Комплексный рабочий процесс по протеомике плазмы с помощью масс-спектрометрии: стратегия обнаружения биомаркеров при системных заболеваниях человека

Краткое содержание

Плазменная протеомика позволяет обнаруживать биомаркеры системных заболеваний посредством малоинвазивного отбора проб. Несмотря на аналитические сложности, связанные со сложностью плазмы, в данном исследовании представлен оптимизированный рабочий процесс жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS/MS), который расширяет покрытие протеом, снижает вариабельность и повышает воспроизводимость, позволяя точно сравнивать образцы заболеваний и контрольных.

Аннотация

Плазма, безклеточный компонент крови, представляет собой минимально инвазивный и богатый источник биомолекулярной информации, что делает её идеальной для исследования системных заболеваний. Появление высокопроизводительных протеомных технологий произвело революцию в анализе плазмы, позволив масштабно идентифицировать и количественно оценивать циркулирующие белки. Эти достижения способствовали обнаружению биомаркеров для ранней диагностики, прогнозирования и терапевтического таргетирования различных расстройств, включая рак и воспалительные заболевания. Однако врождённая сложность плазмы, а также непоследовательные методы подготовки и анализа образцов исторически ограничивали покрытие протеома и воспроизводимость. Ранние методы, основанные на грубом анализе плазмы, часто страдали от низкой консистенции и значительных эффектов в партиях, что затрудняло проведение надёжных сравнительных исследований в клинических когортах.

Для преодоления этих ограничений текущее исследование вводит надёжный и масштабируемый рабочий процесс протеомики плазмы. Протокол интегрирует ключевые подготовительные этапы, такие как иммунодеструкция, фильтрация молекулярной массы, лиофилизация, количественная оценка и нормализация белков, ферментативное пищеварение и профилирование LC-MS/MS. Эта оптимизированная стратегия значительно увеличивает глубину протеома и снижает вариабельность, что позволяет более точный и воспроизводимый дифференциальный анализ экспрессии белков между случаями заболевания и здоровой контрольной группой. Этот рабочий процесс предоставляет ценную платформу для исследователей, стремящихся генерировать высококачественные протеомные данные из плазмы, что в конечном итоге способствует развитию биомаркерной диагностики и персонализированной медицины.

Введение

Плазма, безклеточный компонент крови, всё больше признаётся как резервуар биологической информации, важный для изучения заболеваний. Он содержит множество разнообразных циркулирующих биомолекул — от белков и метаболитов до липидов и нуклеиновых кислот, что отражает физиологический и патологический статус организма. Эта системная природа плазмы делает её идеальным биообразцом для изучения патофизиологии заболеваний — от рака до метаболических и воспалительных расстройств. Главное преимущество использования плазмы в качестве образца заключается в минимально инвазивном методе сбора, позволяющем многократный отбор проб в клинических условиях, что важно для наблюдения за прогрессированием заболевания или терапевтическим ответом. Однако плазма демонстрирует чрезвычайно сложную протеомную матрицу, при которой белки, такие как альбумины и иммуноглобулин, охватывают более десяти порядков величины, скрывая^{идентификацию 1}.

За последние два десятилетия протеомика плазмы позволила выявлять клинически значимые биомаркеры, такие как бета-человеческий хорионический гонадотропин (β-hCG) и тропонин I, благодаря достижениям в масштабных технологиях анализа^{белков 2}. Эти инструменты принимают, в качестве входа, высокочувствительную информацию и благодаря своей высокой пропускной способности обеспечивают масштабное профилирование белков плазмы. С появлением платформ жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS/MS) теперь возможно анализировать тысячи видов белков, используя всего 10–50 мкл плазменного входа, с динамическим диапазоном обнаружения, охватывающим несколько порядков^{величины 3,4}. Это увеличило использование протеомики плазмы в трансляционных исследованиях: раннее выявление заболеваний, улучшенные прогностические модели и открытие новых терапевтических^{целей 5}.

