Длинная некодирующая РНК PVT1 усиливает гликолиз при карциноме щитовидной железы, стабилизируя HIF-1α и активируя транскрипцию гликолитических генов

Краткое содержание

В данной статье мы представляем протокол для изучения того, как lncPVT1 регулирует стабильность HIF-1α и экспрессию гликолитических генов в клетках рака щитовидной железы, что позволяет изучать метаболическую регуляцию и потенциальные терапевтические мишени.

Аннотация

Будучи основным видом рака эндокринной системы, карцинома щитовидной железы демонстрирует ускоряющуюся эпидемиологическую тенденцию среди населения. Несмотря на достижения в области методов лечения, рецидивы и метастазирование остаются проблемами. Длинная некодирующая РНК PVT1 (lncPVT1) стала консервативным онкогенным регулятором при различных типах рака, однако ее специфическая функция в TC требует дальнейшего изучения. Наше исследование было сосредоточено на изучении того, как lncPVT1 влияет на гликолиз как в нормоксических, так и в гипоксических условиях с использованием клеточных линий TC TPC-1 и K1. Сверхэкспрессия lncPVT1 значительно увеличивала потребление глюкозы и продукцию лактата в условиях гипоксии, подтверждая его способность увеличивать гликолиз. Кроме того, lncPVT1 активировал ключевые гликолитические гены, такие как GLUT1, HK1, HK2 и PGK1, и способствовал пролиферации клеток TC. Механически lncPVT1 стабилизировал индуцируемый гипоксией фактор 1α (HIF-1α), препятствуя его деградации и приводя к его накоплению. Этот накопленный HIF-1α затем связывается со специфическими регуляторными последовательностями, которые контролируют экспрессию генов, участвующих в гликолизе, в конечном итоге активируя эти гены и повышая гликолитическую активность. Наши результаты показывают, что lncPVT1 регулирует стабильность HIF-1α и экспрессию гликолитических генов, улучшая наше понимание метаболизма ТС и потенциально выявляя новые терапевтические мишени.

Введение

Рак щитовидной железы (ТС), широко распространенное эндокринное злокачественное новообразование, переживает быстрый рост заболеваемости¹. Несмотря на достижения в области терапевтических стратегий, включая хирургические процедуры, лучевую терапию и супрессивную терапию гормонов щитовидной железы, значительная часть пациентов с ТС по-прежнему сталкивается с риском рецидива опухоли и метастазирования, что подчеркивает необходимость более глубокого понимания ее молекулярного патогенеза^. Развитие ТК связано с несколькими установленными факторами риска, включая воздействие ионизирующего излучения, контакт с химическими канцерогенами, употребление табака и ожирение; Тем не менее, сложные механизмы, лежащие в их основе, остаются неуловимыми⁴. Учитывая ограниченное понимание молекулярных механизмов ТК, все большее внимание уделяется некодирующим РНК, особенно некодирующим РНК, из-за их регуляторной роли в развитии рака.

Новые данные свидетельствуют о том, что некодирующие РНК являются ключевыми регуляторами многогранных биологических процессов, особенно в развитии опухолей, с помощью таких механизмов, как альтернативный сплайсинг, регуляция транскрипции и губка микроРНК (микроРНК) ^5,6,7. Вариант транслокации 1 (PVT1) плазмоцитомы расположен ниже хромосомы 8q24.21 и онкогена C-myc^8. Среди них lncPVT1, lncRNA, расположенная ниже онкогена C-myc на хромосоме 8q24.21, привлекла значительное внимание благодаря своей онкогенной роли в нескольких злокачественных новообразованиях, включая рак печени⁹ и почечно-клеточный рак¹⁰. Тем не менее, функциональные последствия lncPVT1 при ТК остаются в значительной степени неизученными.

