Методическая статья

Микропроизводство субстратов с микромасштабными градиентами жесткости для управления миграцией стромальных клеток костного мозга

DOI:

10.3791/69473

⸱

14 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описывается изготовление двухслойной подложки из полидиметилсилоксана (PDMS) с помощью мягкой литографии. Метод использует геометрически модулированные микроструктуры в жестком нижнем слое в сочетании с мягким плоским верхним слоем для создания микромасштабных эффективных градиентов жесткости, что позволяет проводить исследования клеточной механобиологии без топографической интерференции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание того, как клетки реагируют на механические сигналы, имеет решающее значение для выяснения механизмов, участвующих в развитии тканей и прогрессировании заболевания. Тем не менее, существующие субстраты клеточных культур in vitro часто не могут воспроизвести физиологические градиенты жесткости на клеточном уровне, а также устраняют искажающие топографические сигналы. В этом исследовании мы представляем модель жесткости без развязки с использованием двухслойной подложки из полидиметилсилоксана (PDMS). Эта подложка состоит из мягкой пленки с плоским верхом, подвешенной над жестким подслоем с микроструктурами с гребневыми и бороздчатыми микроструктурами. Верхний слой эффективно передает изменения жесткости в базовой структуре, сохраняя при этом однородный рельеф и химический состав на поверхности контакта с клеткой. Модуляция жесткости достигается за счет варьирования ширины чередующихся гребней и канавок, которые расположены на равном расстоянии. Сканирующая электронная микроскопия подтвердила морфологию плоской поверхности и постоянную контактную топографию. Атомно-силовая микроскопия показала, что вариации жесткости зависят от микроструктуры: для моделей размером 20 мкм модули упругости составляли примерно 950 кПа для гребней и 850 кПа для бороздок; для моделей 50 мкм эти значения составляли около 1070 кПа и 950 кПа соответственно. Первичные клетки костного мозга мышей хорошо прилегали и распределялись по субстрату, демонстрируя предпочтение ядерной локализации в сторону более жестких участков гребня в масштабе 50 мкм (61,49%, p < 0,05), тем самым подтверждая эффективное клеточное восприятие механического градиента. Таким образом, этот протокол предлагает воспроизводимый метод создания субстрата для клеточной культуры с микромасштабными градиентами жесткости, сводящими к минимуму химическую или топографическую интерференцию, что позволяет проводить исследования механотрансдукции клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки обладают способностью ощущать и реагировать на механические раздражители в своем внешнем микроокружении 1,2,3, которые имеют решающее значение для регуляции различных клеточных процессов, включая адгезию, миграцию, пролиферацию и дифференцировку4. In vivo механические свойства микроокружения тканей демонстрируют значительную пространственную гетерогенность, при этом изменения жесткости матрикса наблюдаются как в физиологических контекстах, таких как соединения костей и мышц, так и в патологических состояниях, таких как опухоли 5,6,7. Всестороннее исследование этих механических факторов имеет важное значение для понимания регуляторных механизмов, управляющих поведением клеток. Эти механизмы играют ключевую роль в таких процессах, как развитие тканей, прогрессирование заболевания, а также процесс регенерации и восстановления 8,9.

