Method Article

Процедура отбора проб на основе фенол-красной нити для нецеленаправленной липидомики слезной жидкости при обнаружении биомаркеров

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает уникальный клинический протокол для сбора образцов человеческой слёзной жидкости с использованием фенол-красных нитей и рабочего процесса на основе жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) для выявления липидомического профиля слезы. Простой метод бифазного разделения метил-трет-бутилового эфира (MTBE)/метанола позволяет быстро экстракцию липидов слёзы с высокой степенью восстановления для обнаружения биомаркеров слёз.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липиды слёзы крайне важны для стабильности слёзной плёнки и здоровья поверхности глаза. Изменения в составе слёз могут быть связаны с глазными и системными заболеваниями, такими как дисфункция мейбомиевых желез и дислипидемия. Профилирование слёзных липидов может помочь в обнаружении биомаркеров для диагностики и управления заболеваниями. Однако распространённые методы слёзного отбора имеют свои ограничения: полоски Ширмера часто вызывают раздражение и дискомфорт зрения из-за большой площади контакта с поверхностью глаза, тогда как сбор через микрокапиллярные трубки может обеспечивать низкую воспроизводимость из-за изменчивости оператора, особенно при выполнении разными сотрудниками. Эти ограничения могут снизить точность и согласованность липидомических данных. В данном исследовании представлен минимально инвазивный метод отбора проб на основе феноловой красной нити (PRT), оптимизированный для слезной липидомики. Тонкая структура PRT минимизирует риск раздражения глаз и позволяет быстро и мягко собирать слёзы. Этот удобный и простой в использовании метод подходит для испытуемых с меньшим объёмом слёз или меньшей толерантностью к ощущениям инородного тела, а также позволяет более воспроизводимым собрать образцы, снижая изменчивость, зависящую от оператора. Слезные липиды, собранные с помощью PRT, были извлечены с помощью оптимизированного протокола фазового разделения метанола/метилбутилового эфира (MTBE) и проанализированы с помощью высокоразрешающего LC-Orbitrap-IQX MS/MS с программным обеспечением LipidSearch. Рабочий процесс выявил более 700 уникальных видов слезовозных липидов, каждый из которых характеризуется специфическими ионами продукта, полученного из жирных кислот. Эти результаты показывают, что отбор проб на основе PRT обеспечивает устойчивое восстановление липидов для слёзного липидомического анализа. Этот минимально инвазивный и воспроизводимый подход предоставляет практическую платформу для клинических и экспериментальных исследований слёзистых липид. В конечном итоге это также может способствовать обнаружению биомаркеров и мониторингу заболеваний.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Слёзная плёнка — это внешний барьер, защищающий поверхность зрения от патогенов и поддерживающий глазнойгомеостаз 1,2, тогда как липидный слой в пленке является ключевым компонентом для предотвращения испарения слёз и поддержания еёстабильности 3,4. Дисрегуляция состава липидов слёзы связана с различными заболеваниями глаз, включая сухость глаза (DED), дисфункцию мейбомиевых желез (MGD) и аллергический конъюнктивит 5,6,7,8. В результате детальная характеристика слёзной липидомики стала важным и трендовым направлением исследований для более глубокого понимания молекулярных патологий, лежащих в основе этих глазных заболеваний9.

Хотя подход слезной липидомии имеет значительное клиническое значение, одной из ключевых задач в слезной липидомике является создание стандартизированного, воспроизводимого рабочего процесса сбора и анализа. Современные методы отбора слез, полоски Ширмера и микрокапиллярная трубка имеют свои ограничения. Полоски Ширмера имеют большую зону контакта с поверхностью глаза, что часто вызывает раздражение глаза и разрыврефлексов 9,10. Для сравнения, сбор микрокапиллярных трубок сильно зависит от техники оператора и может давать непоследовательные результаты при выполнении разных сотрудников11. Кроме того, неправильное использование этих инструментов для отбора проб может нести риск повреждения поверхности глаза. Эти ограничения могут снизить точность и воспроизводимость нижних данных12,13. Кроме того, методы слёз, требующие сложных процедур обработки, могут ограничить их доступность и стандартизацию в различных лабораториях и клинических условиях. Поэтому существует острая необходимость создать неинвазивный, надёжный и воспроизводимый рабочий процесс сбора и обработки разрывов, который сможет сохранить родной профиль липидов слёз.

