Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Липоевая кислота модулирует путь NRF2/HO-1 для подавления воспаления при грибковом кератите с помощью цитопротекторных механизмов, направленных хозяином

404 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69362

⸱

9 декабря 2025 г.

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan 2nd People's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Липоевая кислота активирует цитопротекторный путь Nrf2/HO-1 при грибковом кератите, снижая уровень воспалительных цитокинов и повреждение роговицы. Эта терапия, направленная на хозяина, демонстрирует превосходные профили безопасности по сравнению с традиционными противогрибковыми препаратами, а также предоставляет механистические данные для лечения глазных заболеваний, вызванных окислительным стрессом, за счёт усиления эндогенных антиоксидантных путей.

Аннотация

Липоевая кислота (LA), дитиол-антиоксидант с образцовым профилем безопасности глаза, была исследована на предмет её способности смягчать окислительно-воспалительные условия, вызывающие грибковый кератит. Эпителиальные клетки роговицы человека переносили LA до 60 мкм без потери жизнеспособности, а после вызова Aspergillus fumigatus LA вызвал трёхкратное увеличение ядерной транслокации, связанной с фактором 2 (Nrf2), и пятикратный всплеск его эффекторной гемекислородазы-1 (HO-1). Фармакологическое заглушание Nrf2 с помощью ML385 или каталитическая блокада HO-1 с помощью оловоного протопорфирина IX устраняло эти молекулярные события и восстановило экспрессию фактора некроза опухолей α, подтверждая строгую зависимость от Nrf2/HO-1. Параллельные эксперименты в модели мышиного кератита подтвердили наблюдения in vitro : местный LA снизил непрозрачность роговицы и воспалительные показатели на 47%, одновременно усиливая экспрессию роговицы Nrf2 и HO-1 при одновременном снижении транскриптов цитокинов вдвое; совместное применение SnPPIX аннулировало эти преимущества. В совокупности данные выделяют согласованную механистическую иерархию, в которой LA при клинически достижимых концентрациях увеличивает уровень белка Nrf2 и усиливает ядерную транслокацию, усиливает активность HO-1 и, следовательно, подавляет патогенно-индуцированную цитокинную турбулентность. Эти результаты позиционируют LA как легко переводимый адъюнкт, направленный на хозяина, способный дополнять противогрибковую химиотерапию, и предлагают более широкие терапевтические горизонты для модуляции Nrf2-центричной модуляции угрожающего зрению воспаления роговицы.

Введение

Грибковый кератит (FK) теперь признан повсеместной офтальмологической чрезвычайной ситуацией, вызывающей более 1 миллиона случаев, подтверждённых культурами, ежегодно и непропорционально большую долю слепоты роговицы в тропических и субтропическихрегионах 1,2. Оценки заболеваемости, близкие к 6-8 на 100 000 в США и ещё выше в аграрных экономиках, подчёркивают растущую глобальную угрозу, которая преимущественно сталкивается с трудоспособным населением после растительной травмы или ношения контактныхлинз 3,4. Ниточчатые грибы, особенно виды Fusarium и Aspergillus, доминируют в этиологическом ландшафте, процветая в тёплом влажном климате и используя микротравмы глаз для запускаинфекции 5.

Несмотря на полвека клинического применения, натамицин 5% остаётся единственным средством, одобренным специально для FK; однако его полиеновая химия обеспечивает плохую проникательность роговицы, требует частого дозирования и не являетсяуниверсальной 6,7. Тревожно, что последовательные исследования наблюдения из Южной Азии выявили постепенное увеличение минимальной ингибирующей концентрации как натамицина, так и триазолов, при этом изоляты фузариума демонстрируют ежегодный рост устойчивости к натамицину на ≥6% и параллельную тенденцию для вориконазолу8. Эти данные совпадают с клиническими отчетами о терапевтических неудачах и подтверждают прогнозы, что рынок FK-терапии расширится с 0,9 миллиарда долларов США в 2023 году до 1,48 миллиарда к 2033 году, в основном из-за недостатков текущей фармакотерапии. Спонтанные хирургические меры, такие как конъюнктивальные лоскуты или проникающая кератопластика, спасают анатомию при непокорных язвах, но требуют ресурсоемких ресурсов и ограничиваютзрение 9. В совокупности эти недостатки подчёркивают необходимость стратегий, ориентированных на хозяина или многоцелевых целей, выходящих за рамки одного лишь фунгистического действия.

