Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экспериментальные подходы к биохимическому анализу глиального фибриллярного кислого белка и его вариантов, связанных с болезнью

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69523

⸱

28 ноября 2025 г.

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании изложены экспериментальные методы биохимической характеристики GFAP и его мутаций, вызывающих болезни, с акцентом на сборку, агрегацию и посттрансляционную модификацию филамента. Были проанализированы белки высокой чистоты GFAP, что позволило понять механизмы болезни Александера, которые могут служить основой для изучения потенциальных терапевтических целей и понимания мутаций GFAP и связанных с ними заболеваний.

Аннотация

Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) — ключевой промежуточный филаментный белок, критически важный для поддержания структурной целостности и функции астроцитов в центральной нервной системе. Мутации в GFAP являются коренной причиной болезни Александера (AxD) — редкого и часто смертельного нейродегенеративного заболевания, характеризующегося повышением уровня GFAP и накоплением GFAP в виде волокон Розенталя. Здесь мы описываем комплексный набор экспериментальных подходов к биохимической характеристике GFAP и его болезнетворных вариантов. Используя оптимизированную экспрессию и передовые методы очистки, мы достигли высокого выхода и чистоты как диких типов, так и мутантных белков GFAP. Биохимические анализы применялись для оценки влияния патогенных мутаций на сборку нити, растворимость и агрегацию. Кроме того, мы изучили роль аномальных посттрансляционных модификаций в агрегации GFAP и их влияние на свойства филамента. Эта работа углубляет наше понимание роли GFAP в AxD и закладывает основу для разработки терапевтических стратегий, направленных на дисфункцию GFAP. Кроме того, представленные здесь методологии служат ценными инструментами для изучения биохимических последствий мутаций GFAP и продвижения вмешательств при расстройствах, связанных с GFAP.

Введение

Болезнь Александера (AxD) — это генетическое заболевание, возникающее из-за доминантных мутаций в гене, кодирующем глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP)1, белок промежуточного филамента типа III, преимущественно встречающийся в зрелых астроцитах. AxD характеризуется арегуляциейGFAP 2, реактивным астроглиозом3 и накоплением волокон Розенталя, которые являются белковыми включениями, состоящими преимущественно из GFAP вместе с сопутствующими белками, такими как αB-кристаллин-4 и убиквитин-5. Мутации в гене GFAP нарушают нормальную сборкуфиламента 6, что приводит к аномальной агрегации, индукции клеточных стрессовыхответов 7 и дальнейшей дестабилизации из-за аномальных посттрансляционных модификаций (PTM), таких какфосфорилирование 8, окисление9 и убиквитинация10.

Несмотря на центральную роль GFAP в патологии AxD, молекулярные механизмы, с помощью которых мутантный GFAP нарушает сборку филамента, способствует агрегации и вызывает клеточный стресс, остаются слабо изучены. Этот разрыв в знаниях затрудняет разработку таргетных терапий для борьбы с агрегацией GFAP и токсичностью. Изучение биохимических свойств GFAP и его вариантов, связанных с AxD, имеет решающее значение для выявления молекулярных механизмов, лежащих в основе прогрессирования заболевания. Однако свойство GFAP, склонное к агрегации, и его изменённое поведение при сборке у вариантов, связанных с болезнью, представляют уникальные вызовы для экспериментального анализа. Контролируемые биохимические исследования требуют очищенного GFAP, полученного либо на животных моделях, либо через рекомбинантную экспрессию, для изучения влияния мутаций AxD на сборку, агрегацию и патологические модификации нити.

Экспериментальные подходы, представленные в этом исследовании, предлагают несколько преимуществ по сравнению с альтернативными методами. Например, хотя клеточныемодели 11 и иммуногистохимическиеисследования 12 дают ценные данные о экспрессии и локализации GFAP, они часто не отражают точные биохимические механизмы сборки и агрегации филаментов из-за сложности клеточной среды. В отличие от этого, описанные здесь методы, такие как in vitro анализы сборки филамента, анализ осадконакопления и характеристика PTM, позволяют контролируемо изучать внутренние биохимические свойства GFAP и его болезненных вариантов. Эти подходы позволяют исследователям разбирать поведение сборки и агрегации филаментов в упрощённой системе, облегчая выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе дисфункции GFAP. Предыдущие исследования показали полезность таких биохимических методов для анализа IF-белков, включаядесмин-13 икератины 14, что подчёркивает их применимость в исследованиях GFAP.