Недавние исследования подчеркнули полезность феноловой красной нити (PRT) для анализов рабочих процессов LC-MS/MS в протеомных и метаболомныхприложениях 14,15. PRT обладает внутренними преимуществами как инструмент сбора слёз. Её тонкая структура, минимально инвазивный характер и простая процедура выборки могли минимизировать техническую сложность и уменьшить зависимость от оператора вариабельность, при этом они хорошо переносились большинствомиспытуемых 14,16. Однако стандартизированный рабочий процесс, специально предназначенный для анализа липидомии слезоточной слезы на основе PRT, пока не создан.

Этот протокол вводит интегрированный рабочий процесс воспроизводимой липидомики слёз: удобный метод сбора слез на основе PRT, адаптированный для анализа липид, оптимизированный протокол экстракции метил-трет-бутилового эфира (MTBE)/метанола с определёнными соотношениями растворителя к образцам и контролями хранения17,18, а также модифицированный метод идентификации липидов с использованием высокоразрешающей LC-MS/MS. Такой стандартизированный подход позволяет проводить последовательное профилирование слезной липидомы для дальнейшего обнаружения биомаркеров и характеристики заболевания. Кроме того, он особенно подходит для людей с низким объёмом слёз или сниженной толерантностью к ощущениям инородного тела (рисунок 1).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Схематический обзор рабочего процесса на основе Phenol Red Thread (PRT) для человеческой слезной липидомики. Слёзная жидкость собирается у испытуемых с помощью метода PRT, что позволяет регулярно брать образцы с минимальным дискомфортом. Обработка образцов включает последовательную двуфазную экстракцию MTBE/метанола, концентрацию с помощью SpeedVac и восстановление экстрактов липидов слёзистых слёз для жидкой хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Липидомические профили затем получаются через LC-MS/MS и подвергаются аннотации и идентификации с помощью программного обеспечения LipidSearch. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было одобрено Институциональным обзорным советом (IRB) Гонконгского политехнического университета. Участники предоставили письменное информированное согласие перед участием в исследовании. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Сбор человеческой слёзной жидкости на основе феноловой красной нити (PRT)

  1. Наденьте перчатки и дезинфицируйте рабочее место, чтобы предотвратить загрязнение образцов.
  2. Убедитесь, что посылка PRT запечатана и не просрочена, прежде чем открывать.
  3. Держите нитку за конец напротив согнутого крючка. Всегда избегайте трогать согнутую половину крюка PRT.
  4. Попросите испытуемого обратить внимание на верхний носовой напрямок.
  5. Аккуратно опустите нижнее веко испытуемого и введите ПРТ с согнутым крючком, расположенным в нижней височной пальпебральной конъюнктиве возле внешнего кантуса глаза (рисунок 2).

figure-protocol-1
Рисунок 2: Положение фенол-красной нити при сборе слёз.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Попросите субъекта мягко закрыть глаза и слегка наклонить голову вперёд, чтобы PRT не касался кожи лица.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поглощённая слеза постепенно индуцирует красный красительный фронт, указывающий на выбранную область PRT из-за pH-чувствительного фенолового красного цвета. Для обеспечения достаточного количества слёзной жидкости для липидомического анализа предпочтительно собирать объём слёз, эквивалентный 50 мм PRT, обычно завершаемый в течение 2 минут.
  2. Аккуратно опустите нижнюю часть века испытуемого и вытащите образец PRT. Избегайте касания выбранной области.
  3. Запишите длину отобранной области PRT и перенесите PRT в новую пробирку с помощью стерильных щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если длина выбранного PRT составляет <50 мм, пожалуйста, попросите испытуемого отдохнуть 1-3 минуты и повторить сбор тем же глазом. Перенесите каждую пробную ПРТ в отдельную пробирку.
  4. Правильно маркируйте и закрывайте пробирки.
  5. Тщательно очистите перчатки и щипцы метанолом и чистыми бумажными салфетками, чтобы удалить остатки разрывов или загрязнения, а затем дайте им высохнуть.
  6. Повторите шаги 1.2–1.10 для другого глаза.
  7. Запечатайте пробирки парапленкой и немедленно храните образец при -20°C для временного хранения или при -80°C для длительного хранения. Избегайте ненужных циклов замораживания и оттаивания и защищайте отобранный PRT от света.

