFA либо в фосфатно-солевом буфере (PBS) (рис. 6A,E), либо в расслабляющем растворе (RS) (рис. 6B,F). Расслабляющий раствор содержит АТФ и рекомендуется использовать при количественном определении размеров саркомеров для сохранения саркомеров в их расслабленном состоянии20,55 (см. Дополнительный файл 1). Фиксация 4% PFA эффективно сохраняет морфологию саркомера, но значительная разница в ширине саркомера наблюдалась между фиксацией 4% PFA при PBS и RS (рис. 6I, J). Фиксация в метаноле сохраняла структуру миоволокна и саркомеров (рис. 6C,G), но саркомеры были значительно короче и тоньше, чем при 4% фиксации PFA (рис. 6I,J). ИФМ можно было эффективно сохранить при 9% фиксации глиоксаля в течение ночи (Рисунок 6D,H) (3% фиксация глиоксалем была неэффективной), что также значительно изменяло ширину саркомера по сравнению с 4% фиксацией PFA (Рисунок 6I,J). В заключение следует отметить, что гемиторасы IFM могут быть эффективно сохранены с помощью нескольких фиксаторов. Однако, поскольку как фиксатор, так и буфер могут влиять на измерение размеров саркомера, эксперименты должны быть спланированы с надлежащим контролем и четко определенным и последовательным протоколом фиксации.

Распространенные артефакты диссекции и фиксации в ИФМ

Одной из проблем микроскопии, особенно для новых пользователей и стажеров, является различение технических артефактов и костных фенотипов. Чтобы помочь в этом различии у ИФМ дрозофилы, представлены репрезентативные данные о наиболее часто наблюдаемых артефактах и неудачных диссекциях (рис. 6). Протоколы фиксации требуют оптимизации типа, концентрации и длины фиксации во избежание недостаточной или избыточной фиксации 52,53,54. С использованием временного курса фиксации w1118 1-дневных расслоений гемиторакса у взрослых, инкубированных в 4% PFA в расслабляющем растворе, было замечено, что в то время как 15- или 30-минутное время фиксации точно сохраняет морфологию саркомера, 7-минутная фиксация приводит к непоследовательной морфологии саркомера (рис. 6K-M). Кроме того, ткань менее жесткая с более коротким временем фиксации, что затрудняет разрезание и рассечение грудной клетки пополам без повреждения IFM. Дополнительные артефакты могут возникнуть как в процессе резки, так и в процессе монтажа. Структура миофибры IFM может казаться неровной, если лезвие затупилось и вызывает разрыв или изнашивание (Рисунок 6N), или если лезвие скользит или разрез наклонен (Рисунок 6O). Если щипцы вступают в прямой контакт с неподвижными IFM во время работы или монтажа, они оставляют отпечаток, который может привести к углублениям или растяжению и могут раздвинуть саркомеры (Рисунок 6P). Растяжение или деформация грудной клетки, будь то во время резки, обработки или монтажа, также раздвигают саркомеры и приводят к потере четко очерченного Z-диска (Рисунок 6Q). Наконец, «распиливание» или «трение» ИФМ щипцами или лезвием приводит к истиранию и распутыванию, изнашиванию и дезорганизации миофибрилл, особенно на поверхности миофибрилл (Рисунок 6R). Потенциальные пользователи должны ознакомиться с этими техническими артефактами и исключить их из фенотипического анализа.

Прогрессирование в развитии фенотипа Smn E33 у ИФМ

Открытая книга и вскрытие гемиторакса особенно полезны для отслеживания траектории развития мышечного фенотипа и для точного определения того, когда в процессе развития действует интересующий ген или возникают фенотипы миофибриллы. Фенотип развития IFM SmnE33, гипоморфного аллеля РНК-связывающего белка Survival motor neuron (Smn)39 , представлен в качестве репрезентативных данных, иллюстрирующих широкую полезность открытых и гемитораксовых диссекций.

Малые ядерные рибонуклеопротеины (snRNP), образующие сплайсосому, макромолекулярный комплекс, который катализирует реакцию сплайсинга с образованием мРНК7, собираются комплексом SMN. Комплекс SMN, состоящий из моторных нейронов выживания (Smn) и белков Gmin, необходим для жизнеспособности всех организмов56. Снижение уровня SMN у людей приводит к тяжелому наследственному нервно-мышечному расстройству – спинальной моторной атрофии (СМА)21. Дрозофила была использована в качестве модели для понимания этиологии СМА и клеточной функции Smn, включая развитие гипоморфного аллеля SmnE33. МухиSmn E33 жизнеспособны и плодовиты, но не могут летать или прыгать39. В то время как мухи Smn E33 имеют дефекты арборизации двигательных нейронов, они также демонстрируют дезорганизованную структуру IFM и потерю экспрессии Actin88F, специфичной для летных мышц39,57. SMN ко-локализован с альфа-актинином в Z-диске у мух и мышей39, что позволяет предположить, что Smn может иметь мышечную специфичную функцию.