Раковые клетки подвергаются метаболическому перепрограммированию, что является ключевой особенностью онкогенеза, где они проявляют повышенную гликолитическую активность в сочетании с уменьшенным окислительным фосфорилированием, а^{именно эффект} Варбурга. Гипоксия, распространенная особенность микроокружения при солидных опухолях, оказывает глубокое влияние на поведение опухоли, способствуя гликолизу и агрессивности, а также обеспечивая плохой прогноз¹². Индуцируемый гипоксией фактор 1 (HIF-1), ключевой фактор, регулирующий реакцию клетки на низкий уровень кислорода, управляет множеством адаптивных изменений, которые поддерживают выживаемость и прогрессирование опухоли¹³. Предыдущие исследования показали, что lncPVT1 модулирует гликолиз при множественных злокачественных новообразованиях, включая рак молочной железы¹⁴, протоковую аденокарциному поджелудочной железы¹⁵ и остеосаркому¹⁶. Кроме того, было показано, что lncPVT1 усиливает пролиферацию клеток путем стабилизации HIF-1α при карциноме носоглотки¹⁷. Тем не менее, корреляция между экспрессией lncPVT1 и клиническими параметрами не была обнаружена при раке. Кроме того, специфическая функция и механизмы или уникальные клинические проявления lncPVT1 остаются неясными при ТХ. Таким образом, целью данного исследования было изучение того, как lncPVT1 влияет на метаболизм глюкозы в клеточных линиях TC TPC-1 и K1, подвергшихся воздействию нормоксии и гипоксии. Мы изучили влияние сверхэкспрессии lncPVT1 на потребление глюкозы, выработку лактата и пролиферацию клеток. Мы также расшифровали механизмы стабилизации HIF-1α, управляемые lncPVT1, и их результирующее влияние на транскрипционное программирование, связанное с гликолизом. Это всестороннее исследование предлагает новые перспективы того, как lncPVT1 способствует онкогенезу, особенно в контексте метаболического перепрограммирования и гипоксической адаптации.

Протокол

Культивирование и трансфекция клеток

Клеточные линии TPC-1 и K1 карциномы щитовидной железы человека (ТС) культивировали в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 4,5 г/л глюкозы, с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина. Клетки поддерживали при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2. Для лечения гипоксии 1 x 10⁵ клеток переносили в герметичную гипоксическую камеру, уравновешенную 1%_O2, 5%_CO2 и 94%_N2 при 37 °C в течение 24 ч, если не указано иное. Стабильную сверхэкспрессию lncPVT1 (lncPVT1 OE) и соответствующий отрицательный контроль (NC) генерировали в клетках TPC-1 и K1 с использованием системы экспрессии лентивирусов в соответствии с инструкциями производителя.

Оценка уровня глюкозы

Для оценки потребления глюкозы клеточные линии карциномы щитовидной железы культивировали в нормоксических условиях (21%_О2) и гипоксических условиях (1%_О2) в течение 24 ч. Концентрации глюкозы в питательной среде измеряли с помощью набора для анализа глюкозы в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, 2 мкл кондиционированной среды смешивали со свежеприготовленным рабочим реагентом для глюкозы и инкубировали при 37 °C в течение 10 минут. Абсорбцию измеряли на длине волны 530 нм с помощью считывателя микропланшетов для количественного определения уровня глюкозы.

Оценка уровня лактата

Клеточные линии карциномы щитовидной железы TPC-1 и K1 (2 x 10⁴ клеток/лунку) культивировали в нормоксических условиях (21%_O2, 5%_CO2, 37 °C) и гипоксических условиях (1%_O2, 5% CO₂, 37 °C) в течение 24 ч. После инкубации культуральные планшеты центрифугировали при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре до грануляций и мусора. Затем из каждой лунки собирали по 2 мкл осветленной надосадочной жидкости и смешивали с 200 мкл реагента для анализа лактата в 96-луночном планшете. Реакционную смесь инкубировали при 37 °С в течение 10 мин, после чего добавляли стоп-раствор для завершения реакции. Поглощение измеряли на длине волны 530 нм с помощью считывателя микропланшетов. Концентрации лактата определяли путем сравнения значений поглощения со стандартной кривой, полученной из известных стандартов лактата (обычно в диапазоне от 0 до 20 нмоль). Все измерения проводились в трех экземплярах.

Анализ пролиферации клеток

Клетки карциномы щитовидной железы засеивали в 96-луночные планшеты с плотностью 3 x 10^{3 клеток} на лунку в 100 мкл питательной среды. Затем клетки инкубировали в нормоксических (21%_О2, 5%_СО2, 37 °С) или гипоксических (1%_О2, 5%_СО2, 37 °С) условиях в течение 0 ч, 24 ч или 48 ч. В каждый момент времени в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 10 мкл реагента для пролиферации клеток. Затем планшет инкубировали при 37 °C в течение 40 минут. После инкубации оптическую плотность при длине волны 450 нм (OD450) измеряли с помощью считывателя микропланшетов для количественной оценки пролиферации клеток. Все измерения проводились как минимум в трех технических повторах.