Кроме того, эта рукопись содержит информацию, которая помогает читателям определить, подходят ли описанные методы для их конкретных применений. Исследователи, заинтересованные в изучении биохимических свойств GFAP, его поведения при сборке (PTM), найдут эти методы особенно полезными для изучения вариантов, связанных с болезнью, и их патологических эффектов. Интегрируя эти биохимические подходы с другими экспериментальными системами, такими как клеточные исследования или животные модели, исследователи могут получить более полное понимание дисфункции GFAP при AxD и других связанных астроцитопатиях.

Общая цель этого метода — представить экспериментальные подходы к биохимическому анализу GFAP и его вариантов, связанных с AxD, включая методы очистки белков, анализы сборки филаментов in vitro , анализ осадочных веществ и характеристику PTM. Эти методы дают критическое понимание молекулярной основы дисфункции GFAP в AxD, прокладывая путь для терапевтической разработки. Кроме того, применение этих экспериментальных методов углубит наше понимание биохимии GFAP в AxD и внесёт вклад в более широкую область исследований IF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом исследовании использовались крысы модели AxD с мутацией R237Hknock-in 11. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Колледжа наук о жизни и медицины Национального университета Цинхуа (одобрение NTHU IACUC No 109088 и 111060) и в соответствии с руководящими принципами Сельскохозяйственного руководства по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Очистка рекомбинантного GFAP от бактерий (рисунок 1)

  1. Преобразование штама E. coli BL21(DE3) pLysS с вектором pET 23b, содержащим кДНК либо WT, либо мутантного GFAP.
  2. Культура бактерий в 1 л среды Лурия-Бертани с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола при 37 °C до OD600 при ~0,2.
  3. Добавьте изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG, 0,5 M) к конечной концентрации 0,5 мМ, чтобы индуцировать экспрессию GFAP при 37 °C в течение 4 часов.
  4. Собирайте бактерии центрифугированием при 6 371г в течение 30 минут при 4 °C.
  5. Лиз бактерии в 50 мл буфера TEN (20 мМ Tris-HCl, pH 8, 5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl), дополненного 0,2 мМ фненилметансульфонилфторидом (PMSF) путём гомогенизации в гомогенизаторе Dounce.
  6. Центрифуга извлекает бактериальные лизаты при 22 045x г в течение 20 минут при 4 °C, затем извлекают гранулы в буфере Triton X-100 (TEN с 1% (v/v) Triton X-100).
  7. После центрифугирования при тех же условиях извлекайте полученную гранулу в буфере с высоким содержанием соли (TEN с 1% (v/v) Triton X-100 и 1,5 млн KCl).
  8. После центрифугирования при тех же условиях промыйте гранулу буфером TEN.
  9. Растворите конечную гранулу в 10 мл буфера мочевины (8 м мочевины, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 5 мМ EDTA и 0,2 мМ PMSF), помешивая 3 часа при комнатной температуре.
  10. Центрифугная мочевина экстрактируется при 80 000x г в настольной ультрацентрифуге при 4 °C в течение 20 минут.
  11. Добавьте полиэтиленимин (1% (v/v)) к растворимой в мочевине до конечной концентрации 0,06% (v/v) и инкубировать на льду в течение 5 минут.
  12. Центрифугировать при 80 000г при 4 °C в течение 20 минут, а затем диализировать супернатантную фракцию против буфера A (6 м мочевины, 20 мМ МЭС, pH 6,0, 14,4 мМ β-меркаптоэтанол).
  13. Нагрузка диализирует на колонку ионообмена CM-сефароз, предварительно уравновешенную в буфере A в системе хроматографии NGC (NGC Chromatography).
  14. Элютные белки с линейным градиентом 0-0,5 M NaCl в буфере A за 1 час при расходе 1 мл/мин.
  15. Объедините фракции, содержащие GFAP, и диализуйте буфер B (6 млн мочевины, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 1 мМ EDTA).
  16. Загрузка диализов на колонку анионного обмена, предварительно уравновешенную в буфере B. Элютные белки с линейным градиентом 0-0,5 млн NaCl в буфере B за 1 час при расходе 1 мл/мин.
  17. Анализируйте дроби столбцов с помощью синей окрашивания SDS-PAGE и Coomassie. Собирайте содержащие очищенный GFAP и храните при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальный лизис может быть облегчен несколькими циклами заморозки и оттаивания. Конечная концентрация полиэтиленимина не должна превышать 0,06% (v/v), выше которой также осаждаются белки. При работе с опасными материалами, такими как PMSF и β-меркаптоэтанол, крайне важно включать чёткие рекомендации по безопасности и инструкции по утилизации опасных отходов. ПМСФ очень токсичен и может вызывать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Готовьте растворы PMSF, свежие в вытяжке и избегайте прямого контакта. Используйте β-меркаптоэтанол в хорошо проветриваемом помещении, так как он выделяет сильные токсичные пары.