2. Обработка отобранных ПРТ

  1. Предварительно промыйте микроножницы метанолом перед обработкой PRT.
  2. Отбросьте изогнутый конец крюка (то есть первые 3 мм) PRT (рисунок 3).

figure-protocol-2
Рисунок 3: Внешний вид фенол-красной нити (PRT). (A) Неиспользованная PRT с изогнутым крючковым концом. (B) Использовали PRT с указанным разделом и собраны для извлечения  липид.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Разрежьте отобранный участок PRT (то есть область выше фронта фенол-красного красителя) на 2 мм кусочки и перенесите эти части в чистую 1,5 мл органической микроцентрифуга, устойчивую к растворителям.

3. Бифазное разделение MTBE/метанола для экстракции липидов из образца PRT

ВНИМАНИЕ: MTBE и метанол — горючие и летучие. Используйте в хорошо проветриваемом помещении или в вытяжной вытяжке. Избегайте открытого огня и искр. Наденьте перчатки и лабораторный халат. Мойте руки после обращения.

  1. Положите образцы на лёд.
  2. Добавьте 232 мкл ледяного метанола (класса MS) в каждый образец и вихрь на 15 секунд.
  3. Соникуйте образцы в предварительно охлажденном ультразвуковом очистителе в течение 15 минут.
  4. Добавьте 774 мкл MTBE (ВЭЖХ класса) и 194 мкл деионизированной воды в каждый образец и вихрь в течение 15 секунд. Итоговое соотношение объёма MTBE:метанол:вода в образце должно составлять 4:1,2:1 (v/v/v).
  5. Снова соникуйте образцы в предварительно охлажденном ультразвуковом очистителе в течение 15 минут.
  6. Инкубировать образец в термомиксере в течение 8 часов при 4 °C с встряхиванием при 1200 об/мин.
  7. Оставьте смесь при комнатной температуре 10 минут.
  8. Центрифугуйте полученные смеси при 10 000 × г в течение 10 минут при 4 °C.
  9. После центрифугирования смеси разделяются на две фазы (рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения фазового разделения осмотрите образец на наличие двух отдельных слоёв: верхняя органическая фаза (богатая MTBE) должна выглядеть прозрачной с небольшой молочно-непрозрачностью, а нижняя водная фаза имеет жёлтую окраску, вызванную индикатором фенол-красного цвета. Продолжайте только при соблюдении этих фазовых характеристик, как показано на рисунке 4.

figure-protocol-3
Рисунок 4: Фазовое разделение липидной экстракции с использованием MTBE-метанола-воды: верхняя органическая фаза и нижняя водная фаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Аккуратно соберите 700 мкл верхней органической фракции, содержащей липиды, и перенесите в заранее охлаждённую новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
  2. Выбросить нижнюю водную фазу, содержащую остатки MTBE и метанол, как опасные химические отходы. Собирайте отходы в маркированных, герметичных контейнерах и утилизируйте их в соответствии с институциональными протоколами по опасным отходам и местными нормативами. Не выливайте растворители в канализацию.
  3. Сушите липидные экстракты с помощью охлаждённого концентратора SpeedVac в течение 4 часов при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить полное высыхание, периодически проверяйте сухость образца, начиная с 2 часа. Продлевайте время сушки по мере необходимости, пока образцы полностью не высохнут.
  4. Храните высушенные липидные экстракты при -20 °C для краткосрочного хранения или при -80 °C для длительного хранения.

4. Восстановление извлеченного слёзного липида для анализа LC-MS/MS

  1. Воссоздайте высушенные липидные экстракты с 50 мкл ледяной смеси метанола (MS класса)/хлороформ (HPLC класса) (1:1, вольт/в) в качестве растворителя (1 мкл растворителя на 1 мм используемого PRT) и затем соникации в предварительно охлажденном ультразвуковом очистителе в течение 15 минут.
  2. Центрифугуйте восстановленные липидные экстракты при 14 000 × г и 4 °C в течение 10 минут.
  3. Аккуратно перенесите 40 мкл супернатанта в автоматический стеклянный флакон с установленной стеклянной вставкой.
  4. Плотно закройте флакон крышкой с открытым верхом без щели и подготовьте к анализу LC-MS/MS.

5. Сбор образцов с помощью LC-MS/MS

  1. Для жидкой хроматографии установите температуру камеры колонки и пробоотборника на 50 °C и 4 °C соответственно.
  2. Для каждой инъекции загружайте 5 мкл образца на колонку обратной фазы LC (C18; 1,7 мкм, 100 мм × 2,1 мм) и фракционируйте липиды при расходе 0,3 мл/мин при градиенте разделения в 24 минуты.
    1. Используйте мобильную фазу A, состоящую из смеси ацетонитрила 60:40 (класс MS):воды (v/v) с аммонийным формиатом 5 мМ (MS grade) и 0,1% (v/v) муравьиной кислоты (MS grade), а также мобильной фазы B с изопропанолом 90:10 (MS grade): ацетонитрилом (v/v) с 5 мМ аммонийным формиатом и 0,1% (v/v) муравьиной кислоты.
    2. Используйте следующий градиент: 0-2 мин: 40% B; 2-2,5 мин: 40% B; 2,5-3 мин: 58% B; 3-18 мин: 99% B; 18-20 мин: 99% B; 20-20,1 мин: 40% B; 20,1-24 мин: 40% B.
  3. Для масс-спектрометра Orbitrap установите напряжение распыления на +3,5 кВ для положительного режима или на -2,5 кВ для отрицательного режима.
  4. Отрегулировать расход газа в оболочке до 45 Арб и расход вспомогательного газа до 10 Арбар.
  5. Установите расход газа для чистки на 2 Арб.
  6. Установите температуру ионотрансферной трубки на 300 °C, а температуру испарителя — на 320 °C.
  7. Используйте режим сбора данных (DDA).
  8. Для MS1 установите разрешение 120 000, дальность сканирования 100-2000 м/з, стандартную мишень AGC, время автоматического впрыскивания, динамическое исключение до 6 с и порог интенсивности 5,0e4.
  9. Для MS2 установите разрешение на 15 000, дальность автосканирования, стандартную цель AGC, время динамической инъекции, окно изоляции на 1,6 м/з, тип энергии столкновения как диссоциация столкновений с высокой энергией (HCD) и нормализованную энергию столкновения (NCE) до ступенчатых значений 15, 30 и 40.
  10. Анализируйте необработанные данные с помощью программного обеспечения LipidSearch или других совместимых платформ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Композитные образцы слез были собраны у 16 здоровых добровольцев при трёх независимых визитах с интервалом в две недели (R1, самая старая партия; R2, R3 собирались последовательно через две недели после каждого). Используя LipidSearch с жёсткими критериями (например, соотношение сигнал/шум ≥100, степень C и выше, и интенсивность ионов ≥30 000), мы выявили 773, 890 и 1 025 уникальных видов липидов в R1-R3 соответственно (рисунок 5A). Положительный ионный режи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Преимущества отбора слёз на основе PRT и извлечения липидов