Чтобы лучше понять, когда структура миофибриллы утрачивается и требуется функция Smn в развивающихся мышцах, был проведен анализ временного хода развития фенотипа SmnE33 у ИФМ через 26 ч APF, 72 ч APF и от 1 до 5 дней у взрослого человека. В то время как контрольные w1118 IFM как при 72 ч APF, так и у взрослых имеют сильный фаллоидин, окрашенный F-актиновым сигналом (рис. 7E,E',I,I') и регулярную структуру саркомера (рис. 7G,G',K,K'), сигнал фаллоидина резко снижен (рис. 7F,F',J,J') и саркомерные структуры отсутствуют (рисунок 7H,H',L,L') у SmnE33 ИФМ. Вместо этого F-актин наблюдается в сетчатых структурах вокруг ядер или в неправильных пучках или структурах «звездообразования» в цитоплазме (рисунок 7H,H',L,L'), что согласуется с потерей экспрессии Act88F18, 39 и неспособностью к сборке тонких филаментов. Для изучения фенотипа SmnE33 через 26 ч APF были проведены открытые вскрытия и выявлено, что раннее развитие IFM протекает нормально в SmnE33. По сравнению с контрольными IFM w1118 (рис. 7A,A',C,C'), мухи SmnE33 имеют 6 дорсальных продольных волокон IFM на гемиторакс, формируют организованные F-актиновые кабели на периферии миофибриллогенеза до миофибриллогенеза (рис. 7B,B') и демонстрируют сетчатую F-актиновую сеть по всему миофибриллону (рис. 7D,D'). Эти результаты указывают на то, что начальные стадии дифференцировки ИФМ протекают нормально, в то время как Smn необходим на более поздних стадиях развития ИФМ для поддержания экспрессии Act88F и построения саркомеров. Важно отметить, что эти репрезентативные результаты иллюстрируют фенотипическую детализацию и разрешение, которые могут быть достигнуты с помощью открытой книги и вскрытия гемиторакса.