Важным этапом в этой области стало создание проекта Human Plasma Proteome (HUPO-HPPP), который системно каталогизировал плазменные белки и продемонстрировал возможность использования протеомики плазмы как устоявшегося^{направления 6}. Впоследствии Консорциум по анализу клинических протеомных опухолей (CPTAC) принял строго валидированные протоколы и межлабораторные исследования для решения вопросов воспроизводимости, которые ранее ставили в затруднение протеомные^{исследования 7}. Эти инициативы подчеркнули необходимость стандартизации и выделили ключевые процедуры, включая равномерное обращение с плазмой, истощение обильных белков, ферментативное переваривание и согласованные параметры LC-MS/MS. Недавние исследования Гейера и коллег показали, что протеомные сигнатуры плазмы могут надёжно генерироваться у многих людей при использовании стандартизированных методологий, что служит основой для исследований на популяционном уровне и процессов валидации^{биомаркеров 8}.

Развитие протеомики плазмы значительно повлияло на признание контроля качества (QC) и показателей производительности как ключевых компонентов экспериментального проектирования. Традиционно различия в эффективности переваривания, частоте идентификации пептидов и производительности приборов приводят к несоответствиям между исследованиями, что влияет на воспроизводимость. Было проведено множество исследований для решения этих проблем. Гавор и др. изложили измеримые показатели качества для подготовки образцов и эффективности масс-спектрометрии, предоставив таким образом систематический метод оценки прочности фильтрующего трубопровода^{белка 9}. Цантилас и др. представили компьютеризированные инструменты бенчмаркинга, которые позволяют исследователям сравнивать наборы данных между платформами и лабораториями, тем самым повышая прозрачность при представлении протеомических^{данных 10}. Кроме того, достижения в методологии, такие как иммунообестрация, фракционирование с исключением размера и независимое от данных (DIA), улучшили покрытие протеомов и снизили техническую^{смещённость 11,12}. Такие меры обеспечения качества обеспечивают воспроизводимость протеомных данных плазмы и служат основой для будущих клинических трансляционных исследований.

Несмотря на эти значительные достижения, врождённая плазме сложность по-прежнему несёт в себе трудности. Часто прямой анализ сырой плазмы даёт неоптимальное покрытие протеом, поскольку очень обильные белки перевешивают аналиты с низким содержанием, многие из которых являются наиболее перспективными кандидатами на биомаркеры. Кроме того, технические различия, вызванные переменным количеством белков, неполным пищеварением и недостаточной очисткой, могут способствовать артефактам в партиях и снижению сопоставимости^{когорт 13}. Эти ограничения подчёркивают необходимость высокооптимизированных рабочих процессов, которые балансируют глубину протеома, воспроизводимость и масштабируемость. Этот протокол исследования удовлетворяет эту потребность, демонстрируя оптимизированный рабочий процесс протеомики плазмы, сочетающий иммунообедлинство, фильтрацию по молекулярному весу, лиофилизацию, нормализацию и количественное определение белков, ферментативное пищеварение и профилирование LC-MS/MS. За счёт увеличения покрытия протеомов и снижения технической вариативности, методологическая основа позволяет обеспечить последовательную относительную количественную оценку между заболевающими и контрольными группами. Благодаря внедрению масштабируемости и учтению последующих анализов, рабочий процесс предоставляет удобный, воспроизводимый метод извлечения клинически значимой информации из протеомики плазмы.

Протокол

Этот протокол описывает упрощённый рабочий процесс, направленный на улучшение плазменной протеомики для обнаружения биомаркеров при системных воспалительных^{заболеваниях 14,15}. Исследование проводилось в соответствии с Комитетом по институциональной этике и Хельсинкской декларацией 1975 года, пересмотренной в 2000 году. Участники получили информированное согласие. Изначально образцы плазмы проходят иммунодеплоцирование для удаления белков с высоким содержанием, затем фильтрацию на основе молекулярной массы для снижения сложности образца. Образцы затем лиофилизируются и количественно измеряются, чтобы обеспечить достаточную концентрацию белка для дальнейшей обработки. После нормализации белки подвергаются триптическому расщеплению для получения пептидов, подходящих для анализа. Наконец, масс-спектрометрия используется для обнаружения и количественной оценки белков с низким содержанием, что позволяет достоверно сравнивать здоровые и болезненные состояния (рисунок 1) показывает конвейер кровяной протеомики.