2. Сборка in vitro и анализ осадконакопления (рисунок 2)

  1. Разбавленные очищенные WT или мутантные GFAP до 0,3 мг/мл в 6 млн мочевины в низкосолёном буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 8, 1 мМ EDTA и 14,4 мМ β-меркапетанол).
  2. Диализ образцов с низким содержанием соля, содержащим 4 М, а затем 2 М мочевины в течение 4 часов при комнатной температуре.
  3. Диализ образцов с низким содержанием соли без мочевины на ночь при 4 °C.
  4. Диализ образцов с буфером сборки (10 мМ Tris-HCl, pH 7, 50 мМ NaCl и 14,4 мМ β-меркапетанол) при комнатной температуре в течение 12-16 часов.
  5. Переложите смеси сборки на верхнюю часть сахарозной подушки, содержащей 0,2 мл сахарозы 0,85 м в буфере сборки.
  6. В высокоскоростном тесте на осадкоотделение центрифугуйте смеси при температуре 80 000x g в течение 20 минут при 20 °C с использованием настольной микро-ультрацентрифуга.
  7. Концентрируйте несобранный GFAP в супернатантной фракции, выполняя осаждение метанола/хлороформата15. Ресуспензия осаждается в 0,2 мл буфера образца Леммли (25 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 1% (w/v) натрия додецилсульфата (SDS), 12,5% (v/v) глицерила, 0,01% (w/v) бромофенол синего и 355 мМ β-меркаптоэтанола).
  8. Суспензировать собранный GFAP в фракции гранул в буфере образца Laemmli.
  9. Пропустите как супернатантные, так и гранулированные частицы на геле электрофореза с 10% (с в/в) гелем SDS полиакриламида (SDS-PAGE) и окрашивайте 10 мл синей цвета Coomassie.
  10. В низкоскоростном анализе осадконакопления центрифуга смесь при 3000x г в течение 5 минут при 20 °C с использованием настольной центрифуги.
  11. Добавьте 0,2 мл буфера образца Леммли в неагрегированные формы GFAP в супернатантной фракции.
  12. Ресуспендировать агрегированный GFAP непосредственно в фракции гранул в буфере образца Laemmli в объёме, пропорциональном супернатантной фракции.
  13. Проанализировать как супернатантные, так и гранулные фракции гелем SDS-PAGE 10% (с в/в), затем окрашивание Coomassie синим цветом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол и хлороформ — токсичные растворители, которые могут вызывать серьёзные последствия для здоровья. Избегайте контакта кожи и вдыхания. Обращайтесь аккуратно в вытяжке, чтобы предотвратить проливы.

3. Отрицательное окрашивание и электронная микроскопия (рисунок 2)

  1. Светящийся разряд медных решёток Formvar/углеродом в течение 45 секунд при 20 мА в системе очистки светящихся разрядов.
  2. Подайте сборочные смеси к сетке с светящимся разрядом и позволяйте образцам связываться с опорной пленкой в течение 60 секунд.
  3. Удалите лишнюю жидкость, протирая край сетки кусочком промокающей бумаги.
  4. Промывайте решётки дистиллированной водой, затем окрашивайте 20 мкл 1% (с в/в) уранилацетата в течение 60 секунд.
  5. Удалите лишний раствор для морилки и дайте сетке высохнуть на воздухе 30 секунд.
  6. Изучайте сетки под пропускающим электронным микроскопом H-7600 (TEM) в режиме высокого разрешения при ускоряющем напряжении 100 кВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Светящийся разряд сеток в вакуумном испарителе перед добавлением образца белка улучшает адсорбцию образца в сетку. Уранилацетат — это радиоактивное и высокотоксичное химическое вещество, широко используемое в электронной микроскопии для негативного окрашивания. Обращение с ним требует строгого соблюдения протоколов безопасности и инструкций по утилизации опасных отходов, чтобы минимизировать риски воздействия на персонал и окружающую среду. Готовьте растворы уранилацетата только в вытяжной вытяжке, чтобы предотвратить вдыхание частиц или паров.

4. Окислительная модификация (рисунок 3)

  1. Разбавить GFAP до 0,3 мг/мл в 6 м мочевины в низкосолёном буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 8, 1 мМ EDTA и 14,4 мМ β-меркапетанол) при комнатной температуре в течение 2 часа.
  2. Диализ с низкосолёным буфером с 4 М мочевины в течение 2,5 часов при комнатной температуре. Аккуратно перемешайте буфер с помощью магнитной мешители, чтобы сохранить равномерное распределение и предотвратить градиенты концентрации.
  3. Через 2,5 часа перенесите мембрану диализа в низкосолёный буфер с 2 М мочевины ещё 2,5 часа при комнатной температуре, обеспечив аккуратное перемешивание на протяжении всего процесса.
  4. Диализ с низкосолёным буфером без мочевины при 4 °C в течение 18 часов.
  5. Обработайте диализованные образцы 10 мМ Ч2O2 в течение 15 минут, затем обработайте дитиотрейтолом 10 или 100 мМ (DTT) ещё 15 минут при комнатной температуре.
  6. Проанализировать образцы белка стандартным 10% (w/v) SDS-PAGE без β-меркапетанола и окрашиваться 10 мл синей кумасси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании H2O2 обращайтесь с осторожностью, так как он является сильным окислителем и может вызвать ожоги. Носите средства индивидуальной защиты, чтобы избежать контакта с кожей и глазами. ДТТ может вызывать раздражение кожи, глаз и дыхательной системы. При работе с DTT и H2O2 крайне важно соблюдать правильные протоколы безопасности для минимизации рисков.

5. Очищение GFAP из мозга крыс AxD (рисунок 4A,B)

  1. Извлекать ткани мозга с помощью 10 мл буфера TEN (10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 100 мМ NaCl и 5 мМ EDTA) с помощью гомогенизатора Douce.
  2. Центрифугуйте гомогенацию мозга при 76 000x g при 4 °C в течение 20 минут, а затем извлеките полученную гранулу с помощью 10 мл буфера Triton X-100 (1% (v/v) Triton X-100 в буфере TEN).
  3. Центрифугировать при 76 000x g при 4 °C в течение 20 минут, а затем извлечь полученную гранулу с помощью 10 мл сахарозного буфера (0,85 м сахарозы и 0,5% (v/v) Triton X-100 в буфере TEN).
  4. Центрифугуйте при 76 000г при 4 °C в течение 20 минут, затем извлекайте полученную гранулу с помощью 10 мл буфера с высоким содержанием соли (1,5 млн кКл и 0,5% (в/в) Triton X-100 в буфере TEN).
  5. Центрифугировать при 76 000г при 4 °C в течение 20 минут, а затем извлечь финальную гранулу с помощью 10 мл буфера мочевины (8 м мочевины, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4 и 5 мМ EDTA).
  6. Собрать супернатантную фракцию и провести диализ против буфера колонки Q (6 м мочевины, 10 мМ трис-HCl, pH 8, 5 мМ ЭДТА и 14,4 мМ β-меркаптоэтанола).
  7. Загрузите диализы на колонку анионного обмена в системе хроматографии NGC (NGC Chromatography).
  8. Элюируйте связанный белок с линейным градиентом 0-0,5 млн NaCl в Q-буфере при расходе 1 мл/мин.
  9. Пул GFAP-содержащая фракцию и диализ с буфером S-колонки (6 млн мочевины, 20 мМ МЭС, pH 6 и 14,4 мМ β-меркаптоэтанола).
  10. Применить диализаты к катионообменной колонне, а затем элюировать связанные белки линейным градиентом 0-1 M NaCl в S-буфере при расходе 1 мл/мин.
  11. Анализируйте элюированные фракции с помощью синей окрашивания SDS-PAGE и Coomassie и собирайте те, содержащие очищенный GFAP.