Анализ qRT-PCR

Общую РНК экстрагировали из 1 x 10⁶ клеток карциномы щитовидной железы в нормоксических условиях (21% O₂, 5% CO₂, 37 °C) и гипоксических условиях (1% O₂, 5% CO₂, 37 °C) с использованием реагента для экстракции тиоцианата фенол-хлороформа гуанидиния в соответствии с протоколом производителя. Чистоту и концентрацию РНК оценивали спектрофотометрически путем измерения коэффициентов поглощения при длине волны 260/280 нм. Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) 500 нг общей РНК подвергали обратной транскрипции в реакционном объеме объемом 20 мкл, содержащем обратную транскриптазу, случайные гексамерные праймеры, дНТП, ингибитор РНКазы и реакционный буфер. Обратную транскрипцию проводили при 25 °С в течение 10 мин, затем при 42 °С в течение 50 мин и завершали нагреванием при 70 °С в течение 15 мин.

Количественную ПЦР проводили с использованием системы детектирования на основе SYBR Green в общем объеме реакции 20 мкл, содержащей матрицу кДНК (разведение исходного синтеза кДНК от 1:5 до 1:20), мастер-смесь SYBR Green PCR, прямые и обратные праймеры (каждый с концентрацией 0,2 мкМ) и воду, не содержащую нуклеаз. ПЦР-амплификацию проводили на амплификаторе со следующими условиями цикличности: начальная денатурация при 95 °С в течение 3 мин; 40 циклов денатурации при 95°С в течение 15 с, отжига при 60°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 30 с; Затем следует анализ кривой плавления для проверки специфичности амплификации.

Праймерные последовательности для GLUT1, HK1, HK2, PGK1 и GAPDH (табл. 1) были разработаны на основе опубликованных последовательностей¹⁸ и синтезированы в промышленных масштабах. Уровни экспрессии генов-мишеней нормализовали по GAPDH и рассчитывали с помощью метода ^{2-ΔΔCt 19}.

Вестерн-блот

После лечения клетки карциномы щитовидной железы промывали 2 раза холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) и лизировали с использованием буфера радиоиммунопреципитации (RIPA) с добавлением коктейля ингибиторов протеазы. Клеточные лизаты инкубировали на льду в течение 30 мин с прерывистым перемешиванием, а затем центрифугировали при 12 000 x g в течение 15 мин при 4 °C для удаления нерастворимого мусора. Концентрацию белка надосадочной жидкости определяли с помощью анализа на бицинхоновую кислоту (БЦА) в соответствии с инструкциями производителя. Равные количества белка (30 мкг на образец) смешивали с 5-кратным загрузочным буфером, кипятили при 95 °C в течение 5 мин и загружали в 10% SDS-полиакриламидные гели для электрофоретического разделения. Белки разделяли электрофорезом при напряжении 120 В в течение приблизительно 90 мин, а затем переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) с помощью системы мокрого переноса при напряжении 100 В в течение 90 мин при 4 °C. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в трис-буферном физрастворе, содержащем 0,1% Tween-20 (TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре для предотвращения неспецифического связывания. Впоследствии мембраны инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами, разведенными в блокирующем буфере: антителом против HIF-1α (1:3000) и антителом против бета-актина (1:8000). После 3-кратной промывки TBST (каждый в течение 10 мин) мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, разведенными в соотношении 1:5000 в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. После трех дополнительных промывок TBST белковые полосы были визуализированы с помощью улучшенной системы обнаружения хемилюминесценции (ECL) и визуализированы с помощью системы документирования геля.

Двойной анализ люциферазы

Для исследования транскрипционной регуляции генов, связанных с гликолизом, с помощью lncPVT1, клетки TPC-1 засеивали в 24-луночные планшеты с плотностью 1 x^10-5 клеток на лунку и культивировали в DMEM, содержащем 4,5 г/л глюкозы, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина в течение ночи. Клетки ко-трансфицировали 500 нг репортерной плазмиды люциферазы светлячков, вызванной элементом ответа на гипоксию (HRE), и 50 нг контрольной плазмиды люциферазы Рениллы с использованием реагента для трансфекции на основе липидов в конечной концентрации 2 мкл на лунку, в соответствии с инструкциями производителя. Эффективность трансфекции подтверждена включением параллельной трансфекции с GFP-экспрессирующей плазмидой и оценкой экспрессии GFP под флуоресцентным микроскопом через 24 ч после трансфекции. После 24-часовой инкубации в нормоксических (21%_O2) или гипоксических (1%_O2) условиях активность люциферазы измеряли с помощью системы двойного люциферазного репортерного анализа. Активность люциферазы светлячков нормализовали до активности люциферазы Renilla, и это соотношение использовали для сравнительного анализа образцов.