1. Сбор образцов:

1. Получить 3 мл крови у участников вакутейнерных трубок с этиледиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) путем венипункции из претенкубитальной вены в асептических условиях. Этим занимается обученный флеботомист.
2. Для разделения плазмы центрифугуйте образцы (ротор с фиксированным углом 12 × 15 мл) в течение 10 минут при 704 г. Храните образцы плазмы при -80 °C до последующего осмотра.

2. Иммунодефицит

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунодеполяция — это метод, основанный на аффинной хроматографии, используемый для селективного удаления белков с высоким содержанием из биологических жидкостей, таких как сыворотка, плазма и спинномозговая жидкость (СМЖ). Спин-картридж, содержащий иммобилизованные антитела, нацеливается и захватывает 14 распространённых белков с высоким содержанием, включая альбумин, иммуноглобулины (IgG, IgA, IgM), трансферрин и комплемент C3. Эти белки сохраняются в картридже, а белки с низким содержанием проходят для дальнейшего анализа. Этот метод улучшает протеомное профилирование, снижая сложность образцов и улучшая обнаружение потенциальных биомаркеров. Этот подход широко применяется в протеомике плазмы для повышения чувствительности и^{воспроизводимости 16,17}.

1. Подготовка патронов
   1. Достаньте вращение картриджа объемом 0,45 мл из холодильника. Оставьте её уравновесить до температуры окружающей среды.
   2. Подготовьте Буфер А Эквивалент/Загрузка/Промывка и Буфер Б в соответствии с количеством обработанных образцов. Наносите примерно 5 мл буфера A и 2 мл буфера B на образец плазмы объёмом 10 мкл. Декантировать в стерильные центрифугные трубки объёмом 50 мл.
   3. Маркируйте два стерильных шприца Luer-Lok по 5 мл: A для буфера A и B для буфера B.
2. Подготовка образца плазмы
   1. Разбавьте каждые 10 мкл образца плазмы с помощью 190 мкл буфера A до итогового объёма 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте ингибиторы протеазы в буфер A, чтобы избежать разрушения плазменных белков во время обработки.
   2. Плазменный образец может содержать частицы. Это может забить картридж. Чтобы предотвратить закупорку и повысить прозрачность образца, разведенный образец центрифугировать через спин-фильтр 0,22 мкм в течение 1 минуты при 16 000 × г при 4 °C.
3. Настройка картриджа
   1. Снимите крышку картриджа и нижнюю крышку и уберите их для последующего использования.
   2. Поставьте адаптер Luer-Lok на спин-картридж.
   3. Вытащите 4 мл буфера A из шприца с надписью «A» и подключите шприц к адаптеру Luer-Lok.
   4. Постепенно пропустите буфер A через картридж, чтобы смола могла уравновеситься и вытеснить захваченный воздух.
   5. Аспирируйте лишний буфер сверху картриджа стерильной микропипеткой.
   6. Снимите адаптер Luer-Lok и вложите вращательный картридж в винтовую трубку с маркировкой F1.
4. Загрузка образцов и сбор фракций
   1. Добавьте 200 мкл фильтрованной, разбавленной плазмы непосредственно на слой смолы.
   2. Центрифугуйте патрон при 100 × г в течение 1 минуты при 4 °C. Оставьте картридж открытым или свободно закрытым, чтобы обеспечить плавный поток.
   3. Соберите проточную фракцию F1 в маркированной сборной трубке. Убедитесь, что смоляный слой и фрит остаются влажными после центрифуга.
   4. Дайте картриджу постоять при комнатной температуре 5 минут.
5. Промывка и восстановление проточных фракций
   1. Добавьте 400 мкл буфера A на слой смолы и центрифугуйте при 100 × г на 2,5 минуты при 4 °C. Добавьте этот элюат в трубку F1.
   2. Перенесите картридж в новую трубку с маркировкой F2.
   3. Добавьте ещё 400 мкл буфера A и центрифугуйте при 100 × г на 2,5 минуты при 4 °C. Соберите элюат в трубке F2.
6. Элюция связанных белков
   1. Снимите картридж из трубки F2 и подключите адаптер Luer-Lok.
   2. Наполните шприц с маркировкой «B» 2,5 мл буфера B и прикрепите его к картриджу.
   3. Медленно протолкните Буфер B через картридж, чтобы элюировать связанные белки с высоким содержанием в свежую трубку для сбора информации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости дополнительного анализа сохраняйте ограниченную часть; В противном случае выбрасывайте правильно.
7. Реуравновесление картриджа
   1. Вынимите шприц с буфером B из картриджа и прикрепите шприц с маркировкой «A», содержащий 5 мл буфера A.
   2. Медленно пропустите Buffer A через смоляную подложку, чтобы уравновесить картридж с расходом 0,5 мл в минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не давайте смоляному столу или фриту высохнуть. Оставьте небольшое количество буфера сверху фрита во время хранения.
   3. После равновесия картридж готов к следующему образцу.
8. Дальнейшее использование
   1. Для максимального восстановления белков с низким содержанием комбинируйте фракции проточного количества F1 и F2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: F1 и F2 также могут анализироваться отдельно, если требуется дифференциальный анализ. Добавленный буфер составляет 1 мл, поэтому суммарная фракция F1 может составлять ~850 мкл для обеспечения хорошего восстановления. Проанализировать природную плазму, проток и элуат с помощью электрофореза гель натрия додецилсульфата-полиакриламида (SDS-PAGE), чтобы подтвердить удаление 14 основных белков с высоким содержанием из прохода. 12,5 мкл потока через F1, сырую плазму и элуат будут использованы для загрузки в гель, чтобы получить объём скважины 25 мкл (буфер образца Леммли: соотношение образцов 2:1)