Для моделирования этого сложного механического микроокружения in vitro широко используются гидрогели или эластомеры для создания подложек с различной жесткостью путем регулировки степени сшивки или соотношения компонентов 3,10,11,12,13. Тем не менее, эти методы часто приводят к дискретным изменениям жесткости, которые не могут воспроизвести непрерывные микромасштабные градиенты жесткости, которые точно имитируют физиологические условия 13,14,15,16,17. В недавних исследованиях изучались такие методы, как оптическое сшивание (например, использование фотошаблона для регулирования ультрафиолетового излучения)18, микрофлюидное многоканальное смешивание19,20 и диффузионные средства21 для построения градиентов жесткости. К сожалению, эти подходы могут быть технически сложными и вводить дополнительные переменные, такие как размер ячеи22, набухание 23,24 и топография25. Введение факторов возмущения затрудняет интерпретацию клеточных реакций на жесткость. Двухслойная система PDMS, использующая массивы микростолбиков или шахматные узоры в качестве опорной структуры, была принята для создания субстратов для клеточных культур с градиентамижесткости 26,27. Эти подходы основаны на дискретных базовых опорах под химически однородной мембраной для достижения изотропной модуляции жесткости, обеспечивая ценные платформы для исследования клеточной адгезии и распространения. Однако нативное клеточное микроокружение in vivo часто обладает высокой анизотропностью по своим механическимсвойствам28,29. Предполагается, что эта направленная механическая сигнализация оказывает глубокое влияние на фундаментальные биологические события. Таким образом, современные стратегии биопроизводства ограничены в своей способности воспроизводить тонкие взаимодействия между клеткой и жесткостью, наблюдаемые in vivo, которые зависят от точной имитации микромасштабных градиентов жесткости и пространственной неоднородности в нагруженных клетками субстратах.

Предыдущие исследования показали, что клетки могут воспринимать эффективную жесткость жестких объектов, даже когда они не находятся впрямом клеточном контакте. Основываясь на этом исследовании, мы представляем новый двухслойный субстрат для клеточной культуры на основе полидиметилсилоксана (PDMS), который генерирует контролируемые градиенты жесткости в пространственных масштабах от 5 до 50 мкм, согласуясь с диапазоном размеров, относящимся к субклеточному и одноклеточному механосенсорингу. Подложка состоит из двух отдельных слоев: жесткого нижнего слоя PDMS с настраиваемыми геометрическими микроструктурами и однородного плоского мягкого верхнего слоя PDMS, который служит поверхностью, контактирующей с клеткой. Такая конструкция позволяет осуществлять механическую модуляцию исключительно за счет вариаций геометрии подконструкции, сохраняя при этом постоянный химический состав поверхности и топографию. Следовательно, он эффективно отделяет сигнал жесткости от других физических и химических сигналов, предлагая более биологически значимую систему для модуляции жесткости.

В отличие от традиционных подложек на основе гидрогеля, наш подход позволяет проводить однопеременные механические исследования без помех, связанных с набуханием, размером ячеек или топологией поверхности. Подложка проста в изготовлении с использованием стандартной мягкой литографии и обладает высокой воспроизводимостью31. Он также совместим с микроскопией с высоким разрешением, что делает его особенно хорошо подходящим для визуализации в реальном времени и количественных исследований клеточных реакций на микромасштабные сигналы жесткости. В данной рукописи представлен полный протокол изготовления, подробно описана стратегия управления параметрами и продемонстрирована полезность субстрата в репрезентативных экспериментах с клеточными культурами. В конечном счете, этот подход обеспечивает надежный и доступный инструмент in vitro для изучения реакции клеток на микромасштабный градиент жесткости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичные стромальные клетки костного мозга мышей (mBMSC) выделяли из большеберцовой и бедренной костей мышей (No. WP20230204, одобрено Комитетом по этике Центра экспериментов на животных Уханьского университета).

1. Подготовка мастер-формы

ПРИМЕЧАНИЕ: Наши протоколы специфичны для негативного фоторезиста на основе эпоксидной смолы, используемого во время этого исследования.

