Методическая статья

Амилоид и кросс-бета-архитектура

454 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69350

⸱

13 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Sussex

В этой статье

Краткое содержание

Амилоидные фибриллы образуются множеством белков, и образующиеся фибриллы имеют структуру «перекрёстного β слоя». Здесь мы описываем, как образцы амилоидных фибрилл могут быть подготовлены для дифракции рентгеновских волокон и как можно анализировать эти узоры.

Аннотация

Амилоидные фибриллы состоят из неправильно свернутого, самособранного белка, организованного в чётко определённую, повторяющуюся структуру. Они хорошо известны своей важной ролью в заболеваниях, связанных с неправильным сворачиванием белков, включая болезнь Альцгеймера и диабет 2 типа, при которых нерастворимые амилоидные фибриллы откладываются в тканях. Кроме того, было установлено, что они играют важную функциональную роль во многих организмах, обеспечивая прочность, опору и защиту. Первые структурные модели амилоида были основаны на сборе данных по рентгеновской дифракции из пучков выровненных амилоидных фибрилл. Это привело к появлению ранних моделей общей кросс-β структуры, которые были заменены более детальным дифракционным анализом из высокоориентированных и полукристаллических образцов, что привело к детализации организации пептидов в повторяющуюся архитектуру. Здесь мы сосредоточились на описании методов определения базовой архитектуры этих фибрилл и описали общие признаки амилоидных фибрилл из различных патогенных, функциональных и синтетических источников. Мы описываем подготовку образцов, сбор данных и последующий анализ данных для создания структуры модели, которую можно сравнить с экспериментальными данными.

Введение

Амилоидные фибриллы впервые были выявлены в группе заболеваний, известных как амилоидозы, при которых белковые фибриллы накапливаются во внешних пространствахтканей 1. Каждое заболевание характеризуется определённым белоком-предшественником, который претерпевает конформационное изменение, образуя высокоупорядоченные стабильные белковыефибриллы 2,3. Более современное определение амилоидных фибрилл теперь включает фибриллы, накапливающиеся в клеточной среде. В последнее время были выявлены функциональные системы, использующие амилоидную структуру для обеспечения стабильности, адгезии или даже хранения информации. Несмотря на широкий спектр белковых структур, способных самособираться и образовывать амилоидные фибриллы, все они имеют перекрёстную βструктуру 4. Это перекрёстное β впервые было описано Астбери для куриногобелка 5, а позже дополнительно объяснено Геддесом для кросс-βшелка 6. В этой белковой архитектуре фибриллы состоят из β-цепей, которые идут перпендикулярно оси фибриллы, которые затем располагаются в β-слои, соединяющиеся через боковые цепи и образуя то, что позже стало называть стерическимимолниями 7. Это создаёт высокостабильную организацию, удерживаемую вместе водородными связями, идущими параллельно волокну, а также гидрофобным, электростатическим и полярным взаимодействиям через боковыецепи 8.

Ранние структурные исследования использовали дифракцию рентгеновских волокон для изучения структуры амилоидных фибрилл, при этом фибриллы выравнивались и ориентировались, образуя пучок амилоидных фибрилл, который можно было поместить в рентгеновский пучок дифрактометра 9,10. Была создана общая структура амилоидных фибрилл для соответствия дифракционным паттернам нескольких амилоидных фибрилл, извлечённых из тканей человеческих заболеваний или выращенных in vitro4, что послужило основой для дальнейших структурныхописаний 11. В последние годы достижения в твердотельном ядерном магнитном резонансе (ssNMR), микрокристаллической рентгеновской кристаллографии и криогенной электронной микроскопии (CryoEM) обеспечили атомные детали для структуры перекрестногоβ 11. Тем не менее, метод рентгеновской дифракции остаётся важным и полезным, предоставляя информацию о повторяющейся организации белков. Кроме того, в некоторых случаях может быть доступна информация, касающаяся долгосрочного приказа. По сути, дифракция рентгеновских волокон часто используется для подтверждения наличия амилоидных фибрилл, образованных из разных белков, и перекрёстный β является одним из основных требований для классификации волокнистого собрания какамилоид-12.