6. Анализ убиквитинации GFAP с помощью иммуноблоттинга (рисунок 4C)

  1. Проведите очищенный GFAP на 10% (с гелем SDS-PAGE).
  2. Переносите белки из геля в нитроцеллюлозную мембрану.
  3. Заблокировать мембрану, инкубировав её 10 мл 3% (w/v) бычьей сыворотки альбумина в трисбуферном физиологическом растворе (TBS: 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl), содержащем 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Инкубировать мембрану 5 мкл анти-GFAP и 5 мкл первичных антител к убиквитину, разбавленных в 5 мл TBST при 4 °C за ночь. Промой мембрану три раза с помощью TBST.
  5. Инкубировать мембрану 5 мкл вторичных антител, конъюгированных флуоресцентными красителями, разбавленных 5 мл TBST, при комнатной температуре не менее 1 часа. Промой мембрану три раза с помощью TBST.
  6. Получайте изображения с помощью системы обнаружения флуоресцентных изображений.
  7. Проанализируйте in vitro сборку нативного GFAP с помощью TEM и осадочных анализов (рисунок 5), используя ту же процедуру, что описана в шагах 2.1–2.13 и 3.1–3.6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы изучить, как мутации, вызывающие AxD, влияют на свойства сборки GFAP, мы получили рекомбинантные белки в бактериях с помощью системы экспрессии на основе ПЭТ. Мы подробно описываем протоколы экспрессирования и очистки GFAP, используя WT GFAP в качестве примера. После индукции IPTG (рисунок 1A, полоса 2) GFAP был очищен с помощью трёхэтапного процесса, включающего подготовку тела включения (рисунок 1B) и ионообменную хроматографию с колонкой CM (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол устанавливает комплексную экспериментальную основу для биохимической характеристики GFAP и его мутантов, связанных с болезнями. Обеспечивая надёжный и стандартизированный подход, этот метод является ценным ресурсом, который углубляет наше понимание биологической роли GFAP и его патологических последствий, особенно в контексте AxD. В этом разделе мы обсуждаем несколько ключевых аспектов протокола, включая возможные модификации и стратегии устранения неполадок, ограничения ме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Трейси Хагеманн (Waisman Center, Университет Висконсина-Мэдисон) за предоставление крыс R237H, которые выбиваются из них. Предложения и поддержка профессора Олби Мессинга (Центр Вайсмана, Университет Висконсин-Мэдисон) по этому исследованию очень ценны. Эта работа была поддержана грантами Министерства науки и технологий (111-2320-B-007-008 и 112-2320-B-007-006 N.-H.L. и M.-D.P.). Мы также благодарим BioTEM Национального университета Цинхуа (MOST-104-2731-M-007-002) за использование оборудования в этом исследовании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
30% акриламид/раствор Bis 37,5:1Biorad1610158
Персульфат аммония (APS)Biorad1610700
АмпициллинUSB11259
антитела к GFAPТехнология клеточной сигнализации12389
Антиубиквитин антителаМиллипорST 1200Клон FK2
Центрифуга Avanti J-26S XPБекман
ХлорамфениколUSB23660
CM-SephroseЦитива1707 1901
Coomassie Blue DyreUSB32826
Медная сеткаТед Пелла01753-F
CS 150 NX Micro ультрацентрфугаHitachiNA
Гомогенизатор DounceУитон
DTTURDTT
E. coli BL21(DE3) штамм pLysSAgilent
EasiGlowТед Пелла
Реагент ECLПеркинЭлмерНЕЛ 105001
EDTAUSB15699
H2O2Сигма-Олдрич18312
Колонка HiRes SЦитива2927 5877
Колонка HiTrap QЦитива1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB средний (LB Agar)USB75851
LB среднего (LB бульон)BD Difco244620
МеркаптоэтанолСигма-ОлдричM3148
MESСигма-ОлдричM8250
NaClHoneywell31434S
Хроматографическая система NGCBioRad
Ультрацентрифуга Optima XE-90Бекман
PMSFACROS ORGANICS215740050
полиэтиленейминСигма-ОлдричP3143
РоторБекман
Ротор S55SHitachi
Ротор S80AT3Hitachi
SDSUSB75819
SDS-PAGEBiorad
StarBright Blue 520 козла против мышей IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 козла против кроликов IgG BioRad12004161
СахарозаСигма-ОлдричS5391
TEMEDUSB76320
Пропускной электронный микроскоп H-7700)HitachiNA
ТрисUSB75825
Triton X-100Сигма-ОлдричT9284
УранилацетатЭлектронные микроскопические науки 22400
МочевинаHoneywell15604H

Ссылки

  1. Brenner, M., et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 27 (1), 117-120 (2001).
  2. Hagemann, T. L., et al. Gene expression analysis in mice with elevated glial fibrillary acidic protein and Rosenthal fibers reveals a stress response followed by glial activation and neuronal dysfunction. Hum Mol Genet. 14 (16), 2443-2458 (2005).
  3. Hagemann, T. L. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 72, 140-147 (2022).
  4. Iwaki, T., et al. Alpha B-crystallin and 27-kd heat shock protein are regulated by stress conditions in the central nervous system and accumulate in Rosenthal fibers. Am J Pathol. 143 (2), 487-495 (1993).
  5. Goldman, J. E., Corbin, E. Rosenthal fibers contain ubiquitinated alpha B-crystallin. Am J Pathol. 139 (4), 933-938 (1991).
  6. Yang, A. W., Lin, N. H., Yeh, T. H., Snider, N., Perng, M. D. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 33 (8), ar69(2022).
  7. Chen, Y. S., Lim, S. C., Chen, M. H., Quinlan, R. A., Perng, M. D. Alexander disease-causing mutations in the C-terminal domain of GFAP are deleterious both to assembly and network formation with the potential to both activate caspase 3 and decrease cell viability. Exp Cell Res. 317 (16), 2252-2266 (2011).
  8. Battaglia, R. A., et al. Site-specific phosphorylation and caspase cleavage of GFAP are new markers of Alexander disease severity. Elife. 8, e47789(2019).
  9. Viedma-Poyatos, A., Gonzalez-Jimenez, P., Pajares, M. A., Perez-Sala, D. Alexander disease GFAP R239C mutant shows increased susceptibility to lipoxidation and elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Redox Biol. 55, 102415(2022).
  10. Lin, N. H., Jian, W. S., Snider, N., Perng, M. D. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 300 (7), 107402(2024).
  11. Kondo, T., et al. Modeling Alexander disease with patient iPSCs reveals cellular and molecular pathology of astrocytes. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 69(2016).
  12. Hagemann, T. L., et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 13 (620), eabg4711(2021).
  13. Bar, H., et al. Severe muscle disease-causing desmin mutations interfere with in vitro filament assembly at distinct stages. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15099-15104 (2005).
  14. Gu, L. H., Coulombe, P. A. Defining the properties of the nonhelical tail domain in type II keratin 5: insight from a bullous disease-causing mutation. Mol Biol Cell. 16 (3), 1427-1438 (2005).
  15. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138 (1), 141-143 (1984).
  16. Ralton, J. E., Lu, X., Hutcheson, A. M., Quinlan, R. A. Identification of two N-terminal non-alpha-helical domain motifs important in the assembly of glial fibrillary acidic protein. J Cell Sci. 107 (Pt 7), 1935-1948 (1994).
  17. Nagai, K., Thogersen, H. C. Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987).
  18. Vorgias, C. E., Traub, P. Isolation of glial fibrillary acidic protein from bovine brain white matter and its purification by affinity chromatography on single-stranded DNA-cellulose. Biochem Biophys Res Commun. 115 (1), 68-75 (1983).
  19. Vorgias, C. E., Traub, P. Nucleic acid-binding activities of the intermediate filament subunit proteins desmin and glial fibrillary acidic protein. Z Naturforsch C J Biosci. 41 (9-10), 897-909 (1986).
  20. Lin, N. H., Jian, W. S., Perng, M. D. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 26 (5), 1913(2025).
  21. Herrmann, H., Kreplak, L., Aebi, U. Isolation, characterization, and in vitro assembly of intermediate filaments. Methods Cell Biol. 78, 3-24 (2004).
  22. Kim, B., Kim, S., Jin, M. S. Crystal structure of the human glial fibrillary acidic protein 1B domain. Biochem Biophys Res Commun. 506, 2899-2905 (2018).
  23. Lin, N. H., Messing, A., Perng, M. D. Characterization of a panel of monoclonal antibodies recognizing specific epitopes on GFAP. PLoS One. 12 (7), e0180694(2017).