  1. Поместите две чистые силиконовые пластины (50,8 ± 0,2 мм, ориентированные <100>, 525 ± 25 мкм) на конфорку на несколько минут для обезвоживания.
  2. Возьмите одну кремниевую пластину из конфорки и охладите ее до комнатной температуры, прежде чем приступать к нанесению отжимного покрытия. Нанесите на межфланцевый центр 3-5 мл фоторезиста.
  3. Чтобы получить высоту элемента 20 мкм, примените следующий протокол отжима: отжим в течение 10 с при 7,1 × g, а затем отжим при 410 × g в течение 30 с. Чтобы получить высоту элемента 30 мкм, примените следующий протокол отжима: отжим в течение 10 с при 7,1 × g, а затем отжим при 170 × g в течение 30 с. Осторожно используйте скальпель, чтобы удалить любую краевую бусину, которая может образоваться во время нанесения отжимного покрытия.
  4. Мягкую выпечку выпекайте следующим образом: установите конфорку на 95 °C, дайте вафле постоять на горячей плите в течение 13 минут. Снимите пластину с конфорки и дайте ей остыть до комнатной температуры естественным путем, не допуская резкого перепада температуры.
  5. Выровняйте фотошаблон на пластине с фоторезистным покрытием и подвергните воздействию ультрафиолетового света с общей дозой 120 мДж/см2.
  6. Выпекайте после экспонирования следующим образом: с помощью двух конфорок (65 °C и 95 °C) дайте пластине с фоторезистивным покрытием постоять на конфорке с температурой 65 °C в течение 1 минуты, прежде чем перенести ее на конфорку с температурой 95 °C и оставить там на 5 минут. Переместите пластину на стопку салфеток из микрофибры и дайте ей остыть до комнатной температуры.
  7. Проявите пластину, перенеся ее в чашку Петри, заполненную PGMEA, и погрузите всю пластину в проявитель. Ускорьте разработку за счет ручного перемешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PGMEA легковоспламеняется и раздражает глаза и дыхательные пути. Утилизируйте их как «легковоспламеняющиеся органические отходы» в специальных контейнерах.
  8. После проявления достаньте пластину из проявителя и промойте ее в изопропаноле. Если молочно-белый поток образуется в изопропаноле близко к поверхности образца (проявление не завершено), снова погрузите образец в проявитель, чтобы завершить процесс проявления. Промойте проявленный образец в изопропаноле до тех пор, пока вблизи поверхности образца не образуется молочно-белый поток. После полного проявления сильно запекайте фоторезист, поместив пластину на конфорку с температурой 150 °C на 15 минут.
  9. Фторирование пластины для следующих процессов мягкой литографии: воздействие на пластину кислородной плазмы в вакууме в течение 30 с (100 Вт) для активации поверхности, а затем помещение в вакуумный эксикатор. Капните 30 μл трихлора (1H,1H,2H,2H-тридекафтор-н-октила) силана на предметное стекло, помещенное внутрь вакуумного эксикатора. Откачайте эксикатор в течение 2 минут и поддерживайте вакуумное состояние в течение 30 минут. Выпекайте пластину при температуре 90 °C в течение 1 часа, чтобы завершить процесс силанизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Строго контролируйте относительную влажность окружающей среды ниже 60% на протяжении всего процесса. Чрезмерная влажность может вызвать быстрый гидролиз силана, в результате которого образуются белые нелетучие полисилоксановые осадки. Осадки нарушают равномерность распределения паров силана, что приводит к неудачной силанизации. Проводите обработку в вытяжке, так как трихлор(1H,1H,2H,2H-тридекафтор-н-октил) силан бурно реагирует с водой, выделяя токсичные пары HCl. Нейтрализовать разбавленной щелочью перед утилизацией как фторированные/хлорированные органические отходы. Процесс силанизации достигает 90% успеха.

2. Изготовление

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс мягкой литографии, используемый для изготовления двухслойной подложки из полидиметилсилоксана (PDMS), можно разделить на два отдельных этапа: 1) подготовка структурированного нижнего и верхнего слоев, 2) склеивание двух слоев PDMS. Общий выход продукции составляет более 80%.

