Длинная некодирующая РНК PVT1 усиливает гликолиз при карциноме щитовидной железы, стабилизируя HIF-1α и активируя транскрипцию гликолитических генов

Краткое содержание

В данной статье мы представляем протокол для изучения того, как lncPVT1 регулирует стабильность HIF-1α и экспрессию гликолитических генов в клетках рака щитовидной железы, что позволяет изучать метаболическую регуляцию и потенциальные терапевтические мишени.

Аннотация

Будучи основным видом рака эндокринной системы, карцинома щитовидной железы демонстрирует ускоряющуюся эпидемиологическую тенденцию среди населения. Несмотря на достижения в области методов лечения, рецидивы и метастазирование остаются проблемами. Длинная некодирующая РНК PVT1 (lncPVT1) стала консервативным онкогенным регулятором при различных типах рака, однако ее специфическая функция в TC требует дальнейшего изучения. Наше исследование было сосредоточено на изучении того, как lncPVT1 влияет на гликолиз как в нормоксических, так и в гипоксических условиях с использованием клеточных линий TC TPC-1 и K1. Сверхэкспрессия lncPVT1 значительно увеличивала потребление глюкозы и продукцию лактата в условиях гипоксии, подтверждая его способность увеличивать гликолиз. Кроме того, lncPVT1 активировал ключевые гликолитические гены, такие как GLUT1, HK1, HK2 и PGK1, и способствовал пролиферации клеток TC. Механически lncPVT1 стабилизировал индуцируемый гипоксией фактор 1α (HIF-1α), препятствуя его деградации и приводя к его накоплению. Этот накопленный HIF-1α затем связывается со специфическими регуляторными последовательностями, которые контролируют экспрессию генов, участвующих в гликолизе, в конечном итоге активируя эти гены и повышая гликолитическую активность. Наши результаты показывают, что lncPVT1 регулирует стабильность HIF-1α и экспрессию гликолитических генов, улучшая наше понимание метаболизма ТС и потенциально выявляя новые терапевтические мишени.

Введение

Рак щитовидной железы (ТС), широко распространенное эндокринное злокачественное новообразование, переживает быстрый рост заболеваемости¹. Несмотря на достижения в области терапевтических стратегий, включая хирургические процедуры, лучевую терапию и супрессивную терапию гормонов щитовидной железы, значительная часть пациентов с ТС по-прежнему сталкивается с риском рецидива опухоли и метастазирования, что подчеркивает необходимость более глубокого понимания ее молекулярного патогенеза^. Развитие ТК связано с несколькими установленными факторами риска, вклю....

Протокол

Культивирование и трансфекция клеток

Клеточные линии TPC-1 и K1 карциномы щитовидной железы человека (ТС) культивировали в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 4,5 г/л глюкозы, с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина. Клетки поддерживали при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2. Для лечения гипоксии 1 x 10⁵ клеток переносили в герметичную гипоксическую камеру, уравновешенную 1%_O2, 5%_CO2 и 94%_N2 при 37 °C в течение 24 ч, если не указано иное.....

Результаты

Усиленный гликолиз в клеточных линиях TC, опосредованный lncPVT1

Первоначально мы установили lncPVT1 OE и NC в клетках TPC-1 и K1 с использованием системы экспрессии лентивируса. Успешная гиперэкспрессия lncPVT1 была подтверждена с помощью qRT-PCR (рис. 1A-B). Для оценки влияния на гликолиз клетки культивировали в условиях нормоксии и гипоксии в течение 24 ч. Наши р.......

Обсуждение

Являясь наиболее распространенным эндокринным злокачественным новообразованием, ТК создает значительные проблемы с точки зрения рецидива и метастазирования²². Механистический ландшафт канцерогенеза щитовидной железы остается не до конца определенным, особенно в отношении lncRNA-опосредованной регуляции онкогенного метаболического перепрограммирования и фундаментального клеточного^{поведения.} В этом исследовании мы сосредоточились на онкогенн.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для анализа белка BCA	Мейлунбио	МА0082-2	Количественный анализ белка WB
Шкаф биобезопасности	Лишень	HFsafe-1200LC	Прохождение и расширение клеток
Центрифуга	Байян	В320А	Центрифужные ячейки
Система хемилюминесцентной визуализации	BIO-RAD(США)	ChemiDoc Touch	Разработка ВБ
CO2 инкубатор	Thermo(США)	311	Клеточная культура
Комплект для обнаружения хемилюминесценции ECL	Мейлунбио	МА0186-1	Разработка ВБ
Проточный цитометр	БД	FACSКалбур	Анализ на апоптоз с помощью проточной цитометрии
Флуоресцентный инвертированный микроскоп	NIKON(Япония)	Ц2-ФЛ	Наблюдение за клетками
Флуоресцентный инструмент для количественной ПЦР	ABI(США)	7300	ПЦР-эксперимент
ГАПДХ	ПротеинТек	60004-1-Иг	Внутреннее референтное антитело WB
Набор для анализа глюкозы	Цзяньчэн	А154-1-1	Биохимический анализ
HIF1A	БОСТЕР	А00013	Антитела WB
HRP-конъюгированный аффинипур козий антимышиный IgG (H+L)	ПротеинТек	SA00001-1	Иммуногистохимический эксперимент (ИГХ)
HRP-конъюгированный аффинипур козий антикроличьи IgG (H+L)	ПротеинТек	SA00001-2	Иммуногистохимический эксперимент (ИГХ)
Клеточная линия K1	Банк ячеек Китайской академии наук (Шанхай, Китай)	NA	Клеточная линия папиллярной карциномы щитовидной железы человека
Набор для анализа молочной кислоты	Цзяньчэн	А019-2-1	Биохимический анализ
Считыватель микропланшетов	Thermo(США)	К3	Обнаружение ИФА
PAGE Набор для сверхбыстрого приготовления геля (15%)	Мейлунбио	МА0384	Электрофорез WB
Инструмент для ПЦР	BIO-RAD(США)	Материал PTC100	ПЦР-эксперимент
Предварительно окрашенный белковый маркер радуги	Мейлунбио	МА0342	Электрофорез WB
Система вертикального электрофореза белка	BIO-RAD(США)	ПАУЭР ПАК 200	Электрофорез WB
SDS-PAGE Буфер для загрузки белка (5X)	Бейотим	П0015Л	Электрофорез WB
Додецилсульфат натрия (SDS)	сигма	151-21-3	Электрофорез WB
Клеточная линия TPC-1	Банк ячеек Китайской академии наук (Шанхай, Китай)	NA	Клеточная линия карциномы щитовидной железы человека