Окислительный стресс и возникающий воспалительный каскад теперь считаются ключевыми факторами грибкового патогенеза и рубцов роговицы. При грибковой инвазии эпителиальные клетки роговицы и резидентные иммунные популяции, включая конъюнктивальные тучные клетки, лимбальные дендритные клетки и стромальные кератоциты, инициируют врождённые иммунные ответы с помощью рецепторов распознавания образов, таких как Dectin-1 и Toll-подобныерецепторы 10. Реактивные кислородные формы (ROS), полученные из нейтрофилов, накапливаются в инфицированных стромах в рамках антимикробного окислительного всплеска, в то время как инфильтрирующие макрофаги и Т-лимфоциты поддерживают хроническое воспаление за счёт амплификациицитокинов 11. Парадоксально, но нитчатые грибы усиливают собственные антиоксидантные цепи (например, супероксиддисмутазы, регулируемые Yap1), чтобы выжить в этой враждебной среде. Избыток ROS, в свою очередь, активирует NF-κB-зависимую транскрипцию IL-1β, TNF-α и других провоспалительных медиаторов, способствующих разрушению тканей и затемнениюроговицы 12. В центре эндогенной цитопротекции лежит ядерный фактор 2, связанный с эритроидом 2 фактор 2 (Nrf2), транслокация которого в ядро организует экспрессию гема-оксигеназы-1 (HO-1) и массивы детоксикационных ферментов на различных типах роговиц, включая эпителиальные клетки, кератоциты и эндотелиальныеклетки 13,14. Старение, диабет и хроническое воспаление снижают регуляцию этой оси, делая глазные ткани уязвимыми к окислительным повреждениям, тогда как генетическое или фармакологическое усиление Nrf2 ускоряет закрывание эпителиальной раны и подавляет всплеск цитокинов при различных поврежденияхроговицы 15.

В FK начались исследования доказательств концепции, которые используют этот путь. Природные малые молекулы, такие как перилляльдегид16, галловаякислота 17, гидрокситирозол18 и органоселеновое соединениеebselen 19, достигают двойного противогрибкового и противовоспалительного эффекта, усиливая сигнализацию Nrf2-HO-1 и одновременно напрямую снижая жизнеспособность грибов. Платформы наномедицины, которые совместно предоставляют противогрибковые и антиоксидантные средства, дополнительно иллюстрируют терапевтический потенциал сочетания очищения патогена с усилением защитыхозяина 20,21. Тем не менее, многие из этих кандидатов сталкиваются с трансляционными трудностями, связанными со сложностью формулировки или недоказанной безопасностью глаз.

Липоевая кислота (LA) — это повсеместный антиоксидант дитиола с хорошо зарекомендированной системной безопасностью и исключительной фармакодинамической универсальностью. Основываясь на исследованиях в печеночных и нервных тканях,10,12 LA предлагается напрямую модифицировать остатки цистеина (особенно Cys151, Cys273 и Cys288) на белке-ассоциированном с ECH-похожим на Келха (Keap1), нарушая его взаимодействие с Nrf2 и тем самым предотвращая убиквитинацию Nrf2 и деградацию протеасом, что приводит к повышению уровня белка Nrf2, усилению ядерной транслокации и усиленной транскрипции HO-1. Однако прямое доказательство взаимодействия Keap1-LA в эпителиальных клетках роговицы требует дальнейших исследований. LA продемонстрировала цитопротекторные свойства в печёночных, нейронных и глазных моделях окислительногоповреждения 13,15. Его амфипатический характер способствует проникновению тканей без мембранной токсичности, наблюдаемой у полиэнов, и уже существуют клинические формулы для топических и системных показаний. Тем не менее, способность LA модулировать воспалительные микросреды роговицы и тем самым смягчать FK не была тщательно исследована.