3. Концентрация белка с помощью спин-концентратора мощностью 5 кДа

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца с помощью спинового концентратора мощностью 5 кДа основана на принципе исключения размера и молекулярной фильтрации для достижения быстрой концентрации и высокого восстановления целевых биомолекул в одной трубке. Это позволяет концентрировать белки путём удаления растворителя и буфера или обезсоления раствора белка.

1. Заполните спин-концентратор до 4 мл образца белка.
2. Поместите концентратор вращения в холодильную центрифугу.
3. Центрифугировать при 5 000 × г при 10 °C в течение 30 минут или до достижения желаемого уменьшения объёма (например, 30× концентрации).
4. Вынимите концентратор спина из центрифуги и извлеките концентрированный образец из нижней части камеры с помощью микропипетки. Для обеспечения хорошего восстановления ожидается получение концентрата ~150 мкл из общей суммы 850 мкл белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мембрана не высыхает во время центрифуга, чтобы сохранить целостность белка и эффективность восстановления.

4. Осушивание соли и обмен буферов

1. Сбросьте фильтрат из нижней камеры концентратора.
2. Пополните трубку центрифугой равным объёмом буфера бикарбоната аммония объемом 50 мМ (pH 7,2-7,4). (Например, если ретентат составляет 150 мкл, добавьте 150 мкл буфера)
3. Снова центрифугировать при 5 000 × г при 10 °C до достижения исходной концентрации.
4. Повторите этот процесс обмена буфером три раза, чтобы удалить примерно 99% мелких молекулярных загрязнителей, таких как соли или мочевина.
5. Сконцентрируйте образцы белка, сублимизируя их с помощью скоростного вакуумного лиофилизатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорректируйте количество циклов в зависимости от степени обезсоли для последующих приложений.

5. Количественное определение белков с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA)

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка в образцах была определена с помощью белкового анализа BCA, стандартом которого был альбумин из сыворотки крупного рогатого скота (BSA). Анализ BCA — это совместимый с детергентом колориметрический метод на основе бицинхониновой кислоты для обнаружения и количественной оценки общего белка. Он основан на восстановлении Cu²⁺ до Cu⁺ белками в щелочной среде (реакция Бьюре), за которым проводится высокочувствительное и селективное колориметрическое обнаружение мядного иона (Cu⁺) с помощью реагента, содержащего бицинхониновую кислоту. Анализ даёт фиолетовый комплекс, образуемый хелированием одного иона купрозы с двумя молекулами BCA. Анализ BCA даёт последовательный линейный отклик с BSA, обеспечивая надёжную стандартную отсылку кривой. Хотя известно, что разные белки дают разные ответы в анализе BCA, использование BSA обеспечивает воспроизводимое относительное количественное измерение по различным образцам. Поскольку наша цель заключалась в нормализации для равномерного набора белка, а не абсолютной количественной оценки каждого вида, калибровка на основе BSA предложила наиболее надёжный и воспроизводимый подход.