Рабочий процесс по слезной липидомике на основе PRT, представленный здесь, предлагает минимально инвазивный и практичный метод отбора проб для комплексного профилирования слёзных липид. По сравнению с полосками Ширмера, требующими длительного контакта и увеличения объёма образцов, отбор проб PRT проходит быстро, может быть выполнен за 2 минуты, хорошо переносится различными популяциями, включая тех, у кого сн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана инициативой InnoHK, правительством Специального административного района Гонконга и Исследовательским центром SHARP Vision при Политехническом университете Гонконга. Авторы также с благодарностью выражают признательность за техническую поддержку со стороны Университетского исследовательского центра химического и экологического анализа (UCEA) и Университетского исследовательского центра в области наук о жизни (ULS) Гонконгского политехнического университета.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ацетонитрил (ACN), LC-MS классRCI LabscanLM1005
Колонка ACQUITY UPLC CSH C18Корпорация Уотерс186005297130Å, 1.7 µ m, 2,1 мм X 100 мм
Аммонийный формиат, LC-MS сортаСигма-Олдрич55674
Автоматический стеклянный флаконУэлл Рич Сайентифик2ML-9-V10022 мл прозрачного стекла 12*32 мм с плоским основанием 9-425 винтовой резьбы с этикеткой (С блокном)
Синий 9-425 открытый ребристообразный винтовой колпачок 9-425;Уэлл Рич Сайентифик9-SP1003с 9 мм, белый PTFE/красный силиконовый септ 1 мм
Хлороформ, HPLC классаРеагенты Дуксана1271
Трубы с безопасным замком Eppendorf, 1,5 млЭппендорф30120086
Муравьиная кислота (FA),   Класс LC-MSThermoFisher ScientificA117-50
Стеклянная микровставкаУэлл Рич Сайентифик2ML-N2002250 и микро; Вставка L, прозрачное стекло, коническое основание с полиустернами, размер: 5,8*28,5 мм
Изопропанол, LC-MS сортаRCI LabscanLM1162
Программное обеспечение LipidSearchThermoFisher ScientificOPTON-30879Версия 5
Метанол,   Класс LC-MSRCI LabscanLM1115
Феноловая красная нить  (PRT)Тяньцзинь Цзинмин Компания по развитию новых технологий20192160086
Рефрижераторная центрифугаThermoFisher Scientific75007200
Холодильный центробежный концентратор CentriVap и холодные ловушки CentriVapLabconco16108335
Микротрубки с винтовой крышкойThermoFisher Scientific3488
трет-бутилметилэфир (MTBE), класс ВЭЖХРеагенты Дуксана1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
ThermoMixer CЭппендорф5382000015
Ультразвуковой очистительCrest UltrasonicP500D-45
Вихревой миксерБенчмаркBV1003