Здесь мы описываем методику подготовки амилоидных фибрилл и их выравнивание для сбора данных по рентгеновской дифракции. Кроме того, мы предоставляем подробную информацию о том, как дифракционные данные могут быть дополнительно проанализированы для формирования структуры модели, её прогнозируемая дифракционная картина и сравниваем с дифракционными данными из фибрилл, полученных из экс-виво.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка образцов фибриллярных для дифракции рентгеновских волокон

  1. Растворить интересующий белок или пептид в оптимальных условиях для образования фибрилл для выбранного амилоидогенного пептида и оценить образование фибрилл с помощью электронной микроскопии или атомно-силовой микроскопии. Подробности о том, как подготовить образцы и провести визуализацию, доступны вдругом месте 13. Убедитесь, что фибриллы длинные, прямые и неразветвлённые, как показано на рисунке 1. Например, фибриллы, показанные на рисунке 1 , были изображены с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM). Поместите каплю с фибриллами на сетку электронного микроскопа и затем окрашивайте с помощьюуранилацета-14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно равномерное покрытие и распределение фибрилл на сетке.
  2. Выровняйте, чтобы получить пучок фибрилл, оси волокон которых, в идеале, все параллельны (рисунок 2A).
    1. Расплавите воск для свечи до жидкости с помощью горячей пластины. Используя стеклорез, например алмазную ручку, вырежьте боросиликатные стеклянные капилляры длиной около 2–3 см и ненадолго окуните их в жидкий воск. Подтягивайте воск для свечи капиллярным действием (примерно 1-2 мм в длину внутри капилляра). Убедитесь, что восковая поверхность ровная, чтобы фибриловая подвеска могла равномерно лежать.
    2. Используйте пластилин для горизонтального крепления герметичных капилляров в чашке Петри с зазором между восковыми концами (рисунок 2A).
    3. С помощью пипетки аккуратно подвесите каплю раствора объёмом 10 мкл между восковыми концами двух капилляров. Убедитесь, что раствор соприкасается с обоими восковыми концами, но не распространяется на стекло.
    4. Защитите образец от пыли, накрыв чашку Петри. Дайте образцу испариться за ночь, что приведёт к выравниванию фибрилл (см. рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проба может полностью высохнуть несколько дней, и это зависит от температуры и влажности окружающей среды, а также вязкости образца.
    5. Запечатайте пластину; Инкубировать при более низких температурах в холодильнике или инкубировать с использованием влажности в герметичной коробке, чтобы замедлить высыхание, что может привести к лучшему выравниванию образца.
  3. Выровнять амилоидные фибриллы в стеклянном капилляре (рисунок 2B).
    1. Закрепите шприц объёмом 1 мл с небольшим кусочком резиновой трубки на широком конце до капилляра диаметром 0,7 мм с силиконизированным стеклом и аспирируйте 2-3 см фибриловой суспензии.
    2. Герметизируйте один конец капилляра расплавленным воском, а другой конец остаётся открытым для испарения. Разместите капилляр вертикально и дайте ему высохнуть в течение нескольких дней или недель, пока в капиллярной трубке не образовается засохший диск (рисунок 2B).
  4. Выровняйте фибриллы как «мат» или тонкую пленку (рисунок 2C).
    1. Поместите образец фибрилла высокой концентрации (например, >10 мг/мл) на стеклянный стекло, парапленку или кусок тефлона и дайте ему высохнуть на воздухе не менее 24 часов. Она должна высохнуть, образуя тонкую плоскую плёнку на поверхности. Аккуратно поднимите его скальпелем и затем прикрепите к стеклянной капиллярной трубке с помощью клея или пластилина.
    2. Коврик будет иметь случайное расположение фибрилл (см. рисунок 2C). Аккуратно закрепляйте образец на гониометрическую головку так, чтобы рентгеновский луч проходил через край образца и был параллелен плоскости пленки (рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дифракция через поверхность пленки приводит к образованию дифракционных кольцев из-за случайного выравнивания (см. рисунок 2C).
  5. Изучите образец.
    1. Проверьте, насколько хорошо выровнен образец, осмотрев его через перекрестный поляризатор под световым микроскопом. Если присутствует двупреломление, это может указывать на хорошее выравнивание в фибрильном расслоении.
    2. Прикрепите образец капиллярного волокна к головке гониометра с использованием пластилина. Рассмотрим, является ли образец пучком волокна, матом или диском при размещении его в рентгеновском луче.
      1. Обратите внимание, что ось вращения образца будет расположена вокруг оси волокна для расслоения волокон (рисунок 2A), тогда как в дисках волокна стремятся выровняться по диаметру трубки (рисунок 2B). Коврик будет иметь два чётко выраженных направления (параллельно плоскости пленки и перпендикулярно ей) (рисунок 2C).
    3. Собирайте дифракционную картину (как показано на рисунке 3A) с использованием собственного рентгеновского оборудования (CuKα для белковой кристаллографии) или синхротронного излучения. Время экспозиции будет варьироваться в зависимости от интенсивности рентгеновского луча; Корректируйте это в зависимости от рекомендуемого времени сбора для источника дифракции.