1. Процедура
   1. Добавьте по 25 мкл каждого стандарта BSA (рабочий диапазон 20-2000 мкг/мл) и неизвестный образец белка в выделенные колодцы пластины на 96 луц.
   2. Добавьте 200 мкл рабочего реагента BCA в каждую скважину.
   3. Тщательно перемешивайте с помощью микропластинного шейкера в течение 30 секунд.
   4. Накройте пластину и инкубуйте при 37 °C в течение 30 минут.
   5. Доведите тарелку до комнатной температуры.
   6. Измерьте поглощение при 562 нм с помощью считывателя микропластин.
2. Анализ данных
   1. Вычтите среднюю абсорбцию пустого (нулевого белка) из всех значений образца и стандартного поглощения.
   2. Постройте стандартную кривую поглощения и концентрации BSA (микрограмм/микролитр).
   3. Используйте регрессионное уравнение из кривой для расчёта концентраций белков в неизвестных образцах.

6. Нормализация концентрации белка

1. Процедура
   1. Измерять концентрацию белка в каждом образце плазмы с помощью соответствующего количественного метода.
   2. Записывайте концентрацию и общий объём каждого образца.
   3. Подготовьте буфер с бикарбонатом аммония объемом 50 мМ (pH 7,8) в качестве разбавления.
   4. Вычислите необходимое разбавление по формуле C₁V₁ = C₂V₂.
   5. Для образца с концентрацией 1,3 мг/мл и объёмом 100 мкл рассчитайте итоговый объём, необходимый для достижения 1 мг/мл:[V₂ = \frac{1.3 \x 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Вычислите объём буфера для добавления, вычитая начальный объём из конечного объёма: Объём буфера = 130 мкл − 100 мкл = 30 мкл.
   7. Добавьте 30 мкл 50 мМ аммония бикарбоната (pH 7,8) в образец плазмы с 100 мкл.
   8. Аккуратно смешивайте образец с помощью пипетки или кратковременного вихря.
   9. Подтвердите, что конечный объём составляет 130 мкл при нормированной концентрации 1 мг/мл.
   10. Приступайте к подготовке протеомных образцов ниже по потоку.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте точную корректировку концентрации, рассчитав необходимый коэффициент разбавления на основе результатов анализа BCA. Каждый шаг проверяется, а данные приводятся в виде дополнительных данных (Дополнительная таблица 1).

