Методическая статья

In vitro Восстановление бактериальной убиквитинации и элиминация через VCP/p97

DOI:

10.3791/69454

⸱

2 января 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод убиквитинации Streptococcus pneumoniae с использованием лизата млекопитающих клеток или чистого комплекса ферментов убиквитина, после чего следует обработка очищенным белковым комплексом VCP/p97-UFD1-NPLOC4 для оценки его бактериолитической активности, что позволяет изучать иммунно-зависимые от убиквитина.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Убиквитинация — это универсальная посттрансляционная модификация, играющая ключевую роль в цитозольном иммунитете. При проникновении в клетки хозяина патогенные бактерии изначально заключаются в эндозому, из которой они вырываются и попадают в цитозоль, чтобы избежать лизосомного разрушения. Оказавшись в цитозоле, бактерии быстро маркируются убиквитиновым цепочками с помощью лигазы хозяина E3, отмечая их для очищения через несколько эффекторных путей, включая аутофагию и протеасому. Для определения вклада отдельных путей в элиминацию бактерий in vitro реконституирование предлагает контролируемый и однозначный подход. Здесь, используя Streptococcus pneumoniae (SPN) в качестве модельного бактериального патогена, мы представляем подробный протокол его убиквитинации с использованием лизатов млекопитающих клеток или чистого комплекса ферментов убиквитина, а затем обработку очищенным комплексом VCP/p97-UFD1-NPLOC4 для оценки бактериолитической активности независимо от других клеточных факторов. В целом, эта процедура обладает потенциалом прояснить функцию иммунно-связанных убиквитиновых лигазов и эффекторов в контексте без клеток, где вскрытие таких механизмов бывает сложно в целых клетках.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Убиквитин (Ub) — это небольшой белок массой 8,6 кДа, который модифицирует целевые субстраты, ковалентно прикрепляясь к ним на своём C-концовом глицине, создавая изопептидную связь с ε-аминогруппой остатков лизина в процессе, называемомубиквитинацией 1. Это явление управляется серией скоординированных этапов, включающих фермент, активирующий убиквитин E1, фермент, конъюгающий убиквитин E2, и E3 убиквитинлигазу 1,2,3. Ub может быть прикреплён как мономер, так и цепи разной длины через свои семь лизиновых остатков (линейные/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63)4. Эти уникальные цепочки Ub служат молекулярными маркерами различных клеточных функций, таких как деградация протеасом, клеточная транспортировка, восстановление ДНК и селективнаяаутофагия 3.

Хотя каноническая роль убиквитинации давно ассоциируется с поддержанием клеточного гомеостаза, например, с разложением неправильно свернутых белков с помощью протеасом, или направленностью специфических грузов к селективнойаутофагии 5,6, теперь очевидно, что убиквитин также служит важным механизмом восприятия цитозольной иммунной системы против бактериальных инфекций. Внутриклеточные бактерии часто проникают в клетки хозяина, чтобы избежать обнаружения внеклеточным иммунным ответом и размножаться в защищённойсреде 7,8. Многие патогены используют секреторные системы и токсины, чтобы необратимо повредить вакуоли, которые их несут, что позволяет проникнуть в цитозоль для получения питательныхвеществ 9,10. Оказавшись в цитозоле, эти бактерии украшены цепями полиубиквитина специфическими лигазами E3, которые действуют как молекулярная «метка смерти», направляющая их к селективной элиминации. Например, E3-лигаза SMURF1 воздействует на Mycobacterium tuberculosis, инициируя K48-связанную полиубиквитинацию непосредственно на своей поверхности, что приводит к её деградации черезпротеазому 11. Паркин накапливается в вакуолях, содержащих бактерии, и образует цепочки убиквитина, связанные с K63,а ARIH1 и LRSAM1 модифицируют поверхности бактерий цепями K48 и K6 соответственно, тем самым ингибируя ростбактерий 13,14. Хотя большинство лигаз E3 в основном нацелены на субстраты белкового хозяина, некоторые лигазы обладают заметной специфичностью к микробным компонентам. RNF213 идентифицирует и убиквитинирует липополисахариды (LPS), обнаруженные на Salmonella enterica serovarTyphimurium 15, а комплексSCF FBXO2 распознаёт бактериальные гликаны, присутствующие в Streptococcus группы A, в качестве субстрата для убиквитинации16, что способствует развитию ксенофагии. КомплексSCF FBXW7, напротив, распознаёт дегроновые мотивы в поверхностных белках Streptococcus pneumoniae (SPN). К ним относятся β-галактозидаза А (BgaA) и пневмококковый поверхностный белок A (PspA), которые, после маркировки цепями с K48-связанными полиубиквитином, были подтверждены использованием K48-связанного Ub-специфического антитела, предположительно привлекая протеасомную систему, что позволяет эффективно вывести бактерии17.