  1. Подготовка PDMS
    1. Для структурированного нижнего слоя готовят прекурсор PDMS путем смешивания преполимера и отвердителя в соотношении 10:1 по весу с последующей дегазацией под вакуумом. Налейте 1,5 мл прекурсора PDMS (10:1) на мастер-форму SU8, покрывая всю поверхность, с последующей дегазацией под вакуумом и отдыхом в течение 30 минут. Осторожно поставьте в духовку и выдерживайте при температуре 90 °C в течение 1 часа. Демолдируйте структурированный подслой PDMS из мастер-формы.
    2. Для верхнего слоя приготовьте прекурсор PDMS путем смешивания преполимера и отвердителя в соотношении 30:1 по весу и дегазации под вакуумом. Налейте прекурсор PDMS на фторированную кремниевую пластину. Чтобы получить толщину 9 мкм, применяют следующий протокол нанесения отжимного покрытия: отжим при 7,1 × г в течение 10 с, а затем отжим при 2 300 × г в течение 60 с.
    3. После нанесения полимерного покрытия визуально осмотрите пленку PDMS при естественном освещении, чтобы проверить ее однородность, в частности, на наличие видимых дефектов, таких как полосы, пузыри или неравномерное наращивание краев. Если пленка выглядит равномерно прозрачной с постоянной отражательной способностью по всей поверхности пластины, переходите к следующему этапу; Если нет, повторите процесс нанесения слоя с новой пластиной. Поместите пластину с покрытием на ровную поверхность, чтобы обеспечить однородную толщину пленки PDMS. Осторожно поставьте в духовку и выдерживайте при температуре 90 °C в течение 3 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получены пленки толщиной 9,11 ± 0,34 мкм.
  2. Склеивание
    1. Поместите структурированный нижний слой PDMS (10:1) узорчатой стороной вниз на пленку верхнего слоя PDMS, обеспечивая хороший контакт между двумя слоями без образования пузырей на стыке.
    2. Переместите сборку в духовку и выдерживайте при температуре 90 °C в течение 3 часов.
    3. Дайте сборке остыть до комнатной температуры на стопке салфеток из микрофибры. Отделите окончательную двухслойную структуру от и храните в чашке Петри для дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время пилинга между верхним и нижним слоями образуются пузырьки, это, как правило, указывает на неполное сцепление между двумя слоями. Обеспечьте тщательную дегазацию прекурсора PDMS перед нанесением полимерного покрытия и убедитесь, что поверхность пленки не содержит пыли или загрязняющих веществ, прежде чем наносить подслой PDMS для полного контакта. Убедитесь, что кремниевая пластина находится в горизонтальном положении во время нанесения покрытия, сборки и отверждения. Разрыв пленки может произойти из-за неравномерной силанизации пластины или неравномерной толщины PDMS. Чтобы решить проблему, строго контролируйте влажность окружающей среды во время силанизации ниже 60% относительной влажности. Процесс силанизации достигает 90% успеха.