Таким образом, в данном исследовании изучалось, может ли LA смягчить кератопатию, вызванную A. fumigatus, активируя ось Nrf2/HO-1 при одновременном подавлении провоспалительных цитокинов. Используя эпителиальные клетки человеческой роговицы и валидированную мышиную модель FK, мы определили характеристики доза-ответ, проанализировали механистические зависимости с помощью селективных ингибиторов и сравнили терапевтические результаты с неинфицированными контролями и группами, лечившимися с инфицированными транспортными средствами. Насколько нам известно, это первое систематическое исследование, установившее терапевтическую эффективность липоевой кислоты при грибковом кератите посредством комплексной характеристики дозы и ответа, механистической диссекции с использованием селективных фармакологических ингибиторов как Nrf2, так и HO-1, а также валидации как в клеточных, так и в животных моделях. Эта работа уникально интегрирует молекулярные, клеточные и трансляционные данные, предоставляя окончательные доказательства зависимости от путей Nrf2/HO-1, лежащей в основе противовоспалительных эффектов LA. Интегрируя молекулярные, клеточные и in vivo-показатели, мы стремились предоставить всестороннюю оценку LA как легко переводимой терапии, направленной на хозяина, которая решает две основные задачи — уничтожение патогенов и воспалительное ограничение при FK.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (номер протокола: IACUC-2024-FK-007) и проведены в соответствии с заявлением Ассоциации по исследованиям в области зрения и офтальмологии по использованию животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Самцы мышей C57BL/6, возрастом 8-10 недель и весом 20-25 г, содержались в индивидуально вентилируемых клетках при контролируемых условиях 22 ± 2 °C и относительной влажности 50%-60% с циклом светло-тёмное 12:12 часа. Эти специфические животные, свободные от патогенов, были получены в лабораториях Чарльз-Ривер (см. таблицу материалов). Все мыши прошли недельный период акклиматизации для адаптации к новой среде перед экспериментальными процедурами, с неограниченным доступом к стандартной еде и воде для грызунов.

ВНИМАНИЕ: Aspergillus fumigatus — патогенный организм, требующий сдерживания уровня биобезопасности 2. Все грибковые культуры должны храниться в сертифицированном биологическом шкафу с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные халаты и защиту глаз. Диметилсульфоксид (ДМСО) горюча и может проникать сквозь кожу; Обращайтесь в хорошо проветриваемых помещениях и избегайте прямого контакта. Кетамин и ксилазин — это контролируемые вещества, требующие надёжного хранения и надлежащей документации согласно институциональным нормам.

Экспериментальная подготовка
Все необходимые реагенты, лекарства и материалы были подготовлены в соответствии с экспериментальным рабочим процессом (см. таблицу материалов и дополнительный рисунок 1 для схемы). Рацемические (±)-α-липоевой кислоты (LA) были приготовлены с использованием рацеминовой α-липоевой кислоты (1,2-дитиолан-3-пентановая кислота), растворённой в DMSO до концентрации 60 мМ и хранящейся в одноразовых аликвотах при -80 °C для предотвращения окислительного разложения. Ингибитор Nrf2 ML385 и ингибитор HO-1 SnPPIX также были подготовлены и использовались для одноразового применения, чтобы избежать циклов замораживания и оттаивания. Все среды и добавки для клеточной культуры были подготовлены в стерильных условиях и предварительно нагревались до 37 °C перед использованием.

Все материалы, загрязнённые грибковыми культурами, включая агарные пластины, пробирки для культур и одноразовые пластики, автоклавировались при 121 °C в течение 30 минут перед утилизацией в контейнеры для биологически опасных отходов. Химические отходы, содержащие органические растворители, собирались отдельно и утилизировались в рамках институциональных протоколов охраны окружающей среды и безопасности. Ткани и туши животных сжигались с помощью одобренных служб по переработке биомедицинских отходов.