Хотя процесс маркировки этих цитозольных захватчиков убиквитином хорошо изучен, дальнейший механизм, с помощью которого протеасомная система удаляет такие крупные микробные образования, остаётся сомнительным и неизвестным. Недавние исследования показали, что хозяин AAA+ АТФаза, VCP/p97 (белок, содержащий валозин), играет ключевую роль в этом процессе. В сотрудничестве с кофакторами, такими как UFD1 и NPLOC4, VCP может выявлять бактерии, отмеченные полиубиквитином, и физически извлекает убиквитинированные белки из мембраны бактерий, тем самым разрывая их и способствуя их выводу из цитозольной среды без зависимости от протеасомногомеханизма 18.

Цитозоль хозяина содержит сложную сеть иммунных путей, которые работают параллельно и в безопасном режиме, гарантируя удаление патогенов. Эта избыточность крайне важна для сильной защиты, но усложняет выявление и изучение роли отдельных иммунныхфакторов 19. В этом отношении системы реконструкции in vitro предоставляют полезную платформу для анализа конкретных путей в контролируемых условиях. Здесь мы представляем систему без клеток, которая повторяет процесс убиквитинации и потери жизнеспособности SPN с помощью лизатов млекопитающих клеток или ферментов E1-E2-E3-Ub вместе с очищенными эффекторными комплексами хозяина. В этом двухэтапном протоколе сначала мы облегчаем конъюгирование полиубиквитиновых цепей на бактериях, затем оцениваем их устранение с помощью VCP/p97 в сочетании с UFD1 и NPLOC4. Реконструируя этот путь in vitro, мы обходим клеточные сложности и специально изучаем способность VCP нейтрализовать патоген. Такая точная настройка позволяет подробно изучить распознавание субстрата, специфичность цепи, механизм действия эффектора и необходимые компоненты, необходимые для запуска эффективного ответа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивирование клеток и подготовка лизата

  1. Разморозить клетки A549 и вырастить их в термофляге T25 с полным DMEM с 10% плодовой сывороткой (FBS). Инкубировать при 37 °C в увлажнённой среде с 5%CO2. Пропустите клетки через три прохода для поддержания, затем перенесите 2 × 106 клеток в колбу T75. Продолжайте культуру, пока плотность клеток не достигнет 8-10 × 106 клеток.
  2. Соскребите клетки из колбы T75 при 4 °C с помощью реакционного буфера, содержащего 200 мМ HEPES, 100 мМ MgCl2, 1 M KCl и 5% глицерина при pH 7,4. Центрифугуйте очищенные клетки при 120 × г в течение 10 минут для гранулирования, затем снова взвешайте в реакционном буфере для достижения конечного объёма примерно 0,6 мл в центрифугной трубке объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Весь образец должен быть обработан во льду.
  3. Соник ячейки соник с помощью узкого зонд (диаметр наконечника 2 мм) с амплитудой 40 мкм с импульсами включения/выключения 2 с длительностью 2-2,5 минуты, сохраняя смесь в состоянии льда. Центрифугуйте сониковые образцы при 21 000 × г в течение 45 минут, соберите полученный супернатант и добавьте 2-3 раза 50-кратного коктейля с ингибиторами протеаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Либо используйте лизат сразу для реакции убиквитинации в тот же день, либо быстро заморозьте его с помощью жидкого азота и храните при -80 °C; Однако обязательно используйте его максимум в течение 3 дней для эффективной убиквитинации. Концентрация лизатов в диапазоне от 2 до 4 мг/мл подходит для убиквитинации.

2. Бактериальная культура

  1. Выращивать бактерии, Streptococcus pneumoniae (SPN) штамм R6 (серотип II), на ночь при 37 °C с 5%CO2 в среде THY, состоящем из порошка бульона Todd Hewitt (3,7 г/100 мл) и порошка дрожжевого экстракта (1,5 г/100 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте инокуляции бактерий, если среда изменилась на тёмно-коричневый цвет. Streptococcus pneumoniae классифицируется как патоген уровня биобезопасности 2 (BSL-2); Соблюдайте меры предосторожности и соблюдайте правильные протоколы содержания BSL-2, включая использование сертифицированного шкафа для биобезопасности.
  2. На следующий день инокуляция из ночной культуры в свежие THY-среды (1:10) при 37 °C с 5%CO2 и увеличивайте SPN до достижения оптической плотности при 600 нм (OD 600 нм) до 0,4. Приготовьте запас глицерила SPN (900 мкл культуры SPN и 600 мкл глицерина (50%) и храните при -80 °C.
  3. В день эксперимента по убиквитинации разморозьте новый запас SPN при температуре -80 °C и полностью инокулируйте его в 5 мл среды THY, после чего дайте расти доOD 600 нм до 0,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальная культура была выращена доOD 600 нм 0,4, что соответствует примерно 10клеткам по 8 SPN на мл. Эта корреляция была установлена путём перечисления колониообразующих единиц (CFU), определяемых последовательно разбавлением культуры в 1x PBS для снижения концентрации бактериальных клеток с целью получения счётных колоний, а также выделения пятен на агарных пластинах BHI — более обогащённой среде, чем THY.

3. Экстракорпоральный убиквитинационный анализ из млекопитающих лизата

  1. Возьмите примерно 107 SPN-клеток и тщательно промыйте не менее трёх раз с реакционным буфером (200 мМ HEPES, 100 мМ MgCl2, 1 M KCl и 5% глицерина при pH 7,4), затем суспендировав бактерии в следующем буфере, затем центрифугировайте при 21 000 × г в течение 5 минут, а затем опустите их с помощью центрифугации при 21 000 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  2. Суспензировать SPN-гранулу с лизатом клеток млекопитающих A549 вместе с очищенным убиквитином (350 мкм) и 1 мМ АТФ и инкубировать 1-2 часа при 27 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте замораживания и размораивания лизата клеток млекопитающих. Лучше, если лизат готовят в тот же день, что и убиквитинационный анализ.
  3. После инкубации промывайте бактерии реакционным буфером с 1 млн мочевины один раз, затем дважды промывайте только реакционным буфером, а затем фиксируйте с помощью 1% параформальдегида (PFA). После фиксации инкубируют клетки с PBS, содержащим глицин (1 мг/мл), в течение 15 минут, после чего проводите два 1x PBS-промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мочевина объемом 1 М используется для лёгкого нарушения нековалентных взаимодействий, гарантируя, что остаются только ковалентно убиквитинные бактерии. После этого важно тщательно промыть реакционным буфером для удаления остатков мочевины, так как её присутствие может мешать тесту убийства in vitro .
    В качестве отрицательного контроля подготовьте всю реакционную смесь и инкубировать её с бактериями на льду, чтобы подавить ферментативную активность. Сразу после инкубации промывайте образец и затем фиксируйте его с помощью 1% PFA, чтобы сохранить состояние реакции.

4. Убиквитинационный анализ in vitro из ферментного комплекса E1-E2-E3

  1. Сначала приготовьте реакционную смесь, состоящую из комплекса убиквитин (350 мкм), UBE1 (400-800 нМ), UbE2C (3-5 мкм), Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (500 нМ) и 2 мМ АТФ в реакционном буфере (200 мМ HEPES, 100 мМ МгКл2, 1 М KCl и 5% глицерина при pH 7,4), чтобы получить общий объём реакции 100-150 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните все ферменты при -80 °C. Чтобы избежать потери активности из-за множества циклов заморозки-оттаивания, создайте небольшие аликвоты и используйте новые для каждой реакции убиквитинаци.
  2. Ресуспензировать бактерии (107 CFU) в этой реакционной смеси с убиквитин-ферментом и инкубировать в течение 2 часов при 27 °C. Затем промывайте бактерии реакционным буфером с 1 млн мочевины не менее 3 раза, после чего фиксируйте с помощью 1% параформальдегида (PFA). После фиксации инкубируют клетки с PBS, содержащим глицин (1 мг/мл), в течение 15 минут, после чего проводите два 1x PBS-промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При чрезмерной потере клеток можно уменьшить количество промывки.

5. Визуализация убиквитинированных бактерий

  1. После фиксации образца с 1% PFA инкубировать его в 3% BSA в течение 1 часа при 27 °C, затем выполнить две промывки с 1x PBS.
  2. Ресуспендировать убиквитинированные бактерии с помощью первичного антитела в концентрациях, выше тех, что обычно применяются в иммунофлуоресцентных анализах. Используйте бактериально-специфические антитела вместе с антиубиквитиновым антителом (1:100), разбавленные в PBS с 1% BSA, для окрашивания при 27 °C в течение 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального окрашивания антител используйте центрифугу с низким содержанием белка, чтобы минимизировать потерю антител, или более высокую концентрацию антител для достижения наилучших результатов.
  3. Затем промыйте бактерии дважды с помощью 1x PBS, а затем повторно суспензуйте их соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 488 и 555 соответственно, в течение 1 часа при 27 °C.
  4. Нанесите около 10-20 мкл маркированного образца бактерий с помощью капельного литья и смешайте 5-10 мкл монтажной среды с DAPI или без него, затем накройте поверх него покровитель и используйте папиросную бумагу для впитывания лишней жидкости. Наконец, наблюдайте образец под конфокальным микроскопом в тот же день.

6. Экспрессия и очистка белка

  1. Для экспрессии дикого типа VCP/p97 преобразуйте плазмиду pET28a, содержащую VCP, в штамм E. coli BL21-DE3 с помощью стандартного протокола преобразования E. coli 20. Инкубационные колонии формируются после превращения ночью в бульоне Луриа (LB) при температуре 37 °C. На следующий день инокулируйте культуру 1:50 в хорошо аэрированную колбу с LB и дайте ей расти до уровняOD 600 нм до 0,7-0,8. Добавьте 200 мкм IPTG в культуру и инкубируете 5 часов при 37 °C с встряхиванием при 180 об/мин; Подтвердите экспрессию белка с помощью SDS-PAGE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего этапа роста и экспрессии бактерий в качестве селективного давления использовался канамицин (50 мкг/мл).
  2. Для экспрессии дикого типа UFD1 преобразовать плазмиду pET41b, содержащую UFD1, в штамм E. coli BL21-Rosetta с помощью стандартного протокола преобразования E. coli 20. Инкубационные колонии формируются после превращения ночью в бульоне Луриа (LB) при температуре 37 °C. На следующий день инокулируйте культуру 1:50 в хорошо аэрированную колбу с LB и дайте ей расти до уровняOD 600 нм до 0,7-0,8. Добавьте 1 мМ IPTG в культуру и инкубируете 5 часов при 37 °C с встряхиванием при 180 об/мин; Подтвердите экспрессию белка с помощью SDS-PAGE.
  3. Для экспрессии дикого типа NPLOC4 введём плазмиду pET41b, содержащую NPLOC4, в штамм E. coli BL21-Rosetta с использованием стандартного метода преобразования E. coli 20. Инкубировать колонии, возникающие в результате трансформации в бульоне Луриа (LB) за ночь при 37 °C. На следующий день передайте разбавление культуры в соотношении 1:50 в хорошо аэрированную колбу, заполненную LB, и дайте ей расти до тех пор, пока оптическая плотность приOD 600 нм не достигнет 0,7-0,8. После этого добавьте 1 мМ IPTG в культуру и продолжайте инкубацию в течение 16 часов при 18 °C, встряхивая при 180 об/мин; Проверьте экспрессию белка, проведя анализ SDS-PAGE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всего этапа роста и экспрессии бактерий в штамме E. coli BL21-Rosetta в качестве селективного давления использовались канамицин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (20 мкг/мл). Последовательности pET28a-p97 и pET41b-NPLOC4 приведены в дополнительном файле 1.
  4. После экспрессии белка центрифугуйте бактериальные клетки при 21 000 × г в течение 10 минут и ресуспензуйте гранулу в буфере лизис, содержащем 50 мМ Tris-Cl, 300 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ PMSF, 5% глицерина, pH 8.
  5. Соник ячеек проводится в течение 1 часа с помощью узкого зонд (диаметр наконечника 6 мм) с амплитудой 50 мкм и с импульсом 20 секунд при включении/выключении при 4 °C. Сбрасывайте обломки с помощью 15 000 × г в течение часа и собирайте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная звуковая обработка проводилась в течение 1 часа (30 минут включённых и 30 минут выключения в виде импульсов 20 с), и процесс продолжался до тех пор, пока мутная ячейка не стала полупрозрачной и прозрачной. Требуется высокая скоростная центрифугировка, чтобы клеточный мусор оставался гранулированным и не смещался во время загрузки лизата на колонку для очистки белка.
  6. Пропустите супернатант через фильтр диаметром 0,4 мкм и загрузите его на колонку, упакованную шариками Ni-NTA, для аффинитной очистки, предварительно уравновешенных буфером для очистки (50 мМ Tris-Cl, 300 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 5% глицерола, pH 8).
  7. Промывайте богатый белком столб с помощью буфера для промывания, содержащего 50 мМ Tris-Cl, 300 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 5% глицерола, pH 8 и 30-60 мМ имидазола примерно 400 мл, а затем элюируйте белок элюционным буфером, включающим 50 мМ Tris-Cl, 300 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 5% глицерола, pH 8 и 250 мМ имидазола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация имидазола и объём раствора могут различаться в зависимости от конкретного анализируемого белка. Для оценки чистоты следует выполнить SDS-PAGE. Необходимо тщательно промыть колонку до тех пор, пока жидкость не проявит отрицательную реакцию с реагентом Брэдфорда. Элюируемая фракция демонстрирует заметную, концентрированную полосу целевого белка, которая должна преимущественно представлять образец, с лишь незначительными следами, если вообще есть, других белков.
  8. Соберите различные фрации, проанализируйте их с помощью SDS PAGE для определения, какие фракции содержат чистые белки, а затем проведите буферный обмен в буфер реакции (200 мМ HEPES, 100 мМ MgCl2, 1 M KCl и 5% глицерина при pH 7,4) с использованием колонки PD-10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте концентрацию белка с помощью реагента Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250). Все белки следует быстро заморозить в жидком азоте и хранить при -80 °C.

7. Экстракорпоральный бактериальный анализ

  1. Соедините 6 мкм VCP/p97 с по 1 мкм NPLOC4 и UFD1, затем заполните объём реакционным буфером примерно до 90 мкл. Дайте этой реакционной смеси инкубировать на льду в течение 2 часа.
  2. Добавьте 1-2 мМ АТФ в реакционную смесь, включающую p97-UFD1-NPLOC4, а затем соедините её с убиквитинувшей SPN (107 клеток) в течение 2 часов при 37 °C.
  3. Для оценки жизнеспособности бактерий сразу после обработки возьмите 1 мкл аликвота реакционной смеси, проведите серийное разбавление (1:1, 1:10, 1:100 и 1:1000) и нанесите 10–2 мкл каждого разбавления на агарные пластины инфузии мозга в сердце (BHI). Повторите эту процедуру с использованием 1 мкл аликвота из реакции через 2 часа инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите все разбавления для лучшего результата.
  4. Оцените единицы формирования колоний (CFU) между временными точками 0 и 2 часа. Вычислите жизнеспособность бактерий (%) путём деления количества CFU через 2 часа на количество CFU при 0 ч, а затем умножьте результат на 100.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более надёжных результатов используйте термоденатурированный VCP/p97, VCP/p97 без комплекса кофакторов UFD1-NPLOC4 или вариант VCP/p97 с дефицитом АТФазы в качестве отрицательного контроля.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш протокол подробно описывает использование клеток A549 у млекопитающих для получения клеточного лизата, богатого необходимыми компонентами для запуска процесса убиквитинации (рисунок 1A). Этот лизат, будь то в концентрированном состоянии или заменённый очищенными компонентами, такими как UBE1 (фермент, активирующий убиквитин E1), UbE2C (фермент, конъюгающий убиквитин E2) и комплекс Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (убиквитин лигаза E3), смешивается с очищенным убиквит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя система реконструкции in vitro , описанная здесь, предлагает надёжную основу для изучения молекулярных тонкостей убиквитинации и элиминации бактерий, необходимо учитывать ряд значительных ограничений. Зависимость от супрафизиологических концентраций очищенных белков, включающих убиквитинационный механизм (лигазы E1, E2, E3, убиквитин) и эффекторный комплекс хозяина (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), даёт ключевые механистические представления о убиквитинации и очистке патогена, но мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы выражаем благодарность Центру биобезопасности уровня 2 и Конфокальному микроскопическому центру IIT Бомбея. Сурав Гош. (17/06/2018(i) EU-V), Сумит Ракшит (221610197857) и Удит Кумар Дас (24D0061) получили стипендии от CSIR, UGC, правительства Индии и IIT Бомбея соответственно. Анирбан Банерджи получил исследовательское финансирование от Совета по научным и инженерным исследованиям правительства Индии (номер гранта SPR/2019/000808) и Фонда наук о жизни Ignite (номер гранта IGNITE/FG-OC/2021/004). Финансирующие организации не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, решении о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
50-кратный коктейль с ингибиторами протеазыPromega G6521
6x-His-UbiquitinUBPBioE1100
A549 клеточная линия  ATCCATCC CCL-185
Alexa Fluor 488ИнвитрогенA21202 
Alexa Fluor 555ИнвитрогенA-31572   
Антиубиквитин антителаЭнцоBML-PW8810-0100
Анти-убиквитин-специфический K48, клон Apu2 антителаСигма ОлдричZRB2150
ATPСигма ОлдричA6419
BHIHiMedia M210
DMEM (высокий уровень глюкозы)HiMedia AL251
FBSGibco (американское происхождение)38220090
ГлицеринPureSynth PSR37325
HEPESСигма ОлдричH4034-100G
KClСигма ОлдричP3911
MgCl2Сигма ОлдричTC006
Параформальдегид Сигма ОлдричE6148
Плазмида pET28a-p97Наша лабораторияПлазмида доступна по запросу
Плазмида pET41b-NPLOC4Наша лабораторияПлазмида доступна по запросу
Плазмида pET41b-UFD1AddgeneПлазмида #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 Сигма Олдрич23-030
Штамм Streptococcus pneumoniae R6ATCCATCC BAA-255Патоген группы риска -2, который будет обработан в учреждении BSL-2
Порошок бульона Тодда ХьюиттаHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
МочевинаHiMedia MB032
Порошок экстракта дрожжей  HiMedia RM027

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).
  2. Ciechanover, A. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  3. Damgaard, R. B. The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities. Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).
  4. Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly. Front Physiol. 10, 835(2019).
  5. Kikkert, M., et al. Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).
  6. Korac, J., et al. Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates. J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).
  7. Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).
  8. Ercoli, G., et al. Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia. Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).
  9. Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2. EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).
  10. Surve, M. V., et al. Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking. PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).
  11. Franco, L. H., et al. The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense. Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  12. Manzanillo, P. S., et al. The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens. Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).
  13. Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).
  14. Huett, A., et al. The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium. Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).
  15. Otten, E. G., et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).
  16. Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan. EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).
  17. Apte, S., et al. An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins. Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).
  18. Ghosh, S., et al. Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence. Nat Microbiol. , (2025).
  19. Mitchell, G., Isberg, R. R. Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation. Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).
  20. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  21. Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).
  22. Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1. Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Streptococcus pneumoniaeUFD1 NPLOC4

Похожие статьи