  24. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  25. Jing, R., et al. Synemin is expressed in reactive astrocytes in neurotrauma and interacts differentially with vimentin and GFAP intermediate filament networks. J Cell Sci. 120 (Pt 7), 1267-1277 (2007).
  26. Thomsen, R., Pallesen, J., Daugaard, T. F., Borglum, A. D., Nielsen, A. L. Genome-wide assessment of mRNA in astrocyte protrusions by direct RNA sequencing reveals mRNA localization for the intermediate filament protein nestin. Glia. 61 (11), 1922-1937 (2013).
  27. Perng, M. D., et al. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci. 112 (Pt 13), 2099-2112 (1999).
  28. Tian, R., Gregor, M., Wiche, G., Goldman, J. E. Plectin regulates the organization of glial fibrillary acidic protein in Alexander disease. Am J Pathol. 168 (3), 888-897 (2006).
  29. Lin, N. H., Yang, A. W., Chang, C. H., Perng, M. D. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 35 (5), e21614(2021).
  30. Hagemann, T. L., Connor, J. X., Messing, A. Alexander disease-associated GFAP mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 26 (43), 11162-11173 (2006).
  31. Eng, L. F. The glial fibrillary acidic protein: the major protein constituent of glial filaments. Scand J Immunol Suppl. 9, 41-51 (1982).
  32. Yen, S. H., Dahl, D., Schachner, M., Shelanski, M. L. Biochemistry of the filaments of brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (2), 529-533 (1976).
  33. Goldman, J. E., Schaumburg, H. H., Norton, W. T. Isolation and characterization of glial filaments from human brain. J Cell Biol. 78 (2), 426-440 (1978).
  34. Tsukita, S., Ishikawa, H., Kurokawa, M. Isolation of 10-nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. J Cell Biol. 88 (1), 245-250 (1981).
  35. Rasmussen, S., Sensenbrenner, M., Devilliers, G., Schousboe, A., Bock, E. Isolation of intermediate filaments from rat astrocytes in culture. Neurosci Lett. 25 (2), 119-124 (1981).
  36. Yang, Z. W., Babitch, J. A. Factors modulating filament formation by bovine glial fibrillary acidic protein, the intermediate filament component of astroglial cells. Biochemistry. 27 (18), 7038-7045 (1988).
  37. Liem, R. K., Hutchison, S. B. Purification of individual components of the neurofilament triplet: filament assembly from the 70 000-dalton subunit. Biochemistry. 21 (13), 3221-3226 (1982).
  38. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain: demonstration of multiple related polypeptides. Biochim Biophys Acta. 386 (1), 41-51 (1975).
  39. Fukuyama, R., Fushiki, S., Fujita, S. Purification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) from normal bovine brain. J Neurosci Methods. 40 (2-3), 133-137 (1991).
  40. Dahl, D., Crosby, C. J., Gardner, E. E., Bignami, A. Purification of the glial fibrillary acidic protein by anion-exchange chromatography. Anal Biochem. 126 (1), 165-169 (1982).
  41. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain: purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  42. Perng, M., et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 79 (2), 197-213 (2006).
  43. Hsiao, V. C., et al. Alexander-disease mutation of GFAP causes filament disorganization and decreased solubility of GFAP. J Cell Sci. 118 (Pt 9), 2057-2065 (2005).
  44. Rueger, D. C., Dahl, D., Bignami, A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. Anal Biochem. 89 (2), 360-371 (1978).
  45. Bignami, A., Dahl, D. Isolation of GFA protein from normal brain-a comment. J Histochem Cytochem. 27 (2), 693-696 (1979).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GFAPSDS PAGE
Экспериментальные подходы к биохимическому анализу глиального фибриллярного кислого белка и его вариантов, связанных с болезнью
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.