Анализ данных

Все данные были представлены в виде среднего ± SD. Статистические оценки были выполнены в программном обеспечении для статистического анализа. Сравнения между группами проводились с использованием независимых t-критериев, а статистическая значимость определялась на основе порогового значения p-значения менее 0,05.

Результаты

Усиленный гликолиз в клеточных линиях TC, опосредованный lncPVT1

Первоначально мы установили lncPVT1 OE и NC в клетках TPC-1 и K1 с использованием системы экспрессии лентивируса. Успешная гиперэкспрессия lncPVT1 была подтверждена с помощью qRT-PCR (рис. 1A-B). Для оценки влияния на гликолиз клетки культивировали в условиях нормоксии и гипоксии в течение 24 ч. Наши р...

Обсуждение

Являясь наиболее распространенным эндокринным злокачественным новообразованием, ТК создает значительные проблемы с точки зрения рецидива и метастазирования²². Механистический ландшафт канцерогенеза щитовидной железы остается не до конца определенным, особенно в отношении lncRNA-опосредованной регуляции онкогенного метаболического перепрограммирования и фундаментального клеточного^{поведения.} В этом исследовании мы сосредоточились на онкогенн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для анализа белка BCA	Мейлунбио	МА0082-2	Количественный анализ белка WB
Шкаф биобезопасности	Лишень	HFsafe-1200LC	Прохождение и расширение клеток
Центрифуга	Байян	В320А	Центрифужные ячейки
Система хемилюминесцентной визуализации	BIO-RAD(США)	ChemiDoc Touch	Разработка ВБ
CO2 инкубатор	Thermo(США)	311	Клеточная культура
Комплект для обнаружения хемилюминесценции ECL	Мейлунбио	МА0186-1	Разработка ВБ
Проточный цитометр	БД	FACSКалбур	Анализ на апоптоз с помощью проточной цитометрии
Флуоресцентный инвертированный микроскоп	NIKON(Япония)	Ц2-ФЛ	Наблюдение за клетками
Флуоресцентный инструмент для количественной ПЦР	ABI(США)	7300	ПЦР-эксперимент
ГАПДХ	ПротеинТек	60004-1-Иг	Внутреннее референтное антитело WB
Набор для анализа глюкозы	Цзяньчэн	А154-1-1	Биохимический анализ
HIF1A	БОСТЕР	А00013	Антитела WB
HRP-конъюгированный аффинипур козий антимышиный IgG (H+L)	ПротеинТек	SA00001-1	Иммуногистохимический эксперимент (ИГХ)
HRP-конъюгированный аффинипур козий антикроличьи IgG (H+L)	ПротеинТек	SA00001-2	Иммуногистохимический эксперимент (ИГХ)
Клеточная линия K1	Банк ячеек Китайской академии наук (Шанхай, Китай)	NA	Клеточная линия папиллярной карциномы щитовидной железы человека
Набор для анализа молочной кислоты	Цзяньчэн	А019-2-1	Биохимический анализ
Считыватель микропланшетов	Thermo(США)	К3	Обнаружение ИФА
PAGE Набор для сверхбыстрого приготовления геля (15%)	Мейлунбио	МА0384	Электрофорез WB
Инструмент для ПЦР	BIO-RAD(США)	Материал PTC100	ПЦР-эксперимент
Предварительно окрашенный белковый маркер радуги	Мейлунбио	МА0342	Электрофорез WB
Система вертикального электрофореза белка	BIO-RAD(США)	ПАУЭР ПАК 200	Электрофорез WB
SDS-PAGE Буфер для загрузки белка (5X)	Бейотим	П0015Л	Электрофорез WB
Додецилсульфат натрия (SDS)	сигма	151-21-3	Электрофорез WB
Клеточная линия TPC-1	Банк ячеек Китайской академии наук (Шанхай, Китай)	NA	Клеточная линия карциномы щитовидной железы человека