3. Характеристика

  1. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
    1. Разрежьте образец острым лезвием, чтобы получить чистые края.
    2. Установите образцы на столики под углом 90° и 0° SEM с помощью проводящей углеродной ленты для определения характеристик поперечного сечения и поверхности соответственно.
    3. Напыляйте на образцы золотом в течение 120 секунд для улучшения качества визуализации SEM и сбора SEM-изображений образцов.
  2. Атомно-силовая микроскопия (АСМ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите зонд ScanAsyst-Air для количественного наномеханического картирования модуля.
    1. Расположите консольный наконечник АСМ в центре поля обзора. Расположите лазерное пятно на самом конце консоли, выровняв систему оптических рычагов.
    2. Перед измерениями количественного наномеханического картирования PeakForce (PeakForce QNM) откалибруйте кантилевер AFM, чтобы определить следующие основные параметры: Постоянная пружины кантилевера: 0,40135 Н/м; Чувствительность к прогибу: 28,993 нм/В (определяется путем построения кривой силы на жестком эталонном образце); Радиус зонда: ~21 нм (откалиброван с помощью относительного метода относительно эталонного образца с известным модулем).
    3. На панели Сканирование списка параметров сканирования настройте следующие начальные параметры сканирования: Установите размер сканирования на 70 мкм для образцов с периодическими полосами с шагом 50 мкм. Установите Размер сканирования на 50 мкм для образцов с периодическими полосами с шагом 20 мкм. Установите Сэмплы/Линия и Линии на 256 (в результате получится изображение размером 256 x 256 пикселей).
    4. Откройте Настройки зацепления в микроскопе и установите заданное значение пиковой силы зацепления прибора по умолчанию в параметрах зацепления.
    5. Нажмите значок «Включить » на панели инструментов рабочего процесса и продолжайте отслеживать сигналы в режиме реального времени во время автоматического захода на посадку.
    6. Убедитесь, что для параметра «Автоконтроль ScanAsyst » установлен режим «Индивидуальный». Установите установочное значение PeakForce на соответствующее значение для достижения желаемого диапазона деформации: для верхнего слоя уставка PeakForce составляет 0,020 нН; для структурированного подслоя PeakForce Setpoint составляет 5 нН.
    7. Запустите сканирование, нажав кнопки сверху вниз или снизу вверх .
    8. Мониторинг и коррекция кривой силы: Если кривые силы искажены или наблюдаются проблемы с синхронизацией (например, неправильные формы, несогласованные базовые линии), щелкните правой кнопкой мыши в окне «Монитор силы » и выберите «Автонастройка », чтобы автоматически скорректировать выравнивание кривой силы и чувствительность.
    9. В настройках канала расчета модуля выберите модель DMT , чтобы она соответствовала части втягивания кривой силы для расчета модуля упругости.
    10. Нажмите кнопку захвата , чтобы получить и сохранить топографию с высоким разрешением и карту наномеханических свойств.
    11. Выполнение анализа после сбора данных с помощью программного обеспечения для обработки и анализа изображений АСМ. Откройте сохраненные файлы данных АСМ и извлеките значения модуля, выбрав области на поверхности образца; Рассчитывайте профили среднего модуля, стандартного отклонения и распределения как для верхнего, так и для нижнего слоя с помощью встроенных инструментов статистического анализа программного обеспечения. Экспорт обработанных карт модулей и количественных данных.
    12. Количество сканирований АСМ на образец: Выполните три независимых сканирования всей области для каждого образца. Убедитесь, что каждое сканирование охватывает область, соответствующую размеру структурных элементов образца, 70 мкм × 70 мкм для образцов с периодическими полосами 50 мкм и 50 мкм × 50 мкм для образцов с интервалом 20 мкм. Для измерения модуля упругости базовой структуры (10:1 PDMS) и пленки верхнего слоя (30:1 PDMS) реализуйте следующую стратегию выборки для обеспечения надежности данных.
      1. Пленка верхнего слоя (30:1 PDMS): измеряйте модуль 2x независимо друг от друга, при этом каждое измерение состоит из двух неперекрывающихся сканов размером 5 мкм × 5 мкм.
      2. Базовая структура (10:1 PDMS): Учитывая две различные конфигурации периодических полос (расстояние 20 мкм и 50 мкм), измерьте модуль 2x независимо для каждой конфигурации.

4. Эксперимент на клеточной культуре in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS является гидрофобным материалом, который необходимо покрыть для обеспечения клеточной адгезии перед культивированием клеток, и соответствующий метод покрытия должен быть выбран в соответствии с типом клеток. Если для клеточного эксперимента используются первичные клетки, необходимо получить этическое одобрение.

  1. Покрытие из поли-D-лизина (PDL)
    1. Стерилизовать основание путем погружения в спирт в течение 10 мин; затем постирать в течение 3 х 5 минут с PBS.
    2. Растворите PDL (молекулярная масса от 150 000 до 300 000 Да) с помощью PBS в концентрации 0,1 мг/мл. Для субстрата размером с 24 лунки добавьте 1 мл рабочего раствора PDL и поместите его в инкубатор при температуре 37 °C на 4 часа, чтобы полностью покрыть поверхность субстрата.
    3. После того, как покрытие будет готово, удалите рабочий раствор PDL и удалите остатки PDL, промыв 3x PBS. Используйте субстрат для последующих клеточных экспериментов. Если покрытие не используется сразу, высушите его и храните при температуре 4 °C.
      Примечание: Успешное покрытие представляло собой однородную, безликую поверхность при фазово-контрастной микроскопии, без видимых кристаллических осадков или артефактов высыхания. Подложки с какими-либо признаками кристаллизации или неравномерным покрытием отбрасывались.
  2. Выделение и культивирование первичных стромальных клеток костного мозга мышей (mBMSCs)
    1. Выделите первичные стромальные клетки костного мозга мыши (mBMSC) из большеберцовой и бедренной костей мышей.
    2. Культивируют клетки в питательной среде, состоящей из α-MEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% антибиотика-антимикотика и 1% пирувата натрия.
    3. Семенные клетки при прохождении 3 на субстраты, полученные на этапе 4.1.3, при плотности 5000 клеток/см2 для минимизации потенциальных искажающих эффектов от межклеточного контакта.
  3. Иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация
    1. После 16 ч культивирования (37 °C, 5%CO2) зафиксировать клетки 4% параформальдегидом на 10 мин при комнатной температуре и 3 раза промыть PBS. Затем пропитайте клетки 0,1% Triton X-100 в течение 15 минут при комнатной температуре и промойте 3 раза PBS.
    2. Для визуализации цитоскелета окрашивайте F-актин фаллоидином (в разведении 1:500) в течение 20 минут при комнатной температуре и промойте 3 раза достаточным количеством PBS, чтобы удалить остатки красителя.
    3. Монтаж подложки с одновременным окрашиванием ядров клеток. Нанесите каплю глицерина с DAPI, чтобы покрыть клетки. После этого осторожно положите покровный лист поверх основания и запечатайте края лаком для ногтей. Избегайте образования пузырей, насколько это возможно.
    4. Получение флуоресцентных изображений, фиксирующих клеточную морфологию и позиционирование ядра, с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью фотолитографии изготавливались многоразовые силиконовые мастер-формы с параллельными гребневыми микроструктурами. Были созданы две конструкции с шириной канавки (ширина конька идентична ширине канавки) 20 и 50 мкм соответственно. Каждая узорчатая область имела размеры от 7 мм × 7 мм. Точность и возможность повторного использования силиконовых форм значительно упростили процесс повторного изготовления подложек. Затем мастер-форма использовалась для репликации микроструктур в PDMS. Твердая формула PDMS была отлит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен новый подход к проектированию двухслойной подложки на основе PDMS, предназначенной для внесения локализованных изменений жесткости при сохранении топографически однородной безликой поверхности. Такой подход позволяет осуществлять механическую модуляцию исключительно за счет вариаций геометрии подструктуры, сохраняя при этом постоянный химический состав поверхности и топографию. Следовательно, он эффективно отделяет сигнал жесткости от других физических и х...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование было проведено при финансовой поддержке Фонда фундаментальных исследований для центральных университетов Китая (No 2042024YXB018 от W. Ji).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  4% параформальдегидServicebio TechnologyG1101
АцетонШанхайский Аладдин10000418
Анти-АнтиGibco15240-062Антибиотик-антимикотик
Медиум для монтажа антифейда с DAPIBeyotime BiotechnologyP0131глицерин с DAPI 
Клеточная культурная пластинаГНЕЗДО70200124 скважины
ДесикаторSichuan Shubo (Group) Co., Ltd913354-30SNВнутренний диаметр=180 мм
Сыворотка плода для быкаHyCloneSV30208.02