2. Анализ данных

  1. Использование CLEARER для анализаданных 15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа анализа дифракционных паттернов рентгеновских волокон доступна бесплатно для академических пользователей у соответствующего автора. Доступны другие методы дифракционного анализа16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)18. Курсивом в скобках обозначают команды меню.
    1. Преобразите дифракционный паттерн в .tiff-файл и загрузите файл в CLEARER (рисунок 4).
    2. Введите дифракционные настройки (Дифракционный паттерн: Дифракционные настройки), включая размер пикселя на TIFF-изображении, источник рентгеновского излучения и образец расстояния до детектора.
    3. Убедитесь, что дифракционная картина ориентирована так, чтобы меридиан был вертикальным (обработка изображений: поворот). Используйте модуль центрирования (Diffraction Pattern: Centre Image) для центрирования изображения. Определим две основные оси (меридиан и экватор): - Этот модуль сравнивает интенсивность вдоль этих двух осей узора. После завершения центрирования сохраните изображение и убедитесь, что оно используется для последующих этапов.
    4. Закажите подходящий угол (установленный по двум главным осям [меридиан и экватор]) и выведите график, показывающий положение дифракционного сигнала относительно интенсивности, используя модуль радиального среднего (дифракционная картина: радиально среднее) (рисунок 4A).
    5. Измеряйте и автоматически выводите позиции дифракционных сигналов с помощью модуля Peak Find (Дифракционная картина: радиальное среднее: Пиковое обнаружение) (рисунок 4B). Убедитесь, что все дифракционные сигналы точно обнаружены, регулируя ширину пикового поиска и не обнаруживая шум.
    6. Проверьте позиции сигнала, выходящие Peak Find , используя модуль Zoom & Measure (Diffraction Pattern: Zoom & Measure). Убедитесь, что все позиции сигналов указаны и назначены по правильной оси.
    7. Изучите размеры элементарных ячеек (b и c), которые будут генерировать наблюдаемые дифракционные сигналы с помощью модуля оптимизации элементарных клеток (Дифракционный паттерн: оптимизация элементарных ячеек) (рисунок 5A). Изучите сильные сигналы на экваторе, чтобы сгенерировать первоначальное предположение для ввода в входную таблицу элементарной ячейки и задать минимальные и максимальные [hkl] индексы, по которым CLEARER ищет потенциальные ячейки (измерение меридиональное и по умолчанию равен 4,76 Å).
    8. Рассчитать размеры потенциальных единичных ячеек и сравнить предсказанные положения дифракционных сигналов с наблюдаемыми отражениями. Элементарные ячейки оцениваются в зависимости от степени согласования между предсказанными и экспериментальными сигналами. Затем показываются двадцать лучших матчей. Рассмотрите длину пептидного предшественника и другую информацию из электронной микроскопии, АФМ или твердотельного ядерного магнитного резонанса (ssNMR), чтобы помочь выбрать наилучшие элементарные ячейки, соответствующие данным и образцу.

3. Структурное моделирование и тестирование модели с использованием CLEARER

  1. Постройте молекулярные модели (формат PDB).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте программы моделирования белков, такие как Pymol (DeLano)19 или Insight II (Accelerys) и другие, чтобы получить PDB-координаты прекурсорного пептида в β-цепочной конформации и в β-листовой структуре. В этом разделе описывается простой процесс, используемый для орторомбической элементарной ячейки (все углы 90°). Неортогональные организации возможны там, где требуется более экспертное знание дифракции. Эти элементы можно исследовать в CLEARER для более сложных элементарных ячеек.
    1. Постройте трёхмерные расположения пептидов в β-листном формате, чтобы поместиться в определённую единичную ячейку(ы). Убедитесь, что эта модель содержит все объекты, связанные с симметрией, внутри ячейки.
    2. Загрузите модель PDB в модуль генератора цепей структур (Дифракционное моделирование: Структуры: генератор цепи структур) для проверки построенных координат конструкции. Убедитесь, что ось волокна и балки правильно назначены. Введите определённые размеры элементарной ячейки. Проверьте, происходит ли столкновение для выбранных размеров ячейки (рисунок 5B).
    3. Загрузите координаты модели PDB в модуль моделирования волоконной дифракции (Diffraction Simulation: Fiber Diffraction Simulation).
      1. Введите направление оси волокна, ориентацию луча, размеры элементарной ячейки, выбранные на шаге 3.1.2, настройки источника и детектора рентгеновского излучения, и нажмите «смоделировать». Для орторомбического моделирования элементарной ячейки ось волокна определяется картезиановой осью, связанной с ориентацией оси волокна в используемой модели.
      2. Убедитесь, что оси пучка перпендикулярны оси волокна, то есть на одной из двух других возможных осей. Сохраняйте настройки симуляции в виде .html файлов (Файл: Сохранить как). Их можно загрузить и отредактировать позже, чтобы итеративно исследовать оптимальную структуру модели.
      3. Сохраняйте полученный смоделированный узор в сыром формате, который можно загрузить позже для дальнейшего анализа или в виде .tiff (в этом формате отбрасывается дополнительная информация о контрасте) (Симуляция: Сохранить видимое изображение как TIFF). Затем сравните их с экспериментальной схемой.
  2. Сравните смоделированные дифракционные картины с экспериментальными узорами для презентации.
    1. Используйте шаги 2.1.5-2.1.6 для измерения имитируемых дифракционных сигналов и сравните с теми, что измеряются по экспериментальным узорам (см. рисунок 6). Запишите это в таблицу.
    2. Используйте модуль под названием Layers (Diffraction Pattern: Layers) для наложения смоделированных и экспериментальных паттернов с целью сравнения позиций сигнала ( рисунок 6C).
    3. Сравните положения сигналов и относительную интенсивность между экспериментальным и смоделированным паттернами, расположив квадрант смоделированного паттерна рядом с экспериментальным узором (как показано на рисунке 6B)8,20,21.
    4. Оценить достоверность предлагаемой единичной ячейки и модели, а затем итеративно изменить модель и ячейку для улучшения сходства между смоделированной картиной и экспериментальной дифракционной картиной.
    5. Подробно сравнивайте результаты различных моделей и ячеек с помощью процедуры, описанной в шаге 3.1, чтобы проверить несколько альтернатив. Убедиться, что информация, собранная с других методов, таких как TEM, AFM и NMR, рассматривается как ограничивающая моделирование и достигает наилучшего структурного представления, соответствующего данным 8,21,22,23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ПримерCcbMet 24: Рисунок 1 показывает электронные микрофотографии, показывающие высокую плотность амилоидных фибрилл на сетке, подходящей для получения образца рентгеновского волокна. Рисунок 2 описывает различные текстуры, которые могут быть получены из волокнистых образцов: пучка волокон (рисунок 2A), диска (рисунок 2B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Дифракция рентгеновских волокон может использоваться для оценки формирования образца амилоидной структуры и получения дополнительного понимания молекулярной организации прекурсорного белка или пептида внутри волокон. Здесь мы описали методы, с помощью которых волокнистые образцы можно подготовить для рентгеновской дифракции волокон, получить данные и затем проанализироваться. Критически важно, что качество полученных данных будет зависеть как от порядка внутри отдельных волокон. Поэтому ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать

Благодарности

Авторы выражают признательность за помощь доктора Павла Сикорского и профессора Эдварда Аткинса в разработке программы CLEARER и анализе паттернов. Программу написал доктор О'Самнер Макин. Эта работа была поддержана финансированием Фонда исследований Альцгеймера и BBSRC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.7 мм в диаметре рентгеновские кварцевые капиллярыGLAS, W. Muller, D-13503, Берлин, ГерманияQ-07-001-80
Стеклянные капилляры 1,5 мм боросиликатныеHarvard appatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)BS4 30-0074пример, доступен у других производителей
Рентгеновский дифрактометр для кристаллографии белковРазличныеРазличные производители