Грибная культура и подготовка к инфекции
Aspergillus fumigatus культивировали на агаре Sabouraud dextrose при 37 °C в течение 5–7 дней, пока не было обнаружено зрелое образование конидиалов. Конидии были собраны путём затопления зрелых культур стерильным фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) с содержанием 0,05% Tween-80, а конидиальные суспензии фильтровались через стерильную марлю для удаления фрагментов гиф. Концентрация конидиального устройства определялась с помощью гемоцитометра и корректировалась под установленные концентрации на основе опубликованных моделей грибкового кератита. Для экспериментов in vitro был выбран 1 x 106 конидий/мл (мультипликатность инфекции 10:1) на основе предыдущих исследований, показавших, что эта концентрация вызывает сильные воспалительные реакции в эпителиальных клетках роговицы при сохранении достаточной жизнеспособности клеток для последующиханализов 16,17. Для исследований in vivo был выбран 1 x 107 конидий/мл, так как этот инокулум вызывает стабильный умеренной тяжести кератит с воспроизводимыми показателями заболевания к пятому дню после заражения, обеспечивая достаточный динамический диапазон для оценки терапевтической эффективности без чрезмернойсмертности 16,19.

Лечение животных и инфекция роговицы
При общей анестезии (внутрибрюшная инъекция кетамина 100 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг) грибковый кератит вызывался путем создания трёх линейных царапин диаметром 1 мм на центральной роговице стерильной иглы 25G, после чего наносили 5 мкл конидиальной суспензии A. fumigatus . Мыши были случайным образом распределены по группам лечения (n=8 на группу): контрольная группа (неинфицированная), инфицированная контрольная, инфицированная + LA лечение (60 мкмоль/л местно 4 раза в день) и инфицированные + LA + SnPPIX (LA плюс 5 мг/кг SnPPIX внутрибрюшинно ежедневно). Клиническая оценка и сбор тканей были проведены на 5-й день после инфекции.

Меры предосторожности при обращении с животными: Все процедуры с анестезиированными животными должны проводиться в асептических условиях. Постоянно контролируйте животных во время анестезии на предмет подавления дыхания. Утилизация загрязнённого постельного белья, хирургических отходов и инфицированных тканей путём автоклава, а затем сжигания в соответствии с институциональными протоколами управления биологическими отходами.

Культивирование и обработка клеток
Эпителиальные клетки человеческой роговицы (HCEC) были получены из ATCC и содержались в среде DMEM/F-12 с добавлением 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота, 1% пенициллин-стрептомицина и 1% L-глутамина в эквимолярных концентрациях при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием CO₂ 5%. Клетки субкультивировались каждые 3-4 дня при достижении слияния 80%-90% и использовались между 3-8 пассажами для обеспечения согласованности. Для экспериментальных обработок клетки засеивались по 5 x 10⁴ клеток на каждую скважину в соответствующих пластинах и давались прилипать в течение 24 часов перед обработкой. Для всех in vitro механистических экспериментов клетки сначала подвергались воздействию Aspergillus fumigatus conidia при мультипликате инфекции (MOI) 10:1 в течение 4 часов для установления инфекции, затем добавляли LA (60 мкм), ML385 (5 мкм) или SnPPIX (1 мкм) отдельно или в комбинации на дополнительные 24 часа до взятия образца. Такой последовательный дизайн позволяет оценивать терапевтическое влияние ЛА на установленные грибковые проблемы, а не профилактическое лечение.

Оценка жизнеспособности клеток (анализ CCK-8)
Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Клетки засеивались в пластинах с 96 колодцями по 5 x 104 клетки на каждую скважину и инкубировали в течение 24 часов перед обработкой. После воздействия лекарства в каждую скважину добавляли по 10 мкл раствора CCK-8, а пластины инкубировали в течение 2 часов при 37 °C. Поглощение измерялось при 450 нм с помощью многорежимного микропластинчатого считывателя. Каждое экспериментальное условие проводилось в октупликации, а эксперименты повторялись три раза независимо друг от друга. Концентрация в контроле транспортных средств (DMSO) поддерживалась ниже 0,1%, чтобы избежать цитотоксичных эффектов.

Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени
Общая РНК была выделена из культивированных клеток и тканей роговицы с помощью RNeasy Mini Kit согласно протоколу производителя. Образцы тканей были гомогенизированы в буфере RLT с использованием тканевого гомогенизатора в течение 2 минут при частоте 50 Гц. Качество и концентрация РНК оценивались с помощью спектрофотометра, при этом образцы имели соотношение 1,8-2,0 260/280 для дальнейшего анализа. Синтез кДНК первой цепочки проводился с помощью Высокоёмких наборов для обратной транскрипции cDNA с общим содержанием 1 мкг за одну реакцию. Количественная ПЦР проводилась с использованием мастер-микса qPCR на основе SYBR Green на системе реального времени с начальной денатурацией при 95 °C в течение 2 минут, затем 40 циклов при температуре 95 °C в течение 15 с и при 60 °C в течение 1 минуты. Для подтверждения специфичности ампликонов был проведен анализ кривой плавления. Все праймеры были проверены на эффективность (90%–110%) и специфику до использования. Относительная экспрессия мРНК рассчитывалась с использованием метода 2(-ΔΔCT ) с GAPDH в качестве эталонного гена.

Экстракция белка и вестерн-блот-анализ
Для полного извлечения белка клетки и ткани лизировались в буфере RIPA с добавлением коктейлей с ингибиторами протеазы и фосфатазы. Ядерные и цитоплазматические белковые фракция были подготовлены с использованием реагентов NE-PER для ядерной и цитоплазматической экстракции согласно протоколу производителя. Концентрации белков определялись с помощью анализа Брэдфорда. Равные количества белка (30-50 мкг) отделялись SDS-PAGE и передавались мембранам PVDF. После блокировки 5% обезжиренным молоком в Tris-буферном физиологическом растворе с 0,1% Tween-20 в течение 1 часа, мембраны инкубировали первичными антителами на ночь при 4 °C, после чего соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с HRP, в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировались с помощью усиленного хемилюминесцентного реагента с временем воздействия от 30 до 180 с в зависимости от интенсивности сигнала. Диапазоны количественно оценивались с помощью программного обеспечения ImageJ, при этом β-актин служил контролем нагрузки для общего количества белков, а ламин B1 — для ядерных белков.

Клиническая оценка и гистологический анализ
Тяжесть заболевания роговицы оценивалась с использованием стандартизированной клинической системы оценки, основанной на установленных протоколах для мышиного грибковогокератита 22. Система оценивания оценивает три параметра по шкале 0–4: непрозрачность роговицы (0 = прозрачная, 4 = полностью непрозрачная), неровность поверхности (0 = гладкая, 4 = сильная язва с перфорацией) и воспалительный ответ (0 = нет инфильтрата, 4 = плотная инфильтрация с гипопионом), что даёт общие оценки от 0 до 12. Все клинические оценки проводились двумя независимыми наблюдателями, прикрытыми для назначений по группам лечения, при этом межнаблюдательное согласие превышало 90%. Фотографии роговицы были сделаны с помощью биомикроскопа с щелевой лампой, оснащённого цифровой камерой. Для гистологического анализа глаза были энуклеированы, фиксированы в 4% параформальдегида, вложены в парафин и секционированы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином для общей морфологической оценки.

Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA)
Секретируемые уровни IL-1β и TNF-α в клеточных культурах и гомогенатах роговицы были количественно измерены с помощью коммерческих наборов ИФА согласно инструкциям производителя. Супернатанты клеточной культуры были собраны после 24 часов обработки, а ткани роговицы были гомогенизированы в PBS, содержащие ингибиторы протеаз. Образцы были центрифугированы при 12 000 x г в течение 10 минут при 4 °C, а для анализа ИФС использовались супернатанты. Все образцы анализировались дублировано, а концентрации цитокинов рассчитывались по стандартным кривым.