Инвертированный флуоресцентный микроскопОлимпDP74
ИзопропанолШанхайский Аладдин80109218GC&GE; 99.7%
Элайнер для маскиSichuan Nanguang Vacuum Technology Co., LtdH94-37
Модификация MEM AlphaHyCloneSH30265.01
Анализ на наноскопеBrukerВерсия 3.0Программное обеспечение для обработки и анализа изображений AFM.
Opera Phenix Plus Система высокого содержания изображенияПеркин Элмер2400L23248 Оснащён 10-кратным воздушным целем
PGMEASuzhou NanoMicroTechnology Co., Ltd171011-1Проявительный негативный фоторезист; SPEC: UL; Процент: мин99,7%
ФаллоидинUelandy YP0052L594-Фаллоидин
Раствор солёного раствора с буфером фосфатовHyCloneSH30256.01
Очиститель плазмыПлазменная технология (Германия)Flecto 10 
Поли-D-лизинBeyotime BiotechnologyST508Номер CAS 27964-99-4
Сканирующий зондовый микроскопBrukerИконка измеренияИспользует программное обеспечение для управления наноскопом, включая экспериментальные рабочие пространства PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) и Point-and-Shoot Ramping.
Силиконовый наконечник на рычаге нитридаBrukerSCANASYST-AIRЗонд оснащён одной V-образной консолью с покрытием Al Reflex; k= 0,4 Н/м (номинально), f0 = 70 кГц.
Кремниевые пластиныShenzhen Rigorous Technology Co., Ltd-50,8 и плюсм; диаметр 0,3 мм, (100)ориентированный, 525 и плюс; 25 & mu; m толщиной
Пируват натрияGibco11360-070
Спин-коутерИнститут микроэлектроники Китайской академии наукKW-4A
СУ-8 3025Suzhou NanoMicroTechnology Co., Ltd-Отрицательный фоторезист; 72,3% твердых веществ; Вязкость 4400; Плотность 1,143 г/мл
Набор силиконового эластомера SYLGARD 184Компания Dow Chemical01673921
Трихлоро(1H,1H,2H,2H-тридекафтор-n-октил)силанШанхайский Аладдин78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML1000,1% Triton X-100 для проницаемости
Trypsin-EDTAGibco25200-0720,25% трипсин-ЭДТА (1 раз)
Вакуумная духовкаMemmert (Германия) VO 200 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Deymier, A. C., et al. Micro-mechanical properties of the tendon-to-bone attachment. Acta Biomater. 56, 25-35 (2017).
  6. Wang, Z., et al. Multi-omics investigations revealed underlying molecular mechanisms associated with tumor stiffness and identified sunitinib as a potential therapy for reducing stiffness in pituitary adenomas. Front Cell Dev Biol. 10, 820562(2022).
  7. Stylianou, A., Voutouri, C., Mpekris, F., Stylianopoulos, T. Pancreatic cancer presents distinct nanomechanical properties during progression. Ann Biomed Eng. 51 (7), 1602-1615 (2023).
  8. Cambria, E., et al. Linking cell mechanical memory and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 24 (3), 216-228 (2024).
  9. Mittelheisser, V., et al. Evidence and therapeutic implications of biomechanically regulated immunosurveillance in cancer and other diseases. Nat Nanotechnol. 19 (3), 281-297 (2024).
  10. Sridharan, R., Cavanagh, B., Cameron, A. R., Kelly, D. J., O'Brien, F. J. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 89, 47-59 (2019).
  11. Yi, B., Xu, Q., Liu, W. An overview of substrate stiffness guided cellular response and its applications in tissue regeneration. Bioact Mater. 15, 82-102 (2022).
  12. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophys J. 86 (1), 617-628 (2004).
  13. Song, Y., et al. Biphasic regulation of epigenetic state by matrix stiffness during cell reprogramming. Sci Adv. 10 (7), eadk0639(2024).
  14. Taufalele, P. V., et al. Matrix stiffness enhances cancer-macrophage interactions and M2-like macrophage accumulation in the breast tumor microenvironment. Acta Biomater. 163, 365-377 (2023).
  15. Xie, J., Bao, M., Hu, X., Koopman, W. J. H., Huck, W. T. S. Energy expenditure during cell spreading influences the cellular response to matrix stiffness. Biomaterials. 267, 120494(2021).
  16. Wu, B., et al. Stiff matrix induces exosome secretion to promote tumour growth. Nat Cell Biol. 25 (3), 415-424 (2023).
  17. Driscoll, T. P., et al. Integrin-based mechanosensing through conformational deformation. Biophys J. 120 (20), 4349-4359 (2021).
  18. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), 9(2012).
  19. Soliman, B. G., et al. Droplet-based microfluidics for engineering shape-controlled hydrogels with stiffness gradient. Biofabrication. 16 (4), 045026(2024).