Ссылки

  1. Shirahama, T., Cohen, A. S. High resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril. J Cell Biol. 33, 679-706 (1967).
  2. Buxbaum, J. N., et al. Amyloid nomenclature 2024: Update, novel proteins, and recommendations by the International Society of Amyloidosis (ISA) Nomenclature Committee. Amyloid. 31 (4), 249-256 (2024).
  3. Dobson, C. M. The structural basis of protein folding and its links with human disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1406), 133-145 (2001).
  4. Sunde, M., et al. Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction. J. Mol. Biol. 273, 729-739 (1997).
  5. Astbury, W. T., Woods, H. J., Bragg, W. L. X-ray studies of the structure of hair, wool, and related fibers. II. The molecular structure and elastic properties of hair keratin. Philos Trans R Soc Lond A. 232, 333-394 (1934).
  6. Geddes, A. J., Parker, K. D., Atkins, E. D., Beighton, E. "Cross-beta" conformation in proteins. J Mol Biol. 32 (2), 343-358 (1968).
  7. Sawaya, M. R., et al. Atomic structures of amyloid cross-beta spines reveal varied steric zippers. Nature. 447 (7143), 453-457 (2007).
  8. Makin, O. S., Atkins, E., Sikorski, P., Johansson, J., Serpell, L. C. Molecular basis for amyloid fibril formation and stability. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (2), 315-320 (2005).
  9. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. J Histochem Cytochem. 16 (11), 673-677 (1968).
  10. Kirschner, D. A., Abraham, C., Selkoe, D. J. X-ray diffraction from intraneuronal paired helical filaments and extraneuronal amyloid fibers in Alzheimer disease indicates cross-beta conformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (2), 503-507 (1986).
  11. Ke, P. C., et al. Half a century of amyloids: Past, present and future. Chem Soc Rev. 49 (15), 5473-5509 (2020).
  12. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid. 21 (4), 221-224 (2014).
  13. Morris, K. L., Serpell, L. C. X-ray fiber diffraction studies of amyloid fibrils. Methods Mol Biol. 849, 121-135 (2012).
  14. Al-Hilaly, Y. K., et al. Tau (297-391) forms filaments that structurally mimic the core of paired helical filaments in alzheimer's disease brain. FEBS Lett. 594 (5), 944-950 (2020).
  15. Makin, O. S., Sikorski, P., Serpell, L. C. Clearer: A new tool for the analysis of X-ray fiber diffraction patterns and diffraction simulation from atomic structural models. Appl Cryst. 40 (5), 966-972 (2007).
  16. Winn, M. D. An overview of the CCP4 project in protein crystallography: An example of a collaborative project. J Synchrotron Radiat. 10 (Pt 1), 23-25 (2003).
  17. Squire, J., et al. New CCP13 software and the strategy behind further developments: Stripping and modelling of fiber diffraction data. Fibre Diffr Rev. 11, 7-19 (2003).
  18. Makin, O. S., Serpell, L. C. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2005).
  19. The pymol molecular graphics system. , DeLano Scientific. San Carlos, USA. (2002).
  20. Jahn, T. R., et al. The common architecture of cross-beta amyloid. J Mol Biol. 395 (4), 717-727 (2009).
  21. Madine, J., et al. Structural insights into the polymorphism of amyloid-like fibrils formed by region 20-29 of amylin revealed by solid-state NMR and X-ray fiber diffraction. J Am Chem Soc. 130 (45), 14990-15001 (2008).
  22. Madine, J., Copland, A., Serpell, L. C., Middleton, D. A. Cross-β spine architecture of fibrils formed by the amyloidogenic segment nfgsvqfv of medin from solid-state NMR and X-ray fiber diffraction measurements. Biochemistry. 48 (14), 3089-3099 (2009).
  23. Papapostolou, D., et al. Engineering nanoscale order into a designed protein fiber. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (26), 10853-10858 (2007).
  24. Steinmetz, M. O., et al. Atomic models of de novo designed ccβ-met amyloid-like fibrils. J Mol Biol. 376 (3), 898-912 (2008).
  25. Blake, C., Serpell, L. Synchrotron x-ray studies suggest that the core of the transthyretin amyloid fibril is a continuous β-helix. Structure. 4, 989-998 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

2

Похожие статьи