figure-results-1
Рисунок 1: Вскрытие геми-сечения взрослых ИФМ. (A) Поместите взрослую муху в 1x PBS на предметное стекло микроскопа. (Б) С помощью щипцов (голубой, точечный) для стабилизации мухи удалите голову ножницами (оранжевого цвета). (К-Е) Удалите левое (C) и правое (D) крылья, а также брюшную полость (E). (F) Выбросьте голову, брюшную полость и крылья и переведите грудную клетку в фиксирующее состояние. (G,H) Расположите неподвижную грудную клетку на предметном стекле в виде капли 1x PBS-T задним (P) и скутеллумом вверх (G), используя щипцы для стабилизации ориентации (H). (И-К) С помощью лезвия криостата разрежьте грудную клетку пополам (I-J), чтобы получить два полусечения грудной клетки (K). (L) Схема лезвия криостата и грудной клетки, иллюстрирующая положение сагиттального разреза для получения полусечений. Лезвие скользят вправо, чтобы сделать надрез на щитке грудной клетки, а затем плавным движением перемещают вниз (желтые стрелки) для разрезания грудной клетки (пунктирная красная линия). (М,Н) Схема коронального (M) и поперечного (N) вида грудной клетки, иллюстрирующая положение основных групп мышц и положение разреза (между желтыми треугольниками). Указана ориентация грудной клетки (L, слева; R, справа; V, брюшной; D, спинной; А, передний; P, задний). Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Стадия куколки и особенности развития куколки. (А) Куколки самца и (В) самки могут быть различимы как белые предкуколки через 0-2 ч APF. Куколки самцов имеют парные, круглые, полупрозрачные структуры (развивающееся яичко) по направлению к задней части (стрелки). (В) Таблица признаков, которые служат признаками развития куколки. Признаки включают созревание куколочного корпуса, выворот головы и отслоение куколки от куколочного корпуса, развитие пигментации глаз, пигментацию щетины, крыльев, ног, эпандриума и кутикулы, а также видимость девственного пятна (мекония). Цвет глаз и пигментация постепенно темнеют. Сроки и стадии развития куколки, обозначенные в верхней части каждого столбца таблицы (временные точки обозначены черным текстом, соответствующая стадия развития куколки внизу синим текстом) были ранее определены Бейнбриджем иБоунсом 19,41. (Д-Э) Временной ход развития куколки через 0-2 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч APF у интактной куколки с красными глазами (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) и в куколке с оранжевыми глазами, рассеченными из куколочного корпуса (E; Fln-Gal4). Обратите внимание на прогрессирующее потемнение глаз и щетины от 48 ч до 96 ч APF. (F) Примеры летальности куколки на ранних, средних и поздних временных точках развития. Фаратные смертельные мухи полностью сформированы, но не могут полностью оторваться от куколки. Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Гемисекционное рассечение куколок ИФМ (>48 ч APF). (A-H) Удаление куколки из куколки. Прикрепите куколки к полоске двойного клейкого скотча (А,В). Откройте передний гребень (C) и удалите оперкулум (D) с помощью щипцов Dumont #5 (синий, стрелка обозначает направление движения, точка неподвижна). С помощью щипцов разрежьте (E) и снимите (F) куколку полосками (G). Полоски чехла куколки приклеиваются к ленте двойного стика. Обнажив брюшную полость, поднимите куколку из футляра (H). (I) Схема, иллюстрирующая процесс вскрытия куколки из куколочного корпуса. Панели с рисунками, соответствующие каждому шагу схемы, помечены (внизу). Красной пунктирной линией отмечено место, куда можно вставлять щипцы, не повреждая куколку, чтобы разрезать куколку. (Дж-Л) После извлечения куколки из футляра (J) и переноса на предметное стекло микроскопа в капле 1x PBS (K) с помощью ножниц удалите брюшную полость (L). (M) Отбросьте брюшную полость и переведите грудную клетку в фиксирующее состояние. (N) После фиксации перенесите грудную клетка куколки на предметное стекло в капле 1x PBS-T. Ориентируйте куколку спинной стороной вверх и стабилизируйте с помощью щипцов. (О-) Используйте лезвие криостата (О), чтобы разрезать гемисекцию куколки (Р). Расположение среза такое же, как на рисунке 1 M-N. Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Открытая книга вскрытия куколок IFM (<48 ч APF). (A) После извлечения куколки из куколочного корпуса, как показано на рисунке 3 A-I, перенесите куколку в 1x PBS в черную силиконовую чашку для препарирования. (Б-Г) Осторожно прижмите куколку к поверхности силиконовой чашки с помощью щипцов (B) и прижмите вентральной стороной вверх двумя булавками от насекомых (C,D). (Д) Откройте базальную оболочку (бм) и кутикулу головы с помощью ножниц (оранжевого цвета). (Ф,Г) Разрежьте по правой (F) и левой (G) стороне. Положение реза показано на диаграмме (Q). (Х,И) Поднимите брюшной срез с помощью щипцов (H) и снимите ножницами (I). (Дж,К) С помощью щипцов удалите головной мозг (J), латеральную трахею туловища и кишечник (K). (Л-М) Используйте мягкую струю буфера из пипетки, чтобы удалить жировые тела и обнажить IFM. (N) Разрежьте грудную клетку на два листочка. (О,) Срежьте листочки и перенесите их в фиксатор. (Q) Схема, обобщающая шаги в открытой книге. Панели с рисунками, соответствующие каждому шагу, помечены (внизу). Вид сверху и сбоку предназначен для иллюстрации расположения надрезов (пунктирная красная линия) на левой и правой стороне куколки. Крылья, ноги и хоботок (помечены) используются для различения спинной и брюшной сторон куколки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Крепление образца на предметных стеклах микроскопа. (A-D) Покровные прокладки используются для крепления образцов с толстой грудной клеткой. Глицерин (А) используется для крепления прокладок (покровных стекол #1) к маркированному слайду (В), а образцы монтируются в монтажную среду в пространство между прокладками (С). Поздним куколкам и взрослым грудным животным требуются две прокладки #1 (D). Для средних точек куколки требуется одна покровная прокладка #1, а раннее рассечение куколки может быть установлено без прокладки. (Э-Х) Образцы гемиторакса взрослого человека переносят в монтажную среду с помощью щипцов или кисти (Е). Грудные клетки изначально ориентированы случайным образом (F), и их может потребоваться перевернуть с помощью щипцов (G) так, чтобы IFM были ориентированы вверх по направлению к покровному стеклу (H). (И-Л) Листочки из ранних куколочных открытых книжных диссекций переносятся для монтажа с помощью щипцов (I). Листовки имеют случайную ориентацию (J) и могут быть перевернуты с помощью щипцов (K) так, чтобы IFM были обращены вверх к покровному стеклу (L). (М-) После того, как образцы будут правильно ориентированы, наденьте на образцы покровную крышку (M) и постучите ее ровно по прокладкам (N). Заполните образцы монтажной средой (O), стараясь не допустить образования пузырьков. Заклейте все открытые края покровного стекла и распорок лаком для ногтей (P), чтобы избежать испарения монтажной среды. (К-Р) Изображения правильно установленных образцов грудной клетки взрослого человека (Q, 10-кратное увеличение), ориентированные ИМК вверх по направлению к покровному стеклу (R, 20-кратное увеличение). (S) Схема готового слайда, с образцами, ориентированными IFM-вверх между распорками и лаком для ногтей, запечатывающим все открытые края. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Рассечения ИФМ совместимы с различными фиксаторами. (A-H) Конфокальная z-проекция структуры миофибры (A-D) или одноплоскостные изображения миофибриллы и саркомерной структуры (E-H) контрольной группы w1118 взрослого IFM. Диссекция гемиторакса совместима с несколькими методами фиксации, включая 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS) (A,E) или расслабляющем растворе (RS) (B,F), метаноле (C,G) или 9% растворе глиоксаля (D,H). DAPI (1:1000), синий; фаллоидин (1:500) окрашенный F-актином, серый. (И,Дж) Количественная оценка длины саркомера (I) и ширины (J) по E-H. Метод фиксации и буфер могут существенно повлиять на измерение длины и ширины саркомера. Длина саркомера 3,040 ± 0,2935 мкм с фиксацией метанола была значительно короче измеренных длин 3,271 ± 0,2736 мкм, 3,190 ± 0,2586 мкм и 3,217 ± 0,2023 мкм с фиксацией PFA (PBS), PFA (RS) и 9% глиоксальной фиксацией соответственно (p < 0,001). Ширина саркомера достоверно различалась между всеми тестируемыми методами фиксации (PFA (PBS), 1,410 ± 0,1331 мкм; PFA (RS), 1,284 ± 0,2514 мкм; метанол, 1,280 ± 0,1538 мкм; и 9% фиксация глиоксала, 1,137 ± 0,2032 мкм). Ящичковые диаграммы показаны усами Тьюки с выпадающими точками, отмеченными черными точками. Значимость определяли с помощью ANOVA с помощью апостериорного теста Тьюки (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). (К-М) Одноплоскостные конфокальные изображения временного хода фиксации взрослого w1118 при 4% PFA при фиксации RS, демонстрирующие, что время фиксации 15 (L) или 30 (M) мин по сравнению с 7 мин (K) приводит к хорошо сохранившейся и стабильной структуре саркомера. (Н,О) Z-стековые проекции взрослых Act88F-Gal4 IFM, зафиксированные в 4% PFA, демонстрируют артефакты диссекции в миоволокнах. К распространенным артефактам относятся порезанные, изношенные или частичные миоволокна от тупого лезвия (N) или скошенного разреза (O). (-Р) Одноплоскостные конфокальные изображения образцов взрослых особей w1118, зафиксированных в 4% PFA в PBS, демонстрируют общие артефакты диссекции в саркомерах и миофибриллах. К распространенным техническим артефактам относятся неравномерное растяжение саркомеров из-за контакта с щипцами во время монтажа (P), вытягивание Z-дисков из регистра путем растяжения миоволокон во время продольных разрезов (Q), а также изношенные, дезорганизованные или скручивающиеся миофибриллы из-за истирания или тупого лезвия (R). DAPI (1:1000), синий; фаллоидин (1:500) окрашенный F-актином, серый. Масштабная линейка = 100 μм (A-D, N-O), 5 μм (E-H, K-M, P-R). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Применение вскрытий для исследования фенотипа IFM SmnE33 в процессе развития. (А-Г) Структура мышц у ранних куколок через 26 ч APF. Одноплоскостное конфокальное изображение структуры миофибры (A, A', B, B') и структуры миофибриллы и саркомера (C, C', D, D') в контроле (A, A', C, C') и SmnE33(B, B', D, D'). Как control, так и SmnE33 имеют шесть миоволокон IFM на гемиторакс и образуют кабели F-актина. (Э-Х) Структура мышц поздних куколок через 72 ч APF. Z-проекционное изображение структуры миофибры в контрольной части (E, E') и SmnE33 (F, F'). IFM в SmnE33 присутствуют на основе окрашивания DAPI, но не имеют сильного F-актинового сигнала. Одноплоскостные конфокальные изображения показывают, что управляющие ИФМ имеют высокоорганизованную саркомерную структуру (G, G'). Напротив, ИФМ SmnE33 (H, H') имеют аномальные звездообразные структуры F-актина (желтые стрелки) и не имеют организованной саркомерной структуры, наблюдаемой в контрольных ИФМ. (И-Л) Мышечная структура взрослого человека в контроле (I, I', K, K') и SmnE33(J, J', L, L'). Z-проекция (I,J) и одноплоскостные конфокальные изображения (K,L) показывают значительно сниженное содержание F-актина и аномальные структуры актина (желтые стрелки) в ИФМ SmnE33. DAPI (1:1000), синий; фаллоидин (1:500) окрашен в F-актин, пурпурный или серый цвет. Масштабная линейка = 50 μм (A, B), 10 μм (C, D, G, H, K, L), 100 μм (E, F, I, J). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Подробное описание методов фиксации и окрашивания, использованных в тексте и, в частности, для получения данных, показано на рисунках 6 и 7. Включена дополнительная информация по определению разведений первичных антител. Также приведен список компонентов буфера и рецептов, используемых в этом протоколе. Эти данные мотивируют протокол препарирования и демонстрируют его полезность для конфокальной микроскопии и анализа фенотипов IFM при развитии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Блок-схема этапов рассечения гемиторакса у взрослых ИФМ. Текстовое резюме шагов на рисунке 1 для подготовки разделов гемиторакса IFM. После диссекции, фиксации и бисекции грудной клетки срезы окрашиваются для микроскопического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Дополнительный рисунок 2: Блок-схема этапов гемитораксовой диссекции куколок ИФМ. Текстовое резюме шагов на рисунке 3 для подготовки срезов гемиторакса куколки ИФМ. После извлечения из куколочного корпуса куколки фиксируются, рассекаются пополам и окрашиваются для микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Дополнительный рисунок 3: Блок-схема этапов вскрытия ранней куколки ИФМ. Текстовое резюме шагов, показанных на рисунке 4 для выполнения открытой книги вскрытия куколки ИФМ до 48 ч APF. После диссекции и фиксации эпителиальные створки с прикрепленными ИФМ окрашивают для микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Обсуждение