Статистический анализ
Все эксперименты проводились с подходящими биологическими репликатами (n ≥6 для in vitro исследований, n =8 для животных) и повторялись не менее 3 раза независимо друг от друга. Данные представлены как среднее ± стандартной ошибке среднего значения (SEM). Анализ данных проводился с использованием GraphPad Prism версии 9.0. В частности, мы использовали функцию теста нормальности (Шапиро-Уилка) для оценки распределения данных, односторонний ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюки для экспериментов с более чем двумя группами и непарный t-тест Стьюдента для двухгрупповых сравнений. Графики генерировались в виде сгруппированных столбчатых диаграмм с отдельными точками данных, наложенных в виде диаграмм рассеяния, при этом полоски ошибок представляли стандартную ошибку среднего.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспериментальный рабочий процесс показал, что лечение липоевой кислотой эффективно модулирует сигнальный путь Nrf2/HO-1 для подавления воспаления в моделях грибкового кератита.

Оценка цитотоксичности липоевой кислоты и специфических для пути ингибиторов
Для установления оптимальных концентраций для каждого используемого соединения были проведены первоначальные исследования доза-ответ. LA продемонстрировала отличную биосовместимость с HCEC, сохраняя жизнеспособность клеток ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящие результаты подтверждают, что липоевой кислота (LA) является мощным индуктором оси Nrf2/HO-1, который смягчает грибковый кератит (FK), снижая экспрессию провоспалительных цитокинов и сохраняя архитектуру роговицы. В соответствии с недавними исследованиями, показывающими устойчивую активацию Nrf2 дитиолановыми соединениямипри окислительных нарушениях 15, LA вызвал пятикратный рост транскриптов HO-1 и вдвое сократил секрецию IL-1β/TNF-α, превзойдя несколько...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет конфликтов интересов, связанных с этой работой. Внешнее финансирование или коммерческие отношения не повлияли на разработку, проведение или интерпретацию исследования.

Благодарности

Это исследование было поддержано внутренним финансированием отделения офтальмологии Цзинаньской 2-й народной больницы. Авторы с благодарностью выражают признательность за техническую помощь, оказанную сотрудниками лабораторий в области поддержания клеточной культуры и процедур моделирования животных. Особая благодарность Институциональному комитету по уходу и использованию животных за обзор и утверждение протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-HO-1Cell Signaling Technology, Данверс, Массачусетс, США#8803
Анти-и бета;-актинSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАA5441
Антиламин B1Абкам, Кембридж, Массачусетс, СШАab16048
Анти-NRF2Абкам, Кембридж, Массачусетс, СШАab62352
Aspergillus fumigatusATCC 204305Н/Д
Набор для проба БрэдфордаБио-Рад Лаборатории5000006
Мыши C57BL/6Лаборатории Чарльз-РиверН/Д
Набор для подсчёта клеток-8 (CCK-8)Dojindo Laboratories, Кумамото, Япония343-07623
DMEM/F-12 mediumGibco, Thermo Fisher Scientific11320033
DMSOСигма-ОлдричD2650
Реагент ECLТермо Фишер Сайентифик32106
Сыворотка плода крупного рогатого скотаGibco, Thermo Fisher Scientific16000044
Капсюль GAPDH ForwardИндивидуальный синтезОбычай
GlutaMAXGibco, Thermo Fisher Scientific35050061
Набор для обратной транскрипции с высокой ёмкостьюПрикладные биосистемы, Thermo Fisher Scientific4368814
Капсюль HO-1 ForwardИндивидуальный синтезОбычай
Обратный капсюль HO-1Индивидуальный синтезОбычай
HRP-конъюгированный антимышиный IgGАбкам, Кембридж, Массачусетс, СШАab205718
HRP-конъюгированный антикроличий IgGАбкам, Кембридж, Массачусетс, СШАab205719
Эпителиальные клетки роговицы человека (HCEC)ATCC, Манассас, Вирджиния, СШАCRL-11135
IL-1 и бета; ELISA KitR& D Systems, Миннеаполис, Миннесота, СШАDY201
Липоевая кислота (LA)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАT1395
ML385 (ингибитор Nrf2)MedChemExpress, Монмут-Джанкшн, Нью-Джерси, СШАHY-100523
Спектрофотометр NanoDrop 2000Термо Фишер СайентификND-2000
Реагенты для ядерной и цитоплазматической экстракции NE-PERТермо Фишер Сайентифик78833
Прямой праймер Nrf2Индивидуальный синтезОбычай
Обратный грунт NRF2Индивидуальный синтезОбычай
PBS с показателем 0,05% Твин-80Индивидуальная подготовкаОбычай
Пенициллин-стрептомицинGibco, Thermo Fisher Scientific15140122
PowerUp SYBR Green Master MixПрикладные биосистемы, Thermo Fisher ScientificA25741
Система ПЦР в реальном времени QuantStudio 5Термо Фишер СайентификA28140
Буфер RIPAИндивидуальная подготовкаОбычай
Мини-комплект RNeasyЦяген, Хильден, Германия74104
Sabouraud dextrose agarИндивидуальная подготовкаОбычай
Биомикроскоп с щельной лампойИндивидуальное оборудованиеН/Д
SnPPIX (ингибитор HO-1)Frontier Scientific, Логан, Юта, СШАF6140
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTek Instruments, Виноуски, Вермонт, СШАSYNHXTTR
TBS-T (0,1% до 20 лет)Индивидуальная подготовкаОбычай
TissueLyser LTЦягэн69980
TNF и альфа; ELISA KitR& D Systems, Миннеаполис, Миннесота, СШАDY210

Ссылки

  1. Kam, K. W., Rao, S. K., Young, A. L. The diagnostic dilemma of fungal keratitis. Eye. 37 (3), 386-387 (2023).
  2. Shaikh, N. R., Choudhary, K. G. Fungal keratitis- an update on the global threat. Int J Adv Res. 11 (03), 51-55 (2023).
  3. Lambert, L. H., Finger, G. E., Tompkins, B. L. Case Report: Vision-Threatening Fungal Keratitis in a Service Member Stationed at Guantanamo Bay. Military Med. 189 (1-2), 379-383 (2023).
  4. Arboleda, A., Ta, C. N. Overview of Mycotic Keratitis. Cornea. 43 (9), 1065-1071 (2024).
  5. Gautam, M., et al. An Emerging Global Threat of Mycotic Keratitis Caused by Uncommon Fungal Species: A Systematic Review and Meta-Analysis. Transl Vis Sci Technol. 14 (4), 4(2025).
  6. Qiu, S., et al. Natamycin in the treatment of fungal keratitis: a systematic review and Meta-analysis. Int J Ophthalmol. 8 (3), 597-602 (2015).
  7. Hoffman, J. J., et al. Topical Chlorhexidine 0.2% versus Topical Natamycin 5% for the Treatment of Fungal Keratitis in Nepal: A Randomized Controlled Noninferiority Trial. Ophthalmology. 129 (5), 530-541 (2022).
  8. Prajna, N. V., et al. Patterns of Antifungal Resistance in Adult Patients With Fungal Keratitis in South India: A Post Hoc Analysis of 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmol. 140 (2), 179-184 (2022).
  9. Khalil, A. S., Baioumy, S. A., Hegab, M. A., Khairy, M. A., Ali, A. G. Temporary Conjunctival Flap Plus Medical Treatment Versus Medical Treatment Only for High-Risk Fungal Keratitis: A Randomized Controlled Trial. Cornea. 44 (7), 866-873 (2025).
  10. Wang, B., et al. Oxidative Stress Initiates Receptor-Interacting Protein Kinase-3/Mixed Lineage Kinase Domain-Like-Mediated Corneal Epithelial Necroptosis and Nucleotide-Binding Oligomerization Domain-Like Receptor Protein 3 Inflammasome Signaling during Fungal Keratitis. Am J Pathol. 193 (7), 883-898 (2023).
  11. Barnes, T. C., Anderson, M. E., Edwards, S. W., Moots, R. J. Neutrophil-derived reactive oxygen species in SSc. Rheumatology (Oxford). 51 (7), 1166-1169 (2012).
  12. Mendoza-Martínez, A. E., Cano-Domínguez, N., Aguirre, J. Yap1 homologs mediate more than the redox regulation of the antioxidant response in filamentous fungi. Fungal Biol. 124 (5), 253-262 (2020).
  13. Zhang, Y. N., Ouyang, W. J., Hu, J. Y., Liu, Z. G. Targeting Nrf2 signaling in dry eye. Int J Ophthalmol. 17 (10), 1911-1920 (2024).
  14. Wang, M. X., et al. Potential Protective and Therapeutic Roles of the Nrf2 Pathway in Ocular Diseases: An Update. Oxid Med Cell Longev. 2020, 9410952(2020).
  15. O'Rourke, S. A., Shanley, L. C., Dunne, A. The Nrf2-HO-1 system and inflammaging. Front Immunol. 15, 1457010(2024).
