Изучение применения поверхностно-усиленного рамановского биосенсорирования отдельных sEV в диагностике и терапии заболеваний

Summary

Здесь мы представляем протокол анализа отдельных малых внеклеточных везикулов (sEV) с использованием поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (SERS) без меток, что позволяет проводить малоинвазивную диагностику заболеваний и оценивать sEV как терапевтические средства доставки.

Abstract

Этот протокол представляет собой комплексную платформу без меток, которая интегрирует поверхностно-усиленную рамановскую спектроскопию (SERS) с машинным обучением (ML) для обнаружения и молекулярного профилирования отдельных малых внеклеточных везикул (sEV) для диагностических и терапевтических применений. Метод начинается с изоляции sEV с использованием хроматографии с исключением размеров или ультрацентрифугирования. Изолированные везикулы затем анализируются на инженерных нанопирамидных 2D-массиках плазмонного золота, способных к чувствительности к одной везикуле. Используя встроенные биохимические отпечатки рамана, протокол обеспечивает высокоспецифическое обнаружение без внешних меток. После спектрального сбора данные проходят предварительную обработку и анализируют с помощью обученных алгоритмов машинного обучения (например, LDA, SVC) для классификации состояний заболеваний, успешно различая рак желудка от здоровых контролей с помощью sEV из тканей, плазмы и слюны с соответствующими классификационными точностью 90,1%, 70,9% и 60,7%. Кроме того, его терапевтическое применение подтверждается количественной оценкой нагрузки доксорубицина в отдельных sEV, что подтверждается использованием субстратов с графеновым покрытием в качестве внутреннего стандарта. Такой подход позволяет проводить высокопроизводительный анализ, отражающий популяционную гетерогенность, необходимую для раннего выявления заболеваний и понимания эффективности загрузки лекарств на уровне одной пузырьки.

Introduction

Малые внеклеточные везикулы (sEV), обычно диаметром от 30 до 200 нм, естественным образом выделяются клетками в биологические жидкости и содержат белки, липиды и нуклеиновые кислоты, указывающие на их происхождение ^1,2,3. Поскольку неинвазивные биомаркеры присутствуют в слюне, моче и других биологических^{жидкостях 4}, они несут потенциал для ранней диагностики, прогноза и терапевтического мониторинга, особенно в^{онкологии 5,6,7}. ....

Protocol

Сбор человеческих образцов проводился в соответствии с Хельсинкской декларацией и был одобрен Институциональным обзорным советом (IRB) UCLA. Все доноры предоставили письменное информированное согласие перед участием в исследовании.

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались всего 4 линии ячеек: AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), все приобретённые у коммерческого поставщика. Эти клеточные линии культивировались и проходили строго в соответствии с инструкциями и реагентами поставщика. Кондиционированные среды собирались и хранили при -20 °C перед обработкой. В ме....

Results

Успешная реализация одновезикульного протокола SERS даёт отдельные спектры Рамана от отдельных sEV, что позволяет последующей диагностической классификации и мониторингу терапевтической нагрузки лекарств. Рисунок 1 показывает рабочий процесс диагностического исследования рака желудка и приложения для мониторинга sEV с нагружёнными лекарствами по нашему протоколу, представленному здесь, соответственно.

Discussion

Ключевым аспектом этого протокола является подготовка подложки и очистка sEV. Эффективность SERS без меток сильно зависит от создания однородных, высококонформных плазмонных субстратов с сильным усилением «горячей точки». Аналогично, высокочистая изоляция sEV с помощью хроматографии с исключением размеров необходима для создания надёжных и воспроизводимых спектров SERS. Примеси, такие как белковые агрегаты или липопротеины, не только ослабляют сигнал везикул, но и могут запутать.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Термо Фишер Сайентифик	J61196. AP
Медная сетка на 300 меш	Науки об электронной микроскопии	EMS200-Cu
4% параформальдегидное решение	Сигма Олдрич	1004960700
4″ Si пластины	MSE Supplies	WA0810	(100) ориентированный
Ячеточная линия A549	ATCC	CCL-185
Ячеченая линия AGS	ATCC	CRL-1739
Центрифуга с ротором F-35-6-30, 5430	Эппендорф	<сильный>22654306< сильный>
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	Испарение электронным пучком
Cr-травительный раствор	Сигма Олдрич	651826-500ML
Доксорубицин  D-4000	Лаборатории LC	Д-4000_3g
Система ExoView R100 и набор для человеческого тетраспанина ExoView	NanoView Biosciences	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3D-product-illustrations
FeCl3 раствор	Сигма Олдрич	451649
HF-решение	Сигма Олдрич	695068-500ML
Hs 738.St/Int клеточная линия	ATCC	CRL-7869
inVia конфокальный рамановый микроскоп	Ренишоу	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Решение KOH	Сигма Олдрич	417661
Настольные инкубационные/охлаждающие шейкеры MaxQ 4000	Thermo Scientific	SHKA4000 (4320)
Инкубатор MCO-19AIC	SANYO	8380-30-0035
Фильтр Millex-GP	MilliporeSigma	SLGPM33RS	0,22 и микро; m
Микроскоп NanoSEM 230	FEI	SEM-FEI-014
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/product-support /nanosight-range/nanosight-ns300
Клеточная линия NCI-N87	ATCC	CRL-5822
Ультрацентрифуга Optima TLX	Бекман Коултер	8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 Plus	Оксфордский плазмалаб	https://plasma.oxinst.com/ products/rie/plasmapro-800-rie
Полистироловые сферы	Alfa Aesar	<сильный>AA42711AB	500 нм
qEVоригинал/35 нм	Izon	ICO-35
Однослойный графен	MSE Supplies	<сильный>ME0408
Фляга Т-75	VWR	156800
TF20 Высокоразрешающая электромагнитная система	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Раствор уранилацетата	Науки об электронной микроскопии	22400-1