7. Подготовка образцов и триптическое пищеварение

1. Восстановление белка
   1. Добавьте соответствующий восстановитель (например, 1,4-дитиотрейтол [DTT]) в раствор белка в буфере аммония бикарбоната до конечной концентрации 100 мМ.
   2. Инкубировать смесь при 60 °C в течение 30 минут в термомиксере или нагревательном блоке.
      ВНИМАНИЕ: DTT — это раздражитель, и с ним следует обращаться в перчатках внутри вытяжки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная информация о трипсине, используемом для пищеварения, приведена в Таблице материалов. Кратко, для обеспечения высокой специфичности расщепления остатков лизина и аргинина использовался трипсин секвенирующего класса Тозил Фенилаланил Хлорометилкетон (TPCK) для устранения химотриптической активности. Активность фермента была подтверждена на основе спецификаций производителя, соответствующей активности N-бензоил-L-Аргинин этилэфира (BAEE) примерно 1 единица на мг белка. Что касается концентраций DTT и йодо-ацетамида (IAA), мы подтверждаем, что 100 мМ DTT и 200 мМ IAA относятся к стандартным растворам, а не к конечным концентрациям, используемым в реакции. Конечные рабочие концентрации во время восстановления и алкилирования находились в стандартном диапазоне (обычно 5-10 мМ ДТТ и 10-20 мМ ИАА соответственно).
2. Алкилирование остатков цистеина
   1. Дайте образцу остыть при комнатной температуре в течение 5 минут после восстановления.
   2. Кратко центрифуга, чтобы собрать конденсат на дне трубки.
   3. Добавьте 200 мМ IAA, приготовленную в буфере 50 мМ аммония бикарбоната (ABC), чтобы алкилировать восстановленные остатки цистеина.
   4. Инкубировать образец в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы предотвратить деградацию IAA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Йодоацетамид чувствителен к свету и потенциально токсичен; Избегайте экспозиции и обращайтесь при приглушённом освещении.
3. Ферментативное пищеварение
   1. Приготовьте модифицированный трипсин секвенирующего класса в буфере ABC 50 мМ непосредственно перед использованием.
   2. Добавляйте трипсин в каждый образец при соотношении трипсина к белку 1:25 (ч/ч).
   3. Инкубировать реакцию при 37 °C в течение 17 часов, чтобы обеспечить полное ферментное переваривание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное время пищеварения может привести к перевариванию; обеспечьте стабильность температуры во время инкубации.
4. Подавление реакции
   1. Остановите ферментативную реакцию, добавив муравьиную кислоту в каждый образец для достижения конечной концентрации 1,0% (v/v).
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 20 минут, чтобы денатурировать остаточный трипсин и стабилизировать пептидную смесь.
      ВНИМАНИЕ: Муравиная кислота коррозийна; используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и работайте в вытяжке с химическими выпарителями.
5. Восстановление пептидов
   1. Центрифугуйте переваренную пептидную смесь при 3500 г в течение 12 минут при комнатной температуре, чтобы удалить нерастворимый материал.
   2. Аккуратно переместите прозрачный супернатант с переваренными пептидами в автопробоотборные флаконы, не нарушая гранулу.
   3. Храните пептидные растворы при -20 °C до дальнейшего анализа LC-MS/MS.
6. Подготовка к анализу LC-MS
   1. Загрузите образцы пептидов непосредственно в систему LC-MS, оснащённую ионной подвижностью для разделения и анализа пептидов.
   2. Убедитесь, что все флаконы хорошо запечатаны, чтобы предотвратить испарение и загрязнение.

