Методическая статья

Визуализация пермеабилизации лизосомальной мембраны при некроптозе с помощью живых клеток

DOI:

10.3791/69495

⸱

14 ноября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод визуализации живых клеток для мониторинга пермеабилизации лизосомальной мембраны во время некроптоза с использованием флуоресцентных зондов, которые обнаруживают изменения целостности лизосомальной мембраны и закисление.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некроптоз, форма регулируемого некроза, завершается разрывом клеточной мембраны. Наша лаборатория и другие исследователи обнаружили, что пермеабилизация лизосомальной мембраны (ПМЖ) является ранним и важным событием в этом процессе, предшествующим разрыву мембраны. Быстрый LMP высвобождает мощные лизосомальные ферменты, в частности протеазы, в цитозоль, активно способствуя гибели клеток. Визуализация живых клеток является бесценным инструментом для обнаружения ПМП во время некроптоза в режиме реального времени. Несколько флуоресцентных красителей обладают высокой эффективностью: (1) pH-чувствительные красители LysoTracker отслеживают изменения лизосомального pH. Снижение сигнала флуоресценции указывает на потерю лизосомального градиента pH, что является первичным признаком лизосомальной дисфункции, которая может быть предшественником или прямым следствием ПМП. (2) Меченые флуоресцеином шарики декстрана интернализуются и накапливаются в лизосомах. Их попадание в цитозоль сигнализирует о полном НПМ и утечке груза. Здесь мы наблюдали прогрессирующую потерю флуоресценции лизотрекера с диффундированием флуоресценции декстрана в цитозоль после индукции некроптоза. Таким образом, методология визуализации живых клеток позволяет исследователям точно отслеживать сроки и степень лизосомальной дисфункции, способствуя более полному пониманию механизмов некроптоза и освещая потенциальные терапевтические вмешательства.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некроптоз является независимой от каспазы формой регулируемой гибели клеток, связанной со многими воспалительными заболеваниями, нейродегенеративными расстройствами, легочными, печеночными и сердечными заболеваниями 1,2,3. Этот путь опосредован сложным каскадом реакций, кульминацией которых является активация рецептор-взаимодействующей протеинкиназы 1 (RIPK1), которая взаимодействует с рецептор-взаимодействующей протеинкиназой 3 (RIPK3) через их гомотипическиедомены 4,5,6 мотива взаимодействия RIP (RHIM). RIPK3, в свою очередь, рекрутирует смешанный линейный киназоподобный белок (MLKL) для формирования некросомы 7,8. Фосфорилирование MLKL с помощью RIPK3 приводит к его олигомеризации и последующей полимеризации. Затем полимеры MLKL перемещаются к клеточным мембранам, что в конечном итоге приводит к разрыву клеточной мембраны и гибели клеток 9,10,11. Тем не менее, механизмы, с помощью которых полимеры MLKL перемещаются в мембранные компартменты и вызывают разрушение мембраны, до конца не изучены.

Лизосомы — это органеллы, отвечающие за разложение и переработку клеточных материалов. В его просвете находятся протеазы, липазы, нуклеазы и гидролазы, которые отвечают за переваривание макромолекул, тем самым поддерживая клеточный гомеостаз12,13. Таким образом, поддержание лизосомальной целостности и правильного функционирования имеет важное значение для обеспечения эффективного клеточного клиренса, адаптации к стрессу и общей выживаемости клеток 14,15,16. Недавние исследования указывают на связь между некроптозом и пермеабилизацией лизосомальной мембраны (ПМЖ)17,18,19.

Наши недавние наблюдения показали, что НПМ является ранним и значимым событием в процессе некроптоза, предшествующим окончательному разрыву клеточной мембраны19. В частности, полимеризация MLKL на лизосомальной мембране индуцирует быстрый LMP к высвобождению мощных лизосомальных ферментов, в частности протеазы, включая катепсин B, в цитозоль. Эти протеазы затем расщепляют жизненно важные белки, способствуя гибели клеток. Важно отметить, что ингибирование активности CTSB надежно защищает от гибели клеток 19,20. Эти данные свидетельствуют о том, что НПМ является важнейшим модулятором пути некроптоза. Таким образом, мониторинг времени ПМР во время некроптоза имеет важное значение для понимания молекулярных механизмов и определения потенциальных терапевтических мишеней.

Многие традиционные методы обнаружения ПМП, такие как иммуноокрашивание, просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) или проточная цитометрия, требуют фиксированных образцов или иным образом предоставляют только информацию о конечных точках 21,22,23, не в состоянии охватить динамический процесс лизосомального разрушения, особенно в контексте быстрого прогрессирования некроптоза. В отличие от этого, метод визуализации живых клеток позволяет визуализировать ПМП с высоким разрешением в режиме реального времени во время некроптоза. В этом протоколе мы объединили два комплементарных лизосомальных маркера и индуцировали некроптоз в клетках HT-29 для анализа целостности лизосомальной мембраны в режиме реальноговремени19. Этот метод обеспечивает надежную и адаптируемую платформу для изучения LMP не только при некроптозе, но и, возможно, при других формах клеточного стресса, где нарушена лизосомальная целостность, особенно в контексте заболеваний или использования терапии, нацеленной на лизосомы.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивирование клеток - день 0

  1. Поместите 5000 клеток в 2 мл DMEM (модифицированная среда Dulbecco's Modified) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллина и стрептомицина (P/S) в стерильной чашке со стеклянным дном.
  2. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение ночи.

2. Загрузка бусин декстрана - день 1

  1. Разведите зеленые гранулы декстрана до 25 мкг/мл в свежем DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P/S путем добавления 20 мкл исходного раствора 2,5 мг/мл.
  2. Удалите старую среду и замените ее 2 мл гранулосодержащего DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P/S.
  3. Инкубируйте клетку в течение 24 ч при 37 °C с 5%CO2 , чтобы обеспечить интернализацию гранул в лизосомы.

3. Окрашивание Лизотрекером - день 2 (день эксперимента)

  1. Приготовьте окрашивающую среду, добавив 2 мкл 1 мМ стокового раствора Lysotracker к 2 мл свежего DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P/S до получения конечной концентрации 1 μM. Замените старую среду этим окрашивающим раствором.
  2. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 ч, соблюдая рекомендуемое время инкубации (от 30 мин до 2 ч), указанное в Руководстве по использованию молекулярных зондов компании Life Technologies27. В наших экспериментах 2 ч инкубации в клетках HT-29 приводили к сильному окрашиванию точками с сильной колокализацией с гранулами декстрана, что указывает на стабильную флуоресценцию красителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите конфокальный микроскоп за 30 минут до визуализации живых клеток.

4. Настройка конфокального микроскопа

  1. Включите компоненты системы Confocal в следующем порядке: микроскоп для ПК; мощность сканера; мощность лазера; лазерное излучение; Мощность Leica.
  2. Включите элементы управления окружающей средой: The Cube - регулятор температуры; Контроллер газосмесителя Brick - CO2 . Откройте подачу CO2 и O2 .
  3. Задайте параметры газа:
    1. Установите регулятор температуры (куб) на 37 °C.
    2. Установите регулятор газа и влажности (кирпич) на 5%CO2 и 95% влажности.
  4. Соберите камеру визуализации, как показано на рисунке 1.
  5. Настройте конфокальную цель:
    1. Используйте объектив для погружения в масло 63x/1.40 NA.
    2. Установите лазеры возбуждения на 488 нм (зеленый флуорофор) и 555 нм (красный флуорофор).
    3. Для лазера с длиной волны 488 нм выберите гибридный (HyD) детектор, а для лазера с длиной волны 555 нм выберите детектор ФЭУ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные перекрестные помехи были сведены к минимуму за счет использования предопределенных вентилей в конфокальном программном обеспечении, что подтвердило отсутствие перекрестных помех между каналами.

5. Подготовка после окрашивания (после инкубации LysoTracker)

  1. Тщательно промойте клетки три раза 2 мл PBS.
  2. Добавьте 2 мл свежего DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P/S.
  3. Нанесите одну каплю иммерсионного масла на линзу объектива перед съемкой.
  4. Установите чашку на предметный столик микроскопа.
  5. Отрегулируйте интенсивность лазера и фон.
    1. Отрегулируйте интенсивность лазера до 3%, но не более 5%.
    2. Отрегулируйте усиление детектора в программном обеспечении микроскопа для оптимизации сигнала.
    3. Чтобы свести к минимуму фон, отрегулируйте полосу контрастности.
  6. Получение исходных изображений необработанных клеток (до добавления T/S/Z), которые служат контрольным условием.
  7. Верните планшет в колпак ламинарного потока и добавьте 1 мл DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P/S, содержащего 100 нг/мл TNF-α (T), 500 нМ SMAC mimetic (S) и 100 мкМ Z-VAD-FMK (Z).
  8. Продолжайте изображение на конфокальном микроскопе.
    Примечание: T/S/Z были намеренно добавлены в более высоких концентрациях, чем стандартные протоколы. Этот выбор был сделан для ускорения LMP и гибели клеток, что позволило более надежно фиксировать ранние события в режиме реального времени.

6. Настройки получения изображения

  1. В программном обеспечении для сбора данных установите следующие параметры: режим: xyt; формат: 512 х 512; скорость: 400; зум: 3; среднее по линии: 1; накопление линий: 3; накопление кадра: 1; временной интервал: 3 мин; продолжительность: 8 часов; Включите автофокусировку.
  2. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать сбор данных с интервальной съемкой.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры, описанные в этом протоколе, позволяют получать изображения живых клеток с помощью конфокальной микроскопии для мониторинга LMP в режиме реального времени. На рисунке 1 показано схематическое изображение экспериментального протокола, начиная с нанесения покрытия ячеек и заканчивая получением изображений. В день 0 5000 клеток HT-29 были покрыты и инкубированы в течение 24 ч при 37 °C и 5%CO2. Через 24 ч (день 1) клетки инкубировали с мечеными флуоресцеином шариками декстрана (25 мкг/мл) в течение еще 24 ч в тех же условиях. Эти шарики интернализуются эндоцитозом и перемещаются к лизосомам, где они накапливаются и проявляются как яркие точки. На 2-й день (Experiment Day) клетки обрабатывали pH-чувствительным красителем LysoTracker (1 мкМ) в течение 2 ч при 37 °C и 5%CO2. LysoTracker концентрируется и проявляет сильную флуоресценцию в кислотных компартментах, таких как поздние эндосомы и лизосомы. За тридцать минут до получения изображения система конфокального микроскопа была включена и стабилизирована, включая регуляторы температуры, газа и влажности, как описано в шаге 4 протокола. Камера визуализации была собрана, как показано на рисунке 2. Использовались лазеры с длиной волны 488 нм (зеленый) и 555 нм (красный).

После инкубации с LysoTracker клетки трижды тщательно промывали PBS и добавляли 2 мл свежего DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P/S. Пластину перенесли в микроскоп, и одна капля иммерсионного масла была нанесена на масляный иммерсионный объектив 63x/1.40 NA. Затем интенсивность лазера и уровни фона были скорректированы для оптимизации условий визуализации, как описано на шаге 5.5. протокола. Наши первоначальные изображения подтвердили наличие стабильных точек лизотрекера и меченного флуоресцеином декстрана, указывающих на интактные лизосомы (рис. 3). Исходные изображения были получены до T/S/Z и использованы в качестве контрольных. Транспортное средство не было применено.

После установления исходных настроек визуализации и микроскопии планшет возвращали в колпак ламинарного потока и добавляли 1 мл DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P/S, содержащего 100 нг/мл TNF-α (T), 500 нМ SMAC mimetic (S) и 100 μM Z-VAD-FMK (Z). Визуализация продолжалась на конфокальном микроскопе с использованием параметра получения изображения, описанного в шаге 6 протокола. Как показано на рисунке 3, дополнительном фильме S1 и дополнительном фильме S2, прогрессирующее снижение флуоресценции LysoTracker в клетках, обработанных T/S/Z, служило ранним индикатором лизосомальных изменений. Эта потеря сопровождалась и иногда происходила одновременно с оттоком меченного флуоресцеином декстрана из лизосом в цитозоль (точечно-диффузный сдвиг), что указывает на LMP. Через 8 ч почти весь сигнал лизотрекера исчез, однако многие клетки все еще сохраняли зеленые точки с цитозольным зеленым сигналом, что позволяет предположить, что потеря лизосомального градиента pH предшествует полному LMP и высвобождению груза.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схематическое изображение протокола эксперимента. (Создано в BioRender.com) Первоначально 5 000 клеток были покрыты (0 ч) и инкубированы в течение 24 ч; После этого добавляли гранулы декстрана (25 г/мл) и инкубировали еще 24 ч. Через 48 ч добавляли LysoTracker (1 мкМ) и инкубировали в течение 2 ч. Клетки трижды промывали PBS (шаг 1) с последующим добавлением 2 мл свежего DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P/S (шаг 2). Настройки микроскопии корректировались (шаг 3), и клетки обрабатывали TNF-α (T), миметиком SMAC (S) и ингибитором панкаспазы Z-VAD-FMZ (Z) (шаг 4) перед получением изображений живых клеток (шаг 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Схема настройки камеры визуализации. (A) Держатель образца, (B) газовая инкубационная камера и (C) верхняя крышка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Репрезентативные изображения клеток HT29 до и после лечения T/S/Z. Клетки окрашивали красными бусинами Lysotracker и зелеными шариками Dextan и обрабатывали TNF-α (T), SMAC миметиком (S) и ингибитором пан-каспазы Z-VAD-FMZ (Z). Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный фильм S1: Покадровая съемка клеток HT29, инкубированных с зелеными шариками декстрана и обработанных T/S/Z. Клетки контролировали в течение более 6 часов для оценки клеточного ответа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Дополнительный фильм S2: Покадровая съемка клеток HT29, инкубированных с красным LysoTracker и обработанных T/S/Z. Клетки контролировали в течение более 6 часов для оценки клеточного ответа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол продемонстрировал, что комбинация LysoTracker и меченых флуоресцеином шариков декстрана позволяет одновременно контролировать рН лизосомы и высвобождение груза в режиме реального времени. Репрезентативные результаты (Рисунок 3, Дополнительный фильм S1 и Дополнительный фильм S2) подтверждают, что необработанные клетки поддерживают стабильный сигнал puncta для обоих маркеров. Напротив, лечение T/S/Z указывает на прогрессирующую потерю интенсивности лизотрекера и смещение декстрана от точки к диффузному цитозольному распределению, что согласуется с LMP.

Важным первым шагом в этом протоколе является выбор ячеек для получения изображений. Наши предыдущие данные показывают, что лечение T/S/Z вызывает гибель примерно 80% клеток HT-29 в течение 24 ч, а остальные 20% выживают19 часов. Поскольку LMP отсутствует в начале эксперимента, клетки первоначально выбираются на основе морфологии и их двойного положительного сигнала как для LysoTracker, так и для гранул Dexcan. Хотя этот метод не может предсказать, какие конкретно клетки будут подвергаться ПМЖ, мы постоянно наблюдали, что примерно у 60% наблюдаемой популяции в конечном итоге проявляется ПМР в течение 8-часового периода визуализации. Еще одна проблема связана с неотъемлемым свойством последовательной визуализации. Небольшой дрейф Z-положения клетки, который происходит во время получения изображения каждые 3 минуты, препятствует непрерывному отслеживанию одного и того же сигнала пунктира на протяжении всего эксперимента. Кроме того, клетки мигрируют и претерпевают морфологические изменения в ответ на T/S/Z-лечение28. Следовательно, невозможно проследить динамику отдельных лизосом на протяжении всего периода визуализации. При долгосрочной визуализации живых клеток потенциальный вклад фототоксичности в медиатор клеточной смерти является важным фактором. Непрерывное возбуждение во время длительных сеансов может генерировать активные формы кислорода и ухудшать жизнеспособностьклеток29, потенциально препятствуя подлинной реакции на некроптозу. Чтобы свести к минимуму этот эффект, мы применили малую мощность лазера и короткое время экспозиции. Кроме того, для ускорения процесса гибели клеток вводили пятикратную концентрацию T/S/Z. Тем не менее, мы не можем полностью исключить вклад стресса, вызванного светом, в наблюдаемые лизосомальные изменения.

Важным преимуществом этого протокола визуализации живых клеток является его способность контролировать изменение лизосомального pH и LMP в режиме реального времени, фиксируя динамические события, которые пропускаются при анализе конечных точек, таком как ПЭМ, проточная цитометрия и иммуноокрашивание. Несмотря на то, что ПЭМ обеспечивает структурное понимание с высоким разрешением, он не может охватить временную прогрессию ПМП. Альтернативные методы обработки живых клеток, такие как анализы на релокацию акридинового апельсина30 или образование галектин-точек31, также являются ценными инструментами для мониторинга лизосомальной целостности, но каждый из них имеет ограничения при использовании в изоляции. Анализ на акридиновый апельсин сообщает о перераспределении красителя от кислых органелл к цитозолю, на которое влияют как лизосомальные изменения pH, так и мембранная пермеабилизация, и, следовательно, не коррелирует напрямую с высвобождением груза. Аналогичным образом, образование галектин-точек отражает воздействие люминальных гликанов на цитозоль и, таким образом, отмечает повреждение лизосомальной мембраны31,32, но не делает различий между частичной пермеабилизацией и полным лизосомальным разрывом.

Основное преимущество этого протокола заключается в сочетании LysoTracker и шариков декстрана, что позволяет одновременно исследовать лизосомальное закисление и утечку груза. Это обеспечивает уникальное двойное считывание как лизосомальной функциональности, так и структурной целостности. Затухание LysoTracker действует как индикатор изменения лизосомального pH, в то время как высвобождение декстрана напрямую сообщает о физической утечке лизосомального содержимого. Используя эти два маркера вместе, мы значительно улучшаем обнаружение как частичных, так и полных LMP. Таким образом, эта стратегия визуализации живых клеток широко применима. Исследователи могут адаптировать его для использования с другими типами клеток и различными флуоресцентными зондами для изучения лизосомальной целостности в различных экспериментальных условиях, включая фармакологические или генетические возмущения. Эта возможность является ключом к углублению нашего понимания механизмов некроптоза и выявлению потенциальных терапевтических вмешательств.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования в лаборатории доктора Чжигао Вана поддерживаются грантами NIH R35GM158455 и R01GM147474.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ячейки HT-29ATCCHTB-38Клетки рака толстой кишки
Чаша с стеклянным дном 35 ммКорпорация MatTekP35G-1.5-14-C-GRD
CO2-инкубаторPHCBIMCO-170AICUVL
Конфокальный микроскопLeicaSP8WLL
Декстран-зелёные бусиныThermoFisherD1820Декстран, флуоресцеин, 10 000 МВт, анионный, лизин, фиксируемый
Модифицированный Eagle Medium (DMEM) от DulbeccoCorning 10-013-CV
Сыворотка для плода быка (FBS)Cytiva SH30910.03
LysoTracker Red DND-99ИнвитрогенL7528
Тип HF с масляным погружениемНауки об электронной микроскопии16915-01
Пенициллин и стрептомицин (P/S) Сигма-ОлдричP4333
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Корнинг21-040-CV
Миметика Smac (S)BV6, ApexBio, КаталогB4653Итоговая концентрация — 1 мМ
The Brick Услуги по визуализации жизни13685Контроллер CO2 газового миксера
КубУслуги по визуализации жизниCBO2AТемпературный контроль Камерные микроскопы
Фактор некроза опухоли альфа (TNF-и альфа; - T)Peprotech30001A100UGИтоговая концентрация — 20 нг/мл
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902Итоговая концентрация — 20 мМ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. Necroptosis in development and diseases. Genes Dev. 32, 327-340 (2018).
  2. Kang, K., Park, C., Chan, F. K. Necroptosis at a glance. J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).
  3. Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell. 84, 170-179 (2024).
  4. Zhang, D. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325, 332-336 (2009).
  5. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  6. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  7. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  8. Zhao, J., et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).
  9. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).
  10. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).
  11. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).
  12. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).
  13. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).
  14. Aits, S., Jaattela, M. Lysosomal cell death at a glance. J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).
  15. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).
  16. Alu, A., et al. The role of lysosome in regulated necrosis. Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).
  17. Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).
  18. Vanden Berghe, T., et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).
  19. Liu, S., et al. MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis. Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).
  20. Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).
  21. Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).
  22. Barral, D. C., et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 23, 238-269 (2022).
  23. Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines. STAR Protoc. 5, 103309(2024).
  24. Ferrari, V., et al. Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases. Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).
  25. Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions. Biomedicines. 13, (2025).
  26. Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).
  27. Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).
  28. Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).
  29. Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity. J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).
  30. Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange. Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).
  31. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).
  32. Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes. Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LysoTracker

Похожие статьи