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
  2. Ambaw, Y. A., et al. Profile of tear lipid mediator as a biomarker of inflammation for meibomian gland dysfunction and ocular surface diseases: Standard operating procedures. Ocul Surf. 26, 318-327 (2022).
  3. Sheppard, J. D., Nichols, K. K. Dry eye disease associated with meibomian gland dysfunction: Focus on tear film characteristics and the therapeutic landscape. Ophthalmol Ther. 12 (3), 1397-1418 (2023).
  4. Lam, S. M., et al. Lipidomic analysis of human tear fluid reveals structure-specific lipid alterations in dry eye syndrome. J Lipid Res. 55 (2), 299-306 (2014).
  5. Borchman, D., Ramakrishnan, V., Henry, C., Ramasubramanian, A. Differences in meibum and tear lipid composition and conformation. Cornea. 39 (1), 122-128 (2020).
  6. Miyamoto, M., Sassa, T., Sawai, M., Kihara, A. Lipid polarity gradient formed by ω-hydroxy lipids in tear film prevents dry eye disease. eLife. 9, 53582(2020).
  7. Zhao, H., et al. Lipidomics profiles revealed alterations in patients with meibomian gland dysfunction after exposure to intense pulsed light. Front Neurol. 13, 827544(2022).
  8. Bland, H. C., Moilanen, J. A., Ekholm, F. S., Paananen, R. O. Investigating the role of specific tear film lipids connected to dry eye syndrome: A study on o-acyl-ω-hydroxy fatty acids and diesters. Langmuir. 35 (9), 3545-3552 (2019).
  9. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  10. Winiarczyk, M., Biela, K., Michalak, K., Winiarczyk, D., Mackiewicz, J. Changes in tear proteomic profile in ocular diseases. Int J Environ Res Public Health. 19 (20), 13341(2022).
  11. Bertram, M., et al. Influence of Schirmer strip wetness on volume absorbed, volume recovered, and total protein content in canine tears. Vet Ophthalmol. 24 (4), 425-428 (2021).
  12. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3p medicine. EPMA J. 12 (4), 449-475 (2021).
  13. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  14. Kecskeméti, G., Tóth-Molnár, E., Janáky, T., Szabó, Z. An extensive study of phenol red thread as a novel non-invasive tear sampling technique for proteomics studies: Comparison with two commonly used methods. Int J Mol Sci. 23 (15), 8647(2022).
  15. Barmada, A., Shippy, S. A. Quantifying sample collection and processing impacts on fiber-based tear fluid chemical analysis. Transl Vis Sci Technol. 9 (10), 23(2020).
  16. Hao, Y., et al. Validation of the phenol red thread test in a Chinese population. BMC Ophthalmol. 23 (1), 498(2023).
  17. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  18. Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J., Bowden, J. A. Optimization of Folch, Bligh-Dyer, and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies. Anal Chim Acta. 1037, 351-357 (2018).
  19. Lam, S. M., et al. Extensive characterization of human tear fluid collected using different techniques unravels the presence of novel lipid amphiphiles. J Lipid Res. 55 (2), 289-298 (2014).
  20. Quah, J. H., Tong, L., Barbier, S. Patient acceptability of tear collection in the primary healthcare setting. Optom Vis Sci. 91 (4), 452-458 (2014).
  21. Saini, R. K., Prasad, P., Shang, X., Keum, Y. S. Advances in lipid extraction methods-a review. Int J Mol Sci. 22 (24), 13643(2021).
  22. Chen, J., Nichols, K. K., Wilson, L., Barnes, S., Nichols, J. J. Untargeted lipidomic analysis of human tears: A new approach for quantification of o-acyl-omega hydroxy fatty acids. Ocul Surf. 17 (2), 347-355 (2019).
  23. Köfeler, H. C., et al. Recommendations for good practice in MS-based lipidomics. J Lipid Res. 62, 100138(2021).
  24. Ulmer, C. Z., et al. A review of efforts to improve lipid stability during sample preparation and standardization efforts to ensure accuracy in the reporting of lipid measurements. Lipids. 56 (1), 3-16 (2021).
  25. Sens, A., et al. Pre-analytical sample handling standardization for reliable measurement of metabolites and lipids in LC-MS-based clinical research. J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 28, 35-46 (2023).
  26. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A simple fractionated extraction method for the comprehensive analysis of metabolites, lipids, and proteins from a single sample. J Vis Exp. (124), e55802(2017).
  27. Fong, P. Y., et al. Role of tear film biomarkers in the diagnosis and management of dry eye disease. Taiwan J Ophthalmol. 9 (3), 150-159 (2019).
  28. Sanroque-Muñoz, M., et al. Tear-derived extracellular vesicles as diagnostic biomarkers for ocular and neurodegenerative diseases: Opportunities and challenges. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 6 (3), 609-625 (2025).
  29. Vera-Montecinos, A., et al. High throughput tear proteomics with data independent acquisition enables biomarker discovery in allergic conditions. Sci Rep. 15 (1), 31181(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tear LipidomicsPhenol Red ThreadTear Fluid SamplingLipid BiomarkersOcular Surface HealthMethanol MTBE ExtractionLC MS Lipid AnalysisTear Film StabilityMinimally Invasive SamplingLipid Species Identification

Related Articles