8. Анализ LC MS-MS

1. Загрузка пептидов и обезсоление
   1. Загрузите 1 мкг пептидного образца в образцовый контур в режиме частичной петли.
   2. Обезсолить пептиды с помощью колонки с уловкой C18 путём промывания водным растворителем с 0,1% муравьиной кислоты при расходе 15 мкл/мин в течение 1 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте воду с 0,1% муравьиной кислоты в качестве растворителя A и ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты в качестве растворителя B на протяжении всего процесса.
2. Разделение пептидов
   1. Соедините колонку ловушки по линии с аналитическим колонкой обратной фазы C18.
   2. Элютные пептиды с линейным градиентом от 3% до 40% растворителя B в течение 55 минут при расходе 300 нл/мин.
   3. Промыйте колонку растворителем B 80% в течение 7,5 минут, чтобы удалить оставшиеся компоненты.
   4. Перед следующей инъекцией уравновесьте столбец с 3% растворителем B.
   5. Поддерживайте колонную духовку при 35 °C, а автопробоотборник — при 4 °C во время работы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включайте пустые инъекции между образцами для минимизации переноса.
3. Настройки получения масс-спектрометрии
   1. Масс-спектральный анализ элюирующих пептидов
      1. Настройте систему UPLC и подключите её напрямую к High-Definition-MS.
      2. Управляйте системой с помощью программного обеспечения MS.
      3. Убедитесь, что масс-спектрометр настроен как гибридный квадруполь-ионный инструмент с ускорением и временем полёта (oa-TOF).
      4. Перед началом работы убедитесь, что все соединения азота и замыкающих газов надёжны и не протекают.
         ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с высоковольтными соединениями и газами под давлением в соответствии со стандартами безопасности лаборатории.
   2. Система ионизации
      1. Работайте с масс-спектрометром в режиме положительной электрораспылительной ионизации (ESI) с использованием двойного источника электрораспылительных ионов.
      2. Установите капиллярное напряжение nano-ESI на 3,4 кВ.
      3. Отрегулируйте напряжение конуса образца до 40 В и напряжение в конусе экстракции до 4 В.
      4. Установите поток азота в спектрометрии ионной мобильности (IMS) на 90 мл/мин.
      5. Проверьте стабильность распыления и убедитесь, что постоянный ионный ток перед началом действия.
   3. Разделение ионной подвижности
      1. Установить высоту импульса IMS ионного проводника на 40 В во время ионной передачи.
      2. Отрегулируйте скорость ионного направляющего IMS на 800 м/с.
      3. Линейно увеличивайте высоту движущей волны с 8 В до 20 В на протяжении всего цикла IMS, чтобы добиться оптимального разделения ионов по подвижности.
         ВНИМАНИЕ: Обеспечьте стабильный поток газа IMS; Флуктуации могут влиять на разделение ионов и воспроизводимость времени дрейфа.
   4. Калибровка массы замка
      1. Калибровка анализатора с временем полёта (TOF) с использованием раствора йодида натрия (NaI) с концентрацией 2 мкг/мкл.
      2. Установите калибровочный диапазон на обнаружение ионов от 50 м/ц до 2000 м/з.
      3. Фиксируйте массовые эталонные спектры каждые 45 с с помощью двойного канала источника ионов электроспрея для коррекции массы в реальном времени.
      4. Проверьте, что калибровочная кривая достигает точности массы в пределах ±5 ppm, прежде чем приступать к сбору данных.
4. Сбор данных
   1. Получайте данные в режиме континуум, чередуя две функции:
      1. Функция 1 (MS с низкой энергией): Запись ионных спектров прекурсоров с низкой энергией.
      2. Функция 2 (HDMSE с высокой энергией): Запись спектров ионов фрагментов при повышенной энергии столкновения с разделением ионной подвижности.
   2. В функции 2 установите энергию столкновения в области ловушки на 4 эВ.
   3. Увеличить энергию столкновения в области передачи с 20 эВ до 45 эВ для достижения контролируемой фрагментации пептидов.
   4. Установите время приобретения спектра на одну функцию на 0,9 с, а задержку межсканирования — на 0,024 с.
   5. Мониторинг общей ионной хроматограммы (ТИК), чтобы подтвердить стабильную реакцию прибора на протяжении всего запуска.
   6. Импортировать сырые данные в программное обеспечение для анализа протеомики (например, Progenesis QI или его аналог).
   7. Выровняйте хроматограммы по пробегам с использованием стандартной ссылки на выравнивание или вручную выбранного эталонного запуска.
   8. Идентифицировать пептиды и белки с помощью специально отображённой базы данных (например, UniProt Human — только проверяемые записи).
   9. Задайте следующие параметры поиска:
      Фермент: трипсин
      Фиксированная модификация: карбамидометилирование (C)
      Переменная модификация: окисление (M)
      Пептидная допуск: В зависимости от разрешения прибора
      Пропущенные декольте: 1
      Коэффициент ложного обнаружения (FDR): ≤ 1%
   10. Проведите нормализацию с помощью метода нормализации для всех белков .
   11. Применять пороги фильтрации: ≥2 пептида на белок, ≥1 уникальный пептид, изменение свержения ≥1,5 и скорректированное p-значение <0,05.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это общие рекомендации по безопасности лабораторий — всегда соблюдайте требования EHS (Environmental Health and Safety) учреждения и местные законодательные нормы.
5. Контроль качества
   1. Проведите калибровочные проверки до и после запуска с использованием стандарта NaI для подтверждения точности массы.
   2. Убедитесь, что массовая отсылка замка остаётся стабильной на протяжении всего анализа.
   3. Оценить репликационные инъекции для подтверждения воспроизводимости времени удержания, времени дрейфа и спектральной интенсивности.
      ВНИМАНИЕ: Йодид натрия является раздражителем. При обращении с ними используйте перчатки и избегайте вдыхания или контакта с кожей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Дополнительному файлу 1 для рекомендаций по утилизации отходов. Всегда работайте в холодной среде или на льду при работе с образцами плазмы, чтобы предотвратить разрушение белка. При работе с биологическими образцами и буферами надевайте перчатки с нитрилом, лабораторный халат и защиту для глаз. Выполните этапы центрифугации с использованием охлаждённой центрифуги, предварительно охлаждённой до 4 °C. Убедитесь, что все используемые центрифугные трубки и шприцы стерильны и правильно маркированы, чтобы избежать перекрёстного загрязнения. Всегда используйте протеомную воду для подготовки буферов.