  16. Fan, Y., et al. Perillaldehyde Ameliorates Aspergillus fumigatus Keratitis by Activating the Nrf2/HO-1 Signaling Pathway and Inhibiting Dectin-1-Mediated Inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (6), 51(2020).
  17. Luan, S., et al. Gallic Acid Ameliorates Aspergillus fumigatus Keratitis Through Reducing Fungal Load and Suppressing the Inflammatory Response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (12), 12(2022).
  18. Gu, L., et al. Hydroxytyrosol downregulates inflammatory responses via Nrf2/HO-1 axis during fungal keratitis and exerts antifungal effects. Int Immunopharmacol. 149, 114202(2025).
  19. Yu, B., et al. Ebselen improves fungal keratitis through exerting anti-inflammation, anti-oxidative stress, and antifungal effects. Redox Biol. 73, 103206(2024).
  20. Liu, X., et al. Macrophage Membrane-Coated Nanoparticles for the Delivery of Natamycin Exhibit Increased Antifungal and Anti-Inflammatory Activities in Fungal Keratitis. ACS Appl Mater Interf. 16 (44), 59777-59788 (2024).
  21. Liu, F., et al. Synergistic wall digestion and cuproptosis against fungal infections using lywallzyme-induced self-assembly of metal-phenolic nanoflowers. Nat Comm. 15 (1), 9004(2024).
  22. Leal, S. M., et al. Distinct Roles for Dectin-1 and TLR4 in the Pathogenesis of Aspergillus fumigatus Keratitis. PLoS Pathogens. 6 (7), e1000976(2010).
  23. Awad, R., Ghaith, A. A., Awad, K., Mamdouh Saad, M., Elmassry, A. A. Fungal Keratitis: Diagnosis, Management, and Recent Advances. Clin Ophthalmol. 18, 85-106 (2024).
  24. Qu, S., Zheng, S., Muhammad, S., Huang, L., Guo, B. An exploration of the ocular mysteries linking nanoparticles to the patho-therapeutic effects against keratitis. J Nanobiotechnol. 23 (1), 184(2025).
  25. Kim, L. N., Karthik, H., Proudmore, K. E., Kidd, S. E., Baird, R. W. Fungal Keratitis, Epidemiology and Outcomes in a Tropical Australian Setting. Trop Med Infect Dis. 9 (6), (2024).
  26. Puumala, E., Fallah, S., Robbins, N., Cowen, L. E. Advancements and challenges in antifungal therapeutic development. Clin Microbiol Rev. 37 (1), e0014223(2024).
  27. Yagishita, Y., Gatbonton-Schwager, T. N., McCallum, M. L., Kensler, T. W. Current Landscape of NRF2 Biomarkers in Clinical Trials. Antioxidants (Basel). 9 (8), (2020).
  28. Li, X., et al. Developing the biomarker panels and drugs by proteomic analysis for autoimmune uveitis and posterior scleritis. iScience. 27 (12), 111389(2024).
  29. Jin, K., Zhang, C. Personalized Medicine in Ophthalmic Diseases: Challenges and Opportunities. J Pers Med. 13 (6), (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Путь Nrf2экспрессия HO-1окислительный стрессвоспаление роговицытерапиянаправленная на хозяинаантиоксидантный ответсупрессия цитокинов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.