В данном протоколе представлена процедура гемитораксовой диссекции взрослых (Рисунок 1) и поздних (48 ч - 96 ч APF) (Рисунок 3) фрагментов гемиторакса, а также открытая диссекция ИФМ в ранних точках куколки (8 ч - 48 ч APF) (Рис. 4). Этот протокол оптимален для иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии. Протокол проиллюстрирован принципиальными схемами и пошаговыми фотографиями процедуры вскрытия. Обзорные диаграммы также делают протокол доступным для ученых, новичков в области дрозофилы, а также для исследователей и стажеров на ранних стадиях. Репрезентативные примеры артефактов плохой фиксации и пробоподготовки включены для того, чтобы пользователи протокола могли отличить артефакты от настоящих фенотипов саркомера.

Наиболее сложным этапом при рассечении гемиторакса при IFM является бисекция грудной клетки (рис. 1I,J,L и рис. 3O). Для освоения этого шага требуется время и практика. Для дополнительной устойчивости при резке отдельные грудные клетки можно поместить на ленту с двойным стержнем и разрезать36, но следует соблюдать осторожность, чтобы избежать высыхания IFM. Также можно резать с вентральной стороны грудной клетки, с тыльной стороной, направленной вниз, поэтому новые пользователи могут проверить, какой подход наиболее эффективен в их установке. Разрезы следует выполнять новыми острыми лезвиями, чтобы не повредить IFM, а когда лезвие затупляется, его следует заменить. В этом протоколе для чистого разреза грудной клетки используются микротомные (криостаты) лезвия, в отличие от других протоколов, в которых используются игла, щипцы или лезвие скальпеля24, 32, 36. Бритвенные лезвия — еще одна альтернатива для чистого разрезания грудной клетки пополам. Фиксация также важна перед бисекцией, так как слабо зафиксированная ткань, хотя и стабильно сохраняется, может быть «мягкой» и ее труднее разрезать. Время фиксации 30-60 минут уравновешивает доступность антигена и жесткость тканей, облегчая порезы, и может быть сокращено до 15 минут при накоплении опыта.

Одним из ограничений препаратов гемиторакса является проникновение антител. Гемиторацемы представляют собой толстые образцы32, а наиболее качественные конфокальные микрофотографии получаются из верхних 10-20 мкм ИФМ42, 58. Слишком низкая концентрация моющего средства или слишком короткое время проникновения могут привести к слабому и неравномерному окрашиванию. Проникновение антител также может быть улучшено за счет более длительной (2-3 дня) инкубации в первичном антителе. Двухфотонная система или объектив с большим рабочим расстоянием также могут увеличить глубину изображения59. Если экспериментатору необходимо получить изображение полного диаметра миоволокна IFM, следует рассмотреть альтернативный подход, такой как микротом24, 58 или криосекция27 в сагиттальной плоскости.

Важным аспектом, который не рассматривается в основном протоколе, является анализ данных изображений. Для анализа миоволокон IFM на изображениях с 10x или 20x (рис. 6A-D, рис. 7A, B, E, F, I, J) стандартный анализ включает определение того, прикреплены ли миоволокна и не повреждена ли общая морфология миоволокна37, 38. Примеры параметров, которые могут быть количественно определены, в зависимости от эксперимента, включают длину, ширину, количество, количество прикрепленных или количество разорванных миоволокон37, 60. Основным преимуществом этого протокола является совместимость с флуоресцентной микроскопией и возможность анализа морфологии саркомера и миофибриллы при более высоких увеличениях в 60 или 100 раз (рис. 6E-H, рис. 7C, D, G, H, K, L). Морфология саркомеров должна быть проанализирована в образцах, свободных от технических артефактов (рис. 6K-P). Ряд категорий возможных фенотипов миофибрилл и саркомеров был определен ранее60. Чаще всего длину и ширину саркомера измеряют либо путем рисования и измерения линии от Z-диска до Z-диска в программном обеспечении для обработки изображений, либо с помощью одного из нескольких автоматизированных инструментов, которые находятся в свободном доступе18, 45, 61. Оценка морфологии саркомеров может быть улучшена путем включения маркеров, которые маркируют Z-диск или М-линию, а также толстые или тонкие филаменты30, 34,58. Эти данные могут быть использованы для количественного описания фенотипов миофибриллы, миофибрилла и саркомера между контрольным и испытуемым образцом, полученным с использованием данного протокола вскрытия.

Пользователи протокола должны знать, что в то время как фиксация сохраняет морфологию миоволокна и саркомера, фиксаторы, а также буферы и монтажная среда могут вызывать усадку или отек тканей и могут влиять на измерение морфологическихпараметров. Известно, что фиксация глутарового альдегида и обезвоживание, необходимые для электронной микроскопии, уменьшают диаметр саркомера43, в то время как снятие и глицерация волокон увеличивают диаметр саркомера 44,45. Это явление может лежать в основе различий в параметрах саркомера в литературе и подчеркивает важность включения контрольных и тестовых образцов в каждый эксперимент. Контрольные и тестовые ИФМ должны обрабатываться одновременно в одних и тех же буферах для точного сравнения количественных параметров саркомеров.

Этот подробный протокол направлен на то, чтобы сделать вскрытие IFM у взрослых и куколок для иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии более доступным для начинающих и продвинутых дрозофилов. Этот протокол может быть адаптирован для использования с другими насекомыми, а также для других методов визуализации, таких как криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ), одномолекулярная флуоресцентная гибридизация in situ (smFISH) или пространственная транскриптомика. Сочетание мощных генетических инструментов дрозофилы с флуоресцентной микроскопией открывает уникальные возможности для изучения консервативных принципов миогенеза и мышечной функции. Поскольку ИФМ также поддаются молекулярному и биохимическому подходам26, 27, будущие исследования, связывающие молекулярные фенотипы с морфологией мышц, клеточной биологией и функцией, обеспечат более глубокое понимание миогенеза и этиологии мышечных расстройств.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Грегори Матера за предоставление аллеля SmnE33 и за полезные обсуждения Smn. Авторы благодарят Франка Шноррера, Корнелию Шенбауэр, Мануэлу Вейткунат и Айнур Кайя-Копур за полезные обсуждения и поддержку. Авторы выражают признательность Блумингтонскому фондовому центру за предоставление мух. Эта работа была поддержана стартовым финансированием от Школы науки и инженерии Университета Миссури в Канзас-Сити (UMKC), Отдела биологических и биомедицинских систем (MLS), Программы финансирования передового опыта UMKC (MLS) и Управления студенческих исследований и творческих стипендий UMKC (SF, MLS).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
60 мм контейнеров для культуры тканейFisher ScientificFB01292160 мм, полистирол
Уксусная кислота, ледник (сертифицированный ACS)Fisher ScientificA38S-212
Аденозинтрифосфат (АТФ)Миллипор СигмаA1852
Алюминиевая фольга, прочнаяAmazon12 дюймов. x 1000 футов.
Чёрные кремниевые дисекционные посуды: активированный угольный порошокМиллипор СигмаC9157Также доступен в большинстве аптек
Чёрные кремниевые дисекционные посуды: Sylgard 184Миллипор Сигма761036Для производства кремниевых дисекционных блюд смешайте компоненты Sylgard в пакете с зиплоком и тщательно перемешайте. Добавьте в Sylgard (~50 г) порошок активированного угля (~200 мг), хорошо перемешайте, отрежьте уголок пакета, наполните 60-мм посуды для культуры, удалите пузырьки наконечником пипетки и засохте на ночь.
Картонный лоток для слайдов, Research Products International CorpFisher Scientific50-136-7558
Конфокальный микроскоп, инвертированный конфокальный микроскоп Nikon AXRNikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
Конфокальный микроскоп, инвертированный конфокальный микроскоп Zeiss LSM 780Zeisswww.zeiss.com
Камера по воспитанию насекомых Дарвина (инкубатор)Fisher Scientific/Дарвин ЧеймберсIN034Инкубатор с контролем света, температуры и влажности
Дисектирующая чаша (чёрное стекло)Mikroskop Technik Diethelm398011Лимфбеккен (чаши для окрашивания/лимфатические баки), чёрное стекло, 4x4 см, с прозрачным стеклянным покрытием
Пинцеты Dumont #3Тонкие научные инструменты11231-30Прямой наконечник Dumoxel 12 см с наконечниками 0,17 x 0,1 мм;
Щипцы Dumont #5Тонкие научные инструменты11252-20Inox прямой наконечник щипцов 11 см, Биология сорта с кончиком 0,05 x 0,02 мм;
EGTA (эгтазиновая кислота)Миллипор Сигма324626
Этанол, абсолют (200 proof)Fisher ScientificBP28184Оценка по молекулярной биологии
Премиальное стекло Fisherbrand Cover Glass (18 x 18 мм), склейкиFisher Scientific12548AСтекло, квадратное, толщиной #1 (0,13 - 0,16 мм)
Стекло Fisherbrand Premium Cover Glass (22 x 22 мм), накладкиFisher Scientific12548BСтекло, квадратное, толщиной #1 (0,13 - 0,16 мм)
Плоскодонные пластины для клеточной культуры (24-колодца)Fisher Scientific7200740
флуоресцентная камера для расчленения микроскопа, камера Infinity8Teledyne (Visual Dynamix)6 мегапикселей, при слабой освещённости, монохромный
Fly: Smn[E33]Мухообразный приклад; подарок Грегори Матеры
Муха: w[1118]Блумингтонский фондовый центрRRID:BDSC_3605Мушильный сток
ГлицеринFisher ScientificBP229-1Оценка по молекулярной биологии
Глиоксальный раствор (40 % массы в H2O)Миллипор Сигма128465  Это 40% стандартного раствора
Программное обеспечение для обработки изображений, Affinity Designer 2Близостьhttps://affinity.serif.com/en-us/
Программное обеспечение для обработки изображений, Image J (Фиджи)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Булавки для насекомыхТонкие научные инструменты26002-10Нержавеющая сталь, диаметр 0,1 мм (мелкие штифты)
Хлорид магния (MgCl2)Fisher ScientificAA12315A1
Метанол (ВЭЖХ)Фишер Кемикал (Fisher Scientific)A452-4Расслабиться при -20? До использования
Микроскопические стекли с матовым покрытиемFisher Scientific12-550-400Область письма, без заряда, 75 мм x 25 мм x 1 мм
Микроскопические стекла, обычное стеклоFisher Scientific12-544-4Предварительно очищенная, 75 мм x 25 мм
Клинки микротомов MX35 Ultraэпредия (Fisher Scientific)3053835Низкий профиль — 34°; угол резки; Лезвия C35 feather 80mm хорошо работают
Лак для ногтей, прозрачный (Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish)Amazon0,4 fl. oz.
Обычная козья сывороткаМиллипор СигмаS26-ЛИТРОВЫЙ
Nutator (Мини Nutating Rocker, Benchmark)Midwest ScientificH3D102024 об/мин, фиксированный; 8 x 6 дюймов. платформа с впадинным ковриком
Кисть (раунд No 0)AmazonРаунд No 0 или похожая кисть из любого художественного материала
Параформальдегид (PFA)Миллипор Сигма158127-500G
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS): KClМиллипор Сигма529552-250GMПодготовьте PBS согласно Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS): KH2PO4Миллипор СигмаP0662-500GПодготовьте PBS согласно Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS): Na2HPO4Миллипор СигмаS9763-500GПодготовьте PBS согласно Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS): NaClФишер Кемикал (Fisher Scientific)S271-1Подготовьте PBS согласно Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Наконечники пипетки PR1MA (10 и микро; L)Midwest ScientificPR10XLRK-NSUniversal 10 & micro; Наконечники L пипетки
Наконечники пипетт PR1MA (1000 и микро; L)Midwest ScientificPR-1000RK-FLUniversal 1000 и микро; Наконечники L пипетки
Наконечники пипетты PR1MA (200 и микро; L)Midwest ScientificPR-200RK-NSUniversal 200 & micro; Наконечники L пипетки
Родамин-фаллоидинИнвитроген, молекулярные зондыR415
Скотч с двусторонней лентойСкотч/3M (Staples)649280Обе стороны покрыты клеем, размером 0,5" x 7 ярдов, доступны у большинства магазинов офисных товаров
Дигидрофосфат натрия (2PO4)Fisher ScientificAAA1131636
Программное обеспечение: GraphPad PrismGraphPad Prismwww.graphpad.com
Программное обеспечение: Infinity Analyze 7Teledyne (Visual Dynamix)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
Программное обеспечение: Microscoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Салфетка/ Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1 слойFisher Scientific06-666Стандартные салфетки
Трансферная пипеткаFisher Scientific13-711-9AMMDПластиковая пипетка
Тритион X-100Миллипор СигмаT9284-100ML
Пружинные ножницы VannasТонкие научные инструменты15000-00Режущая кромка 3 мм, диаметр наконечника 0,05 мм, длина 8 см
Vectashield с DAPIVector LaboratoriesH-2000
Vectashield без DAPIVector LaboratoriesH-1900
Бумага WhatmanМиллипор СигмаWHA1004070Круги для фильтрующей бумаги, 4-й степени, 70 мм
Флуоресцентный стереодиссекционный микроскоп Z10Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/
Эргономичный стерео-микроскоп Z850 Zoom DissectingVisual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/

Ссылки

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C., Murgia, M. Fiber type diversity in skeletal muscle explored by mass spectrometry-based single fiber proteomics. Histol Histopathol. 35 (3), 239-246 (2020).
  2. Plantié, E., Migocka-Patrzałek, M., Daczewska, M., Jagla, K. Model organisms in the fight against muscular dystrophy: lessons from Drosophila and zebrafish. Molecules. 20 (4), 6237-6253 (2015).
  3. Reedy, M. C., Beall, C. Ultrastructure of developing flight muscle in Drosophila. I: assembly of myofibrils. Dev Biol. 160 (2), 443-465 (1993).
  4. Henderson, C. A., Gomez, C. G., Novak, S. M., Mi-Mi, L., Gregorio, C. C. Overview of the muscle cytoskeleton. Compr Physiol. 7 (3), 891-944 (2017).
  5. Luis, N. M., Schnorrer, F. Mechanobiology of muscle and myofibril morphogenesis. Cells Dev. 168, 203760(2021).
  6. Romani, P., Valcarcel-Jimenez, L., Frezza, C., Dupont, S. Crosstalk between mechanotransduction and metabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 22-38 (2021).
  7. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Spletter, M. L. Contributions of alternative splicing to muscle type development and function. Semin Cell Dev Biol. , (2020).
  8. Jawkar, S., Nongthomba, U. Indirect flight muscles in Drosophila melanogaster as a tractable model to study muscle development and disease. Int J Dev Biol. 64 (1-3), 167-173 (2020).
  9. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other model organisms for sarcomeric muscle diseases. Adv Exp Med Biol. 642, 192-206 (2008).
  10. Khan, A. O., Simms, V. A., Pike, J. A., Thomas, S. G., Morgan, N. V. CRISPR-Cas9 mediated labelling allows for single molecule imaging and resolution. Sci Rep. 7 (1), 8450(2017).
  11. Atoki, A. V., et al. Exploring the versatility of Drosophila melanogaster as a model organism in biomedical research: a comprehensive review. Fly (Austin). 19 (1), 2420453(2025).
  12. Ling, Y. -P., Li, J. -J., Liu, J. -W., Zeng, B., Chen, G. -L., Wang, N. Technical innovations of signal amplification in fluorescence in situ hybridization. Gene. 964, 149647(2025).
  13. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  14. Fernandes, J., Bate, M., VijayRaghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113 (1), 67-77 (1991).
  15. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  16. Dobi, K. C., Schulman, V. K., Baylies, M. K. Specification of the somatic musculature in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (4), 357-375 (2015).
  17. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 56-66 (2017).
  18. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, e34058(2018).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  21. Matera, A. G. Chaperone dysfunction in motor neuron disease: new insights from studies of the SMN complex. Genetics. 229 (3), iyae223(2025).
  22. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Semin Cell Dev Biol. 64, 171-180 (2017).
  23. Reedy, M. K., Reedy, M. C. Rigor crossbridge structure in tilted single filament layers and flared-X formations from insect flight muscle. J Mol Biol. 185 (1), 145-176 (1985).
  24. Fyrberg, E. A., Bernstein, S. I., VijayRaghavan, K. Chapter 14: basic methods for Drosophila muscle biology. Methods Cell Biol. 44, 237-258 (1994).
  25. Volk, T., Fessler, L. I., Fessler, J. H. A role for integrin in the formation of sarcomeric cytoarchitecture. Cell. 63 (3), 525-536 (1990).
  26. Kao, S. -Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches. J Vis Exp. (152), e60309(2019).
  27. Bryantsev, A. L., Castillo, L., Oas, S. T., Chechenova, M. B., Dohn, T. E., Lovato, T. L. Myogenesis in Drosophila melanogaster: dissection of distinct muscle types for molecular analysis. Methods Mol Biol. 1889, 267-281 (2019).
  28. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. J Vis Exp. (56), e3139(2011).
  29. Segal, D. Live imaging of myogenesis in indirect flight muscles in Drosophila. Bio Protoc. 7 (13), e2377(2017).
  30. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in Drosophila pupae. J Vis Exp. 132, e57312(2018).
  31. Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Yatsenko, A. S., Klepzig, A., Shcherbata, H. R. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. J Vis Exp. (46), e2438(2010).
  32. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nat Protoc. 8 (12), 2496-2501 (2013).
  33. Szikora, S., Novák, T., Gajdos, T., Erdélyi, M., Mihály, J. Superresolution microscopy of Drosophila indirect flight muscle sarcomeres. Bio Protoc. 10 (12), e3654(2020).
  34. Szikora, S., et al. Nanoscopy reveals the layered organization of the sarcomeric H-zone and I-band complexes. J Cell Biol. 219 (1), e201907026(2020).
  35. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM dissection for visualizing fluorescently tagged sarcomeric proteins. Bio Protoc. 7 (22), e2606(2017).
  36. Chakraborty, K., VijayRaghavan, K., Gunage, R. A method to injure, dissect and image indirect flight muscle of Drosophila. Bio Protoc. 8 (10), e2860(2018).
  37. Nikonova, E., et al. Bruno 1/CELF regulates splicing and cytoskeleton dynamics to ensure correct sarcomere assembly in Drosophila flight muscles. PLoS Biol. 22 (4), e3002575(2024).
  38. Nikonova, E., Mukherjee, A., Kamble, K., Barz, C., Nongthomba, U., Spletter, M. L. Rbfox1 is required for myofibril development and maintaining fiber type-specific isoform expression in Drosophila muscles. Life Sci Alliance. 5 (4), e202101342(2022).
  39. Rajendra, T. K., Gonsalvez, G. B., Walker, M. P., Shpargel, K. B., Salz, H. K., Matera, A. G. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. J Cell Biol. 176 (6), 831-841 (2007).
  40. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  41. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology. , Academic Press. San Diego. (2013).
  42. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  43. Chakravorty, S., et al. Flightin maintains myofilament lattice organization required for optimal flight power and courtship song quality in Drosophila. Proc Biol Sci. 284 (1854), 20170431(2017).
  44. Tanner, B. C. W., Farman, G. P., Irving, T. C., Maughan, D. W., Palmer, B. M., Miller, M. S. Thick-to-thin filament surface distance modulates cross-bridge kinetics in Drosophila flight muscle. Biophys J. 103 (6), 1275-1284 (2012).
  45. Görög, P., et al. A myofilament lattice model of Drosophila flight muscle sarcomeres based on multiscale morphometric analysis during development. bioRxiv. , (2025).
  46. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  47. Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biol Methods Protoc. 4 (1), bpz010(2019).
  48. Elliott, A. D. Confocal microscopy: principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).
  49. Kaya-Çopur, A., et al. The Hippo pathway controls myofibril assembly and muscle fiber growth by regulating sarcomeric gene expression. eLife. 10, e63726(2021).
  50. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  51. Zhang, X., et al. Mechanoresponsive regulation of myogenesis by the force-sensing transcriptional regulator Tono. Curr Biol. 34 (18), 4143-4159.e6 (2024).
  52. Kouchmeshky, A., McCaffery, P. Chapter six: use of fixatives for immunohistochemistry and their application for detection of retinoic acid synthesizing enzymes in the central nervous system. Methods Enzymol. 637, 119-150 (2020).
  53. Konno, K., Yamasaki, M., Miyazaki, T., Watanabe, M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problem in neuroscience research. Sci Adv. 9 (28), eadf7084(2023).
  54. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  55. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  56. Monani, U. R. Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor neuron-specific disease. Neuron. 48 (6), 885-896 (2005).
  57. Imlach, W. L., Beck, E. S., Choi, B. J., Lotti, F., Pellizzoni, L., McCabe, B. D. SMN is required for sensory-motor circuit function in Drosophila. Cell. 151 (2), 427-439 (2012).
  58. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  59. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  60. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464 (7286), 287-291 (2010).
  61. Baheux Blin, M., Loreau, V., Schnorrer, F., Mangeol, P. PatternJ: an ImageJ toolset for the automated and quantitative analysis of regular spatial patterns found in sarcomeres, axons, somites, and more. Biol Open. 13 (6), bio060548(2024).

Перепечатки и разрешения

Теги

Drosophila
Диссекция мышц непрямого полета Drosophila melanogaster для микроскопических подходов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.