Результаты

Образцы плазмы были обработаны с помощью спин-картриджа для селективного удаления 14 белков с высоким содержанием, а именно альбумина, IgG, IgA, трансферина, гаптоглобина, антитрипсина, фибриногена, альфа2-макроглобулина, альфа1-кислотного гликопротеина, IgM, аполипопротеина AI, аполипопротеина AII, комплемента C3 и транстиретина. Этот этап истощения был критически важен для улучшения обнаружения биомаркеров с низким содержанием в нижнем протеомном анализе. Каждый образец плазмы (8–10 мк...

Обсуждение

Внутренняя сложность плазмы как биологической матрицы представляет собой серьёзную задачу для протеомного анализа. Огромный динамический диапазон концентраций белков, а также преобладание нескольких видов с высоким содержанием могут скрывать обнаружение клинически значимых белков с меньшим содержанием. В этом текущем исследовании мы смягчили эти недостатки, используя многоступенчатый стандартизированный конвейер подготовки образцов, разработанный для селективного обогащения белков умерен...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Концентратор спина с отсечением молекулярной массы 5 кДа	Agilent Technologies	5185 и минус; 5991	Используется для обмена буферов и удаления соли; удерживает белки выше 5 кДа
Аммоний бикарбонат (ABC)	Сигма Олдрич	Номер каталога: T6567	Используется для триптического пищеварения
Buffer A Equil/Load/Wash	Agilent Technologies	5185-5987
Буфер B Elution	Agilent Technologies	5185-5988
Крутая центрифуга	Рефрижераторная центрифуга CPR-30 Plus	Н/Д	Используется для центрифуг белковых образцов при низкой температуре
DTT	Сигма Олдрич	CASNo: 3483-12-3	Используется для триптического пищеварения
Электрофоретический аппарат	BIO RAD	1658004	Используется для SDS PAGE
IAA	Сигма Олдрич	CAS No: 144-48-9	Используется для триптического пищеварения
IMS T-Wave	Воды	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eПодробнееПолная характеристика Мои<Брат/> xturesandMolecules-720004176.pdf	Разделение ионной подвижности (IMS)
Бесконечный многорежимный ридлер M Plex	TECAN		Многопластиночный считыватель
Система LC-MS	Воды	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
Программное обеспечение MassLynx 4.1 SCN781	Воды	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Программное обеспечение для масс-спектрометрии
Патрон с множественным удалением Spin Cartridge Human 14 (MARS Hu-14)	Agilent Technologies	5188 и минус; 6560	Используется для истощения 14 белков плазмы с высоким содержанием, включая альбумин, IgG, IgA, трансферин и др.
Система nanoACQUITY UPLC	Воды	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Воды	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Оперон FDU-7003	Оперон	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Лиофилизатор скоростного вакуума
Белковый анализ Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	Используется для количественного определения концентрации белка с помощью колориметрического анализа
QI Progenesis для протеомики	Воды	V4.2
Лабораторный центрифуга R-8C BL, ротор с фиксированным углом с 12 и более раз; 15 мл	РЕМИ		Центрифуга
SYNAPT G2 MS высокого разрешения	Система HDMSE, корпорация Waters	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Гибридный квадрупольный масс-спектрометр IMS с ортогональной скоростью ускорения (oa-Tof)
Флакон с полным восстановлением	Воды	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Трипсин	Сигма Олдрич	Номер каталога: T6567	Используется для триптического пищеварения