Этот протокол описывает метод убиквитинации Streptococcus pneumoniae с использованием лизата млекопитающих клеток или чистого комплекса ферментов убиквитина, после чего следует обработка очищенным белковым комплексом VCP/p97-UFD1-NPLOC4 для оценки его бактериолитической активности, что позволяет изучать иммунно-зависимые от убиквитина.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In vitro Восстановление бактериальной убиквитинации и элиминация через VCP/p97
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Убиквитинация — это универсальная посттрансляционная модификация, играющая ключевую роль в цитозольном иммунитете. При проникновении в клетки хозяина патогенные бактерии изначально заключаются в эндозому, из которой они вырываются и попадают в цитозоль, чтобы избежать лизосомного разрушения. Оказавшись в цитозоле, бактерии быстро маркируются убиквитиновым цепочками с помощью лигазы хозяина E3, отмечая их для очищения через несколько эффекторных путей, включая аутофагию и протеасому. Для определения вклада отдельных путей в элиминацию бактерий in vitro реконституирование предлагает контролируемый и однозначный подход. Здесь, используя Streptococcus pneumoniae (SPN) в качестве модельного бактериального патогена, мы представляем подробный протокол его убиквитинации с использованием лизатов млекопитающих клеток или чистого комплекса ферментов убиквитина, а затем обработку очищенным комплексом VCP/p97-UFD1-NPLOC4 для оценки бактериолитической активности независимо от других клеточных факторов. В целом, эта процедура обладает потенциалом прояснить функцию иммунно-связанных убиквитиновых лигазов и эффекторов в контексте без клеток, где вскрытие таких механизмов бывает сложно в целых клетках.
Введение
Убиквитин (Ub) — это небольшой белок массой 8,6 кДа, который модифицирует целевые субстраты, ковалентно прикрепляясь к ним на своём C-концовом глицине, создавая изопептидную связь с ε-аминогруппой остатков лизина в процессе, называемомубиквитинацией 1. Это явление управляется серией скоординированных этапов, включающих фермент, активирующий убиквитин E1, фермент, конъюгающий убиквитин E2, и E3 убиквитинлигазу 1,2,3. Ub может быть прикреплён как мономер, так и цепи разной длины через свои семь лизиновых остатков (линейн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культивирование клеток и подготовка лизата
- Разморозить клетки A549 и вырастить их в термофляге T25 с полным DMEM с 10% плодовой сывороткой (FBS). Инкубировать при 37 °C в увлажнённой среде с 5%CO2. Пропустите клетки через три прохода для поддержания, затем перенесите 2 × 106 клеток в колбу T75. Продолжайте культуру, пока плотность клеток не достигнет 8-10 × 106 клеток.
- Соскребите клетки из колбы T75 при 4 °C с помощью реакционного буфера, содержащего 200 мМ HEPES, 100 мМ MgCl2, 1 M KCl и 5% глицерина при pH 7,4. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наш протокол подробно описывает использование клеток A549 у млекопитающих для получения клеточного лизата, богатого необходимыми компонентами для запуска процесса убиквитинации (рисунок 1A). Этот лизат, будь то в концентрированном состоянии или заменённый очищенными компонентами, такими как UBE1 (фермент, активирующий убиквитин E1), UbE2C (фермент, конъюгающий убиквитин E2) и комплекс Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (убиквитин лигаза E3), смешивается с очищенным убиквит.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя система реконструкции in vitro , описанная здесь, предлагает надёжную основу для изучения молекулярных тонкостей убиквитинации и элиминации бактерий, необходимо учитывать ряд значительных ограничений. Зависимость от супрафизиологических концентраций очищенных белков, включающих убиквитинационный механизм (лигазы E1, E2, E3, убиквитин) и эффекторный комплекс хозяина (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), даёт ключевые механистические представления о убиквитинации и очистке патогена, но мо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
Благодарности
Мы выражаем благодарность Центру биобезопасности уровня 2 и Конфокальному микроскопическому центру IIT Бомбея. Сурав Гош. (17/06/2018(i) EU-V), Сумит Ракшит (221610197857) и Удит Кумар Дас (24D0061) получили стипендии от CSIR, UGC, правительства Индии и IIT Бомбея соответственно. Анирбан Банерджи получил исследовательское финансирование от Совета по научным и инженерным исследованиям правительства Индии (номер гранта SPR/2019/000808) и Фонда наук о жизни Ignite (номер гранта IGNITE/FG-OC/2021/004). Финансирующие организации не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, решении о публикации или подготовке рукописи.<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 50-кратный коктейль с ингибиторами протеазы | Promega | G6521 | |
| 6x-His-Ubiquitin | UBPBio | E1100 | |
| A549 клеточная линия | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Alexa Fluor 488 | Инвитроген | A21202 | |
| Alexa Fluor 555 | Инвитроген | A-31572 | |
| Антиубиквитин антитела | Энцо | BML-PW8810-0100 | |
| Анти-убиквитин-специфический K48, клон Apu2 антитела | Сигма Олдрич | ZRB2150 | |
| ATP | Сигма Олдрич | A6419 | |
| BHI | HiMedia | M210 | |
| DMEM (высокий уровень глюкозы) | HiMedia | AL251 | |
| FBS | Gibco (американское происхождение) | 38220090 | |
| Глицерин | PureSynth | PSR37325 | |
| HEPES | Сигма Олдрич | H4034-100G | |
| KCl | Сигма Олдрич | P3911 | |
| MgCl2 | Сигма Олдрич | TC006 | |
| Параформальдегид | Сигма Олдрич | E6148 | |
| Плазмида pET28a-p97 | Наша лаборатория | Плазмида доступна по запросу | |
| Плазмида pET41b-NPLOC4 | Наша лаборатория | Плазмида доступна по запросу | |
| Плазмида pET41b-UFD1 | Addgene | Плазмида #117107 | |
| Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 | Сигма Олдрич | 23-030 | |
| Штамм Streptococcus pneumoniae R6 | ATCC | ATCC BAA-255 | Патоген группы риска -2, который будет обработан в учреждении BSL-2 |
| Порошок бульона Тодда Хьюитта | HiMedia | M313 | |
| UBE1 | UBPBio | B1100 | |
| UbE2C | UBPBio | C1300 | |
| Мочевина | HiMedia | MB032 | |
| Порошок экстракта дрожжей | HiMedia | RM027 |
Ссылки
- Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).
- Ciechanover, A. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
- Damgaard, R. B.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