  20. Kosmidis Papadimitriou, A., et al. Fabrication of gradient hydrogels using a thermophoretic approach in microfluidics. Biofabrication. 16 (2), 025023(2024).
  21. Isomursu, A., et al. Directed cell migration towards softer environments. Nat Mater. 21 (9), 1081-1090 (2022).
  22. Xia, J., et al. Regulation of cell attachment, spreading, and migration by hydrogel substrates with independently tunable mesh size. Acta Biomater. 141, 178-189 (2022).
  23. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nat Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  24. Li, X., et al. 3D culture of chondrocytes in gelatin hydrogels with different stiffness. Polymers. 8, 269(2016).
  25. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical regulation of cell behavior-cross talk between substrate stiffness and nanotopography. Engineering. 3 (1), 36-54 (2017).
  26. Lee, S., Hong, J., Lee, J. Cell motility regulation on a stepped micro pillar array device (SMPAD) with a discrete stiffness gradient. Soft Matter. 12 (8), 2325-2333 (2016).
  27. Hong, J., Lee, S., Park, S., Lee, J. Micro checkerboard patterned polymeric surface with discrete rigidity for studying cell migration. J Micromech Microeng. 25 (4), 045012(2015).
  28. Mostert, D., Van Der Putten, C., Sahlgren, C. M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Bioengineering structural anisotropy in living tissues. Nat Rev Bioeng. 3 (9), 727-741 (2025).
  29. Khuu, N., Kheiri, S., Kumacheva, E. Structurally anisotropic hydrogels for tissue engineering. Trends Chem. 3 (12), 1002-1026 (2021).
  30. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys: Condens Matter. 22 (19), 194116(2010).
  31. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  32. Leong, P. L., Morgan, E. F. Measurement of fracture callus material properties via nanoindentation. Acta Biomater. 4 (5), 1569-1575 (2008).
  33. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomater. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  34. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J Appl Polym Sci. 131 (22), 41050(2014).
  35. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  36. Wang, D., et al. A novel approach for PDMS thin films production towards application as substrate for flexible biosensors. Mater Lett. 221, 228-231 (2018).
  37. Tonin, M., Descharmes, N., Houdré, R. Hybrid PDMS/glass microfluidics for high resolution imaging and application to sub-wavelength particle trapping. Lab Chip. 16 (3), 465-470 (2016).
  38. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  39. Psarski, M., et al. Hydrophobization of epoxy nanocomposite surface with 1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltrichlorosilane for superhydrophobic properties. Cent Eur J Phys. 10 (5), 1197-1201 (2012).
  40. Pham, J. T., Xue, L., Del Campo, A., Salierno, M. Guiding cell migration with microscale stiffness patterns and undulated surfaces. Acta Biomater. 38, 106-115 (2016).
  41. Miranda, I., et al. Properties and applications of PDMS for biomedical engineering: a review. J Funct Biomater. 13, 2(2022).
  42. Zhang, W., Choi, D. S., Nguyen, Y. H., Chang, J., Qin, L. Studying cancer stem cell dynamics on PDMS surfaces for microfluidics device design. Sci Rep. 3 (1), 2332(2013).
  43. Toworfe, G. K., Composto, R. J., Adams, C. S., Shapiro, I. M., Ducheyne, P. Fibronectin adsorption on surface-activated poly(dimethylsiloxane) and its effect on cellular function. J Biomed Mater Res A. 71 (3), 449-461 (2004).
  44. Wang, L., Sun, B., Ziemer, K. S., Barabino, G. A., Carrier, R. L. Chemical and physical modifications to poly(dimethylsiloxane) surfaces affect adhesion of Caco-2 cells. J Biomed Mater Res A. 93 (4), 1260-1271 (2010).
  45. Lu, M., Ding, L., Zhong, T., Dai, Z. Improving hydrophilicity and adhesion of PDMS through dopamine modification assisted by carbon dioxide plasma. Coatings. 13, 126(2023).
  46. Jiang, B., Guo, H., Chen, D., Zhou, M. Microscale investigation on the wettability and bonding mechanism of oxygen plasma-treated PDMS microfluidic chip. Appl Surf Sci. 574, 151704(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи