Методическая статья

Генерация 3D-альвеолярных органоидов A549/MRC-5, встроенных в коллаген, с использованием механического биореактора с растяжением клеток

DOI:

10.3791/69447

⸱

27 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of British Columbia - Okanagan, 2Centre for Heart Lung Innovation, St. Paul's Hospital, University of British Columbia

* These authors contributed equally

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает генерацию органоидов из альвеолярных эпителиальных клеток A549 и лёгких фибробластов MRC-5 на внеклеточном матриксном гидрогельном каркасе, затем встраивание в 3D-коллагеновые гели и воздействие механического напряжения с помощью биореактора, растягивающего клетки, для исследования альвеолярной механобиологии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя динамика дыхания и механические деформации играют критическую роль в альвеолярной биологии, их вклад в патогенез респираторных заболеваний часто остаётся незамеченным. Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали модель органоидов, в которой альвеолярные эпителиальные фибробластные органоиды подвергаются контролируемому механическому напряжению с помощью биореактора растяжения клеток. Эта платформа воспроизводит пространственную организацию и многоклеточную сложность альвеолярной ткани и позволяет исследовать, как клетко-клеточная коммуникация и механотрансдукция влияют на структуру и функцию тканей в здоровье и заболеваниях. В этом протоколе мы описываем методы генерации и культивирования органоидов эпителиальных фибробластов с использованием клеточных линий альвеолярных эпителий A549 и MRC-5 в внеклеточном матриксе гидрогеля базальной мембраны. Органоиды затем неферментно изолируются и встраиваются в 3D-коллагеновые гели в специализированные пластины биореактора. Мы описываем процедуры применения эквибиаксиального напряжения для имитации патологических дыхательных паттернов, наблюдаемых при респираторных обострениях. Наконец, мы представляем стандартный рабочий процесс характеристики, включая иммунное окрашивание клеточно-специфичных маркеров и иммуноанализы для профилирования высвобождения иммунных медиаторов. Вместе эти анализы поддерживают оценку структуры и функции органоидов. Этот протокол предоставляет удобную, воспроизводимую и адаптируемую платформу для изучения альвеолярной биологии в условиях механического напряжения, с легко изменяемыми параметрами для достижения различных экспериментальных целей и продвижения исследований механизмов заболеваний легких.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Альвеолы являются терминальными мешочками дыхательной системы и служат основным местом газообмена. Они состоят преимущественно из альвеолярных эпителиальных клеток типа I и II, отвечающих за газообмен, иммунные функции и поддержание структурной целостности, а также фибробластов внутри стенок, которые поддерживают гомеостаз внеклеточногоматрикса 1. Эти и другие резидентные клетки постоянно подвергаются воздействию циклического растяжения и сдвигового напряжения во времядыхания 2. Такие механические сигналы преобразуются в биохимические сигналы, влияющие на структуру клетки, дифференцировку икоммуникацию 3.

Патологическое механическое напряжение наблюдается при заболеваниях легких, таких как хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ). ХОБЛ — это прогрессирующее состояние, характеризующееся разрушением паренхимы, хроническим воспалением и сужением мелких дыхательныхпутей 4. При этом заболевании разрушение альвеолярных стенок, потеря эластина, ремоделирование внеклеточного матрикса (ЭКМ), приводящее к фиброзу, и хроническое воспаление вместе снижают способность легких выдерживать структурныеповреждения 5,6. Это приводит к гетерогенной и аномальной альвеолярной деформации при дыхании, которая усугубляется при обостренияхболезни 7,8.

Хотя для изучения альвеолярной биологии использовалось несколько подходов in vitro, каждый из них имеет заметные ограничения. 2D-системы ко-культуры облегчают изучение взаимодействия между клетками, но не отражают архитектуру тканей или динамику внеклеточного матрикса, что снижает физиологическую значимость. Статические 3D-культуры лучше сохраняют структурную организацию и матричные взаимодействия, но при этом не включают динамические механические сигналы, присутствующие in vivo. Микрофлюидные и орган-на-чипе платформы могут имитировать поток жидкости и механическую нагрузку, обеспечивая высокую физиологическую точность, но часто технически сложны, низкопроизводительны идороги 9. В отличие от этого, 3D-механически деформированная органоидная модель, представленная здесь, сочетает структурную сложность, клеточную гетерогенность и контролируемую механическую стимуляцию — аспект, который часто упускается из виду в существующих моделях, — в воспроизводимой, масштабируемой платформе, предлагающей баланс физиологической значимости и экспериментальной доступности10,11.

Для понимания сложных механизмов, способствующих развитию таких заболеваний, как ХОБЛ, и выявления терапевтических мишеней были разработаны модели заболеваний. Несмотря на свою важность, механические штамм часто упускаются из виду в моделях альвеолярных in vitro , используемых для изучения механизмов и патогенезов заболеваний легких, таких как ХОБЛ. Для устранения этого пробела мы предлагаем метод культивирования органоидов альвеолярных эпителиальных фибробластов в базальной матрице, их извлечения и вложения в 3D-коллагеновые гели, применения циклического механического напряжения с помощью биореактора растяжения клеток и оценки ключевых структурных и функциональных результатов. Эти трёхмерные механические органоидные модели лучше отражают клеточные взаимодействия и микроокружение человеческой альвеолярной ниши, что позволяет изучать эпителиально-мезенхимальные перекрёстныеконтакты 12.

Биореактор применяет эквибиаксиальное напряжение с настраиваемыми параметрами, позволяя до 30% удлинения и частоты до 5 Гц для моделирования как физиологической, так и патологической ситуации. В этом исследовании мы собрали органоидные модели, встроенные в гидрогели коллаген-I, подвергшиеся 18% деформации при частоте 0,4 Гц в течение 24 часов, имитируя патологическое дыхание. Мы разработали стандартизированный рабочий процесс характеристики, включающий иммунокрашивание клеточно-специфических маркеров и иммуноанализы для количественной оценки высвобождения иммуномедиатора после механического напряжения. Цель данного исследования — предоставить физиологически релевантную, удобную для пользователя и адаптируемую платформу для изучения альвеолярной биологии в условиях механического напряжения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все этапы требуют асептической техники, стерильных материалов и реагентов, и выполняются в шкафу для биобезопасности для снижения воздействия биологически опасных материалов и загрязнения культур. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Культивирование клеток и формирование клеточных запасов

  1. До формирования органоидов культивировали клетки A549 и MRC-5 на стандартных пластиковых колбах, обработанных в тканевой культуре (T75см²) до примерно 70%-80% совпадения с использованием Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), дополненных 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином, далее называемой «полным DMEM».
  2. Для обоих A549 и MRC-5 семена — 2 x 104 ячейки/см 2, в общем объёме 10 мл полного DMEM. Культивировать клетки при 37 °C с 5%CO2 в увлажнённой среде до достижения примерно 70%-80% совпадения.
  3. Заменяйте посевную среду каждые 48 часов, чтобы обеспечить оптимальные условия роста.
  4. Субкультура, аспирируя все материалы из колбы после слияния на 70%-80%, промывайте один раз тёплым физиологическим раствором, буферированным фосфатом (PBS), затем добавляйте 4 мл трипсина-EDTA.
  5. Инкубировать при 37 °C в течение 5 минут и визуализировать колбы с помощью яркого микроскопа для полного отслоения. Нейтрализуйте, добавив 4 мл полного DMEM.
  6. Подсчитайте ячейки с помощью выбранной техники, например, подсчёта исключения трипана синего цвета.
  7. Центрифугуйте суспензию ячейки при давлении 200 x g на 5 минут.
  8. Аспирируйте супернатант, чтобы на дне конической трубки осталась клеточная гранула. Суспензируйте клеточную гранулу в нужном объёме полного DMEM, аккуратно тритурируя.
  9. Для заморозки повторно суспензировать в полном среде с 10% DMSO, чтобы получить 1 x10 6 клеток/мл. Для образования органоидов ресуспензировать для получения 1 x10 6 клеток/мл.

2. Установление и характеристика созревания 3D-альвеолярной эпителиально-фибробластной органоидной модели

ПРИМЕЧАНИЕ: Матрицу подвала следует размораживать на льду на ночь и держать на льду во время этих этапов. Более высокие температуры могут привести к затвердеванию матрицы.

  1. Подготовьте смесь 2:3 из матрицы подвала и продвинутого DMEM. Добавьте 300 мкл этого раствора в каждую скважину пластины на 24 лунки, обеспечивая равномерное покрытие дна каждой скважины. Инкубировать пластину при 37 °C в увлажнённом инкубаторе в течение 1 часа, чтобы матрица затвердела.
  2. Подготовьте 5% раствор матрицы подвала в полном DMEM, который станет культурной средой для органоидов. Для каждой скважины получите 1,2 мл этого раствора, разбавляя 60 мкл базальной матрицы в 1 140 мкл полного DMEM.
  3. Во время затвердевания матричной смеси в основании смешайте 300 000 элементов A549 с 30 000 элементами MRC-5 в 200 мкл раствора матрицы 5% основания, полученного в полном DMEM, описанном на шаге 2.2.
  4. После того как смесь в основе 2:3 затвердеет, пипетка нанесёт 200 мкл смеси A549/MRC-5 на гельированную матрицу, затем верните 24-ямочную пластину для инкубации при 37 °C, 5% CO₂ в течение 21 дня для роста и дифференцировки альвеолярных органоидов.
  5. Визуализируйте культуры под световым микроскопом в течение следующих 48 часов. Клетки должны агрегироваться в этот период.
  6. Заменяйте 5% матрицу/раствор DMEM каждые 48 часов на 200 мкл свежей 5% среды. Чтобы не нарушать органоиды, встроенные в гидрогель, аккуратно наклоните пластину так, чтобы старый раствор собирался вдоль стенки скважины перед аспирацией.
  7. На 3, 9 и 21-й день созревания снимите органоиды с объективным увеличением в 10 раз и сделайте по четыре репрезентативных изображения или поля зрения каждой ямы. Репрезентативные изображения ранней морфологии органоидов на 3, 9 и 21 дни показаны на рисунке 1.
  8. Для каждого поля зрения подсчитайте все органоиды диаметром более 50 мкм. Используя известную площадь поля зрения, экстраполируйте среднее общее количество органоидов на скважину из среднего количества на поле, предполагая площадь плиты с 24 скважиной 1,9 см².
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти анализы можно проводить с помощью программного обеспечения для анализа изображений, напримерFiji 13.
  9. Средний диаметр и площадь органоидов также можно измерить для получения количественной информации о характеристиках роста органоидов в культуре.

3. Сбор 3D-альвеолярных эпителиально-фибробластных органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы сбора органоидов должны выполняться на льду.

  1. После 21 дня созревания аспирируйте супернатант и аккуратно промывайте примерно 1-2 мл ледяного PBS.
  2. Добавьте 1-2 мл холодного раствора для сбора органоидов и инкубуйте тарелку при 2-8 °C в течение 30-90 минут с умеренным встряхиванием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановите инкубацию, когда органоиды будут плавать на дне колодца.
  3. Отслеживайте диссоциацию с помощью яркой микроскопии. Диссоциация считается полной, когда матрица фундамента на дне колодца больше не видна и органоиды находятся в состоянии подвешенности. Клеточный скребок может быть использован для аккуратного удаления гидрогеля матрицы органоидного фундамента и ускорения процесса.
  4. Содержимое всех колодцев собрать в коническую трубку объёмом 50 мл на льду.
  5. Центрифуга при 500 × г в течение 5 минут при 2-8 °C. Аспирируйте супернатант, промывайте органоидную гранулу 1-2 мл ледяного PBS, затем снова центрифугуйте для получения гранулы. Аспирируйте PBS.

4. Установление 3D-органоидов альвеолярно-фибробластных органоидов и применение механических деформаций

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте круглые пластины для культуры пены с пенопластовыми анкерами, совместимыми с биореактором для растяжения клеток. Используемая в этом протоколе посевная пластина имеет площадь роста ~6,6см 2.

  1. Приготовьте рабочий раствор геля коллагена I 2 мг/мл. Раствор должен содержать 1× PBS, 11,4 мМ NaOH и 2 мг/мл коллагена I, при этом конечный объём регулируется стерильной водой. Приготовьте 2 мл раствора коллагена I на каждую скважину круглой пластины из пены с 6 лунками.
  2. Добавьте 1 мл раствора коллагена I с 2 мг/мл к пенопластовым анкерам на периферии пластины, обеспечивая полное насыщение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пенопластовые анкеры должны быть тщательно насыщены раствором коллагена I для правильного сцепления. Неполное насыщение может привести к отслоению геля коллагена при механическом нанесении деформации, что снижает эффективную деформацию по сравнению с предполагаемой целью.
  3. Органоидную гранулу повторно суспензировать в 6 мл 2 мг/мл коллагена из хвоста крысы и пипетку 1 мл суспензии в середину круглой пенопластовой пластины с 6 колодцами, чтобы смешаться смесь коллагена с органоидным коллагеном, добавленным к круглым якорям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков при добавлении органоидной суспензии в каждую скважину.
  4. Полимеризуйте коллаген-I на 1 час, оставив пластины в инкубаторе (37 °C, 5%CO2). После полимеризации гель должен выглядеть мутным.
  5. Добавьте 2 мл полного DMEM поверх органоидов A549/MRC5 с 3D-коллагеном и верните пластину в инкубатор на 24 часа.
  6. Замените посевную среду на DMEM + 1% FBS и инкубируйте на ночь перед воздействием механической деформации.

5. Установка биореактора с растяжением клеток и воздействие механической деформации

  1. Вставьте погрузочные станции в каждую яме базовой плиты. Они содержат шесть нагрузочных стоек диаметром 25 мм, что позволяет гибкой мембране пластин тканевого поезда деформироваться вокруг них и подвергать 3D-культуру эквибиаксиальному напряжению.
  2. Нанесите тонкий слой силиконовой смазки на верхнюю часть погрузочных стоек.
  3. Поставьте красные прокладки на нижнюю часть каждой пластины с 6 лунками.
  4. Вставьте подготовленные пластины в основание поверхности погрузочных стоек.
  5. Переместите это устройство в увлажнённый инкубатор с температурой 37 °C с 5%CO2 и подключите быстроразъёмные фитинги к основной пластине. Повторите шаги с 5.1 по 5.6, но без соединений, чтобы создать ненапряжённый контроль.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию можно применить герметизационную пробку трубки, которая предотвращает вакуумное давление на дно одной скважины BioFlex, позволяя создавать недеформированную контрольную культуру на той же пластине.
  6. Накройте листом из плексигласа и добавьте ~5-10 фунтов веса, чтобы обеспечить плотную герметичность.
  7. Включите воздушный компрессор и откройте клапан выхода из компрессора.
  8. Включите вакуумный насос давления и откройте клапан давления, подключённый к выходу вакуумного бака. Убедитесь, что вакуумное давление составляет около 90 кПа.
  9. Откройте клапан притока от воздушного компрессора, расположенного рядом с контроллером биореактора. Отрегулируйте давление так, чтобы оно не превышало 15 PSI в вентиляционном отверстии.
  10. Запустите бортовое программное обеспечение и настройте нужные параметры циклической механической деформации. Для этого исследования использовалась схема с амплитудой деформации 18% при частоте 0,4 Гц в течение 24 часа. Для настройки создайте новый режим, установите минимальное удлинение 0%, максимальное — 18%, и запустите протокол.
  11. Наблюдайте за пластиной и мембраной, чтобы убедиться, что движение видно во время тренировки напряжения. Мембрана должна деформироваться вокруг погрузочных стоек.
  12. Периодически проверяйте водяной фильтр на влагу и наблюдайте за временем работы, прогрессом и правильной морфологией режима деформации.
  13. После завершения схемы деформации отсоедините базовую пластину и вернуте процеженные культуры для инкубации в течение 24 часов перед следующим анализом характеристики.
  14. Отключить питание и разобрать систему в обратном порядке запуска: закрыть или закрыть клапан притока воздуха компрессора, затем клапан давления в резервуар, вакуумный насос, клапан вытока воздуха и, наконец, компрессор — в таком порядке.
  15. Собрать супернатант после 24 часов инкубации после воздействия механического напряжения. Храните при -80 °C до использования.

6. Морфологическая характеристика органоидов с помощью иммунофлуоресценции

  1. Промыйте гель-органоид-коллаген три раза PBS, аккуратно добавив 1 мл PBS, инкубируя 5 минут при комнатной температуре.
  2. Аккуратно аспирируйте PBS и повторите процесс промывания всего три раза.
  3. Фиксируйте модель, инкубировав 2 мл 4% параформальдегида в течение 1 часа при 4 °C.
  4. Постирайте модели три раза с помощью PBS, как описано выше.
  5. Используйте скальпель, чтобы аккуратно разрезать круглые поролоновые анкеры в гибких скважинах с прикреплённым коллагеновым гелем и положите его в чашку Петри.
  6. Пермеабилизуйте органоиды путём инкубации с 2 мл тритона X-100 0,1% в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Постирайте модели три раза с помощью PBS.
  8. Блокировать неспецифическое связывание, инкубировав модели с 3 мл 5% бычьей сывороточной альбумина (BSA) в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Удалите раствор для блокировки и переходите к следующему этапу.
  9. Инкубировать модели ночью при 4 °C с окрашивающим коктейлем, содержащим античеловеческий zonula occludens-1 (ZO-1), конъюгированный с Alexa Fluor 594 при разбавлении 1:100, фаллоидин, конъюгированный с Alexa Fluor 488 при разбавлении 1:1000 для оценки F-актина, и ядерную окрашенность DAPI при разбавлении 1:4000. Разбавитель составляет 1 мл 1% BSA в PBS. Перед инкубацией при 4 °C заклеить края пластины лентой.
  10. На следующий день аспирируйте раствор для окрашивающих коктейлей и трижды помойте модели с помощью PBS.
  11. Снимите с помощью конфокального микроскопа Z-стеки с 5 мкм срезов представительных органоидов при 40-кратном объективном увеличении.
  12. Анализируйте интенсивность флуоресценции с помощью программного обеспечения для анализа изображений на Фиджи. Нормализуйте среднюю интенсивность флуоресценции с площадью органоида для точного сравнения в различных условиях окружающей среды.

7. Функциональная характеристика органоидов с помощью анализа цитотоксичности ИФА и лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

  1. Разморозить супернатанты на льду и оценить секрецию интерлейкина-6 (IL-6) и интерлейкина-8 (IL-8) с помощью коммерчески доступных наборов ELISA согласно протоколу производителя.
  2. Оценить наличие выделения ЛДГ, маркера цитотоксичности, с помощью коммерчески доступного теста на поглощение ЛДГ.
  3. Сгенерировать стандартную кривую с использованием рекомбинантного ЛДГ-белка при концентрациях в полулогарифме от 0,5 мкг до 0,5 нг. Интерполировать концентрации LDH из каждого образца с помощью стандартной кривой.

8. Необязательно: выделение образцов для анализа РНК или белков

  1. Вместо добавления 4% параформальдегида для иммунофлуоресцентного окрашивания добавьте подготовленный буфер RLT, содержащий β-меркаптоэтанол при 10 мкл на 1 мл RLT.
  2. Используйте 300 мкл на модель и пипетки вверх и вниз, чтобы полностью отделить и лизировать элементы.
  3. Перенесите лизат в микроцентрифугу без РНазы и положите трубки на сухой лёд для быстрого заморозки. Переведите до -80 °C для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать буфер RIPA для экстракции белка, подготовив: 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4-7,5; 150 мМ NaCl; 1% NP-40 или Triton X-100; 0,5% дезоксихолата натрия; 0,1% SDS в деионизированной воде. Готовый буфер RIPA также доступен в коммерческом продаже.
  4. Добавьте по 200 мкл на модель, погрузите камень на лёд 5 минут, затем собирайте лизат.
  5. Открутить при 15 000 x g в течение 10 минут при 4 °C до обломков пеллетных элементов и перенести на -80 °C для длительного хранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды эпителиально-фибробластных альвеолярных клеточных линий были установлены и культивированы более 21 дня. В течение этого времени наблюдались морфологические изменения: количество органоидов, площадь и диаметр оценивались на 3, 9 и 21 дни для мониторинга роста и развития. Среднее количество органоидов на скважину значительно уменьшилось на 9 и 21 день по сравнению с 3-м днём (рисунок 2A). В отличие от этого, средняя площадь и диаметр органоидов значи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трёхмерные (3D) альвеолярные эпителиально-фибробластные органоиды представляют собой высоко физиологически значимую платформу для моделирования структуры и функции лёгких под механическим напряжением. В отличие от 2D или даже 3D систем ко-культуры, органоиды сохраняют ключевые особенности микросреды лёгких in vivo, включая пространственную организацию, эпителиально-мезенхимальные перекрёстные контакты и взаимодействия внеклеточного матрица (ECM). Механиче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность Центру Providence Airway при Providence Health Care, чей вклад позволил завершить эту рукопись. Эта работа была профинансирована MITACS (ID IT27789) в сотрудничестве с Центром воздушных путей Провиденса (PAC) при Providence Health Care (PHC) и Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) (идентификаторы AWD-024378 и AWD-024440).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифугная трубка объёмом 1,5 млЭппендорф0030 125.215
Коническая трубка объёмом 15 млFisher Scientific14-959-53A
16% параформальдегидТермо Фишер Сайентифик28908
2-меркаптоэтанолМиллипор СигмаM3148
Коническая трубка объёмом 50 млFisher Scientific14-432-22
6-колодящая (гибкая мембранная) круглая поролоновая пластина Tissue TrainFlexcell InternationalTTCF-5001
Ячейки A549Американская коллекция типовой культуры (ATCC)CCL-171
Воздушный компрессорКалифорнийские воздушные инструменты10020DSPCAD
Бычий сывороточный альбуминМиллипор СигмаA9418
Buffer RLTЦягэн79216
CO2 ИнкубаторPHCBIMCO-170AICUVL-PA
Раствор для сбора органоидов CultrexBio-Techne3700-100-01
Цитотоксичный тест CyQUANT LDHТермо Фишер СайентификC20300
DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол)Термо Фишер СайентификD1306
ДиметилсульфоксидСигма ОлдричD2650-100ML
Дульбекко модифицированный Eagle' Среда (DMEM)Термо Фишер Сайентифик11965092
Микроскоп EVOS XL CoreТермо Фишер СайентификAMEX1200
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)Термо Фишер СайентификA5209501
Программное обеспечение для анализа изображений на ФиджиНациональные институты здравоохранения
Flexcell FX-6000 Tension and Tissue Train (включает регулятор натяжения Flexlink FX-6000, резервуар давления, основание, акриловое окно, цилиндрические погрузочные станции диаметром 25 мм, водяной ловушник, программное обеспечение FlexSoft FX-6000 V1.0 и различные трубки)Flexcell InternationalFX6000T
Человеческий интерлейкин-6 Duoset ELISABio-TechneDY206
Человеческий интерлейкин-8 Duoset ELISABio-TechneDY208
Конфокальный микроскоп Leica DMi8Leica Microsystems11889122
Матригель Матригель Базальная МембранаКорнинг356237
Ячейки MRC-5ATCCCCL-185
ПарафильмМиллипор СигмаP7793
Пенициллин/стрептомицин (пен/стрептококк)Термо Фишер Сайентифик15140122
Зонды для маркировки фаллоидина, Alexa Fluor 488Термо Фишер СайентификA12379
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Термо Фишер Сайентифик14190-144
Коллаген крысиного хвоста IСигма-ОлдричC3867
Рекомбинантный человеческий лактатдегидрогеназный белок (активный)AbcamAb93699
Буфер лизиса RIPAТермо Фишер Сайентифик89901
Микрофужные трубки без РНазыТермо Фишер СайентификAM12400
T75 см2 фляжка культурыГрейнер658175
Triton X-100Сигма-ОлдричX100-5ML
Моноклональное антитело ZO-1 (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594Термо Фишер Сайентифик339194

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knudsen, L., Ochs, M. The micromechanics of lung alveoli: structure and function of surfactant and tissue components. Histochem Cell Biol. 150 (6), 661-676 (2018).
  2. Novak, C., Ballinger, M. N., Ghadiali, S. Mechanobiology of pulmonary diseases: a review of engineering tools to understand lung mechanotransduction. J Biomech Eng. 143 (11), 110801(2021).
  3. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  4. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 350 (26), 2645-2653 (2004).
  5. Bidan, C. M., Veldsink, A. C., Meurs, H., Gosens, R. Airway and extracellular matrix mechanics in COPD. Front Physiol. 6, 346(2015).
  6. Burgess, J. K., Gosens, R. Mechanotransduction and the extracellular matrix: key drivers of lung pathologies and drug responsiveness. Biochem Pharmacol. 228, 116255(2024).
  7. Harris, C., et al. An in vitro investigation of the inflammatory response to the strain amplitudes which occur during high frequency oscillation ventilation and conventional mechanical ventilation. J Biomech. 88, 186-189 (2019).
  8. Xu, Y., et al. Strain analysis in patients at high risk for COPD using four-dimensional dynamic-ventilation CT. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 17, 1121-1130 (2022).
  9. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  10. Al Yazeedi, S., Guo, T. J. F., Sohd, J., Abokor, F. A., Osei, E. T. Dynamic mechanical stimulation of alveolar epithelial-fibroblast models using the Flexcell tension system to study lung disease mechanisms. Front Med. 12, 1552803(2025).
  11. Guo, T. J. F., Faiz, A., Osei, E. T., Pouwels, S. D. Editorial: Next generation in vitro models to study chronic pulmonary diseases, volume II. Front Med. 12, 1683514(2025).
  12. Lim, M. J., Kim, S. J., Jo, A., Kim, S. W. Enhanced application potential of alveolar organoids through epithelial and niche cell interactions. Sci Rep. 15 (1), 17538(2025).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Purev, E., Bahmed, K., Kosmider, B. Alveolar organoids in lung disease modeling. Biomolecules. 14 (1), 115(2024).
  15. Manuyakorn, W., et al. Mechanical strain causes adaptive change in bronchial fibroblasts enhancing profibrotic and inflammatory responses. PLoS One. 11 (4), e0153926(2016).
  16. Kılıç, A., et al. Mechanical forces induce an asthma gene signature in healthy airway epithelial cells. Sci Rep. 10 (1), 966(2020).
  17. Tam, A., et al. Hedgehog signaling as a therapeutic target for airway remodeling and inflammation in allergic asthma. Cells. 11 (19), 3016(2022).
  18. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol. 134 (3), 509-520 (2014).
  19. Ivanov, A. I., Parkos, C. A., Nusrat, A. Cytoskeletal regulation of epithelial barrier function during inflammation. Am J Pathol. 177 (2), 512-524 (2010).
  20. Barnett, K. C., et al. An epithelial-immune circuit amplifies inflammasome and IL-6 responses to SARS-CoV-2. Cell Host Microbe. 31 (2), 243-259.e6 (2023).
  21. Li, Y., et al. HB-EGF-induced IL-8 secretion from airway epithelium leads to lung fibroblast proliferation and migration. BMC Pulm Med. 21 (1), 347(2021).
  22. Guo, T. J. F., Singhera, G. K., Leung, J. M., Dorscheid, D. R. Airway epithelial-derived immune mediators in COVID-19. Viruses. 15 (8), 1655(2023).
  23. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  24. Li, K., He, Y., Jin, X., Jin, K., Qian, J. Reproducible extracellular matrices for tumor organoid culture: challenges and opportunities. J Transl Med. 23 (1), 497(2025).
  25. Vande Geest, J. P., Di Martino, E. S., Vorp, D. A. An analysis of the complete strain field within Flexercell membranes. J Biomech. 37 (12), 1923-1928 (2004).
  26. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Front Physiol. 11, 566(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor
Posted by JoVE Editors on 8/19/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69447

Теги

3DA549MRC 5
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи