Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Влияние рецепта И-Нао-Цзе-Ю на постинсультную депрессию у крыс с использованием окклюзии средней церебральной артерии в сочетании с поведенческим ограничением

425 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69537

⸱

9 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3Capital Medical University Yanjing College, 4School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 5Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает создание модели постинсультной депрессии (PSD) у крыс путём сочетания окклюзии средней церебральной артерии (MCAO) с хроническим лёгким стрессом, сдержанностью поведения и изоляционным содержанием, а также оценку терапевтических эффектов назначения Йи-нао-цзе-ю (YNJYP) с помощью поведенческих тестов.

Аннотация

Постинсультная депрессия (PSD) — это распространённое и поддающееся лечению осложнение инсульта, характеризующееся депрессивными и соматическими симптомами, которые затрудняют восстановление пациентов и качество жизни. В данном исследовании описывается протокол, сочетающий окклюзию средней церебральной артерии (MCAO) с поведенческим сдерживанием и изоляционным содержанием для создания модели PSD у крыс, а также оценивается терапевтический эффект рецепта Yi-nao-jie-yu (YNJYP) на нейрогенез взрослых у крыс с PSD. Для установления моделей крысы в группах инсульта, PSD, флуоксетинового гидрохлорида (FXT) и YNJYP проходили MCAO: монофиламентный шов был продвинут от внутренней сонной артерии к средней церебральной артерии (MCA) на 2 часа ишемии, после чего следовал реперфузия. С 7-го дня после MCAO крысы в группах PSD, FXT и YNJYP содержались в одном доме и удерживались на специальной Т-образной платформе по 2 часа в день в течение 7 дней. Поведенческие оценки включали тест на принудительное плавание (FST, для отчаяния), тест на потребление сахарозы (SCT, для ангедонии) и тест на открытом поле (OFT, для исследовательского поведения). Через 4 и 8 недель после инсульта у крыс PSD было более длительное время неподвижности при FST и меньшее предпочтение сахарозы в SCT по сравнению с инсультными крысами (P < 0,01). YNJYP обратил эти депрессивно-подобные поведения (P < 0,01), с эффективностью, сопоставимой с FXT. Этот протокол подтверждает достоверность модели PSD и терапевтический потенциал YNJYP, подкреплённый тщательными экспериментами и анализом данных.

Введение

Постинсультная депрессия (PSD) — это распространённое и подлежащее лечению осложнение инсульта, которое значительно влияет на процесс реабилитации и качество жизни пациентов. Пациенты с PSD страдают не только от физических функциональных нарушений, но и с психическими нарушениями, такими как пониженное настроение и потеря интереса. Это значительно затрудняет восстановление неврологических функций и даже увеличивает уровень смертности. В настоящее время патогенез ПСР сложен и включает множество аспектов, таких как нейробиология, дисбаланс нейромедиаторов и воспалительный ответ. Существует острая необходимость глубоко изучить эффективные методы вмешательства.

Общая цель этого метода — создать надёжную и воспроизводимую модель PSD у крыс, которая бы близко имитировала человеческое состояние, сочетая окклюзию средней церебральной артерии (MCAO) с хроническим лёгким стрессом (CMS, в первую очередь поведенческое ограничение) и изоляционным содержанием, а также использовать эту модель для оценки потенциальных терапевтических средств, таких как Yi-nao-jie-yu Prescription (YNJYP). Обоснование разработки этого метода заключается в необходимости интеграции как первоначального ишемического повреждения, так и последующего хронического психологического стресса, которые считаются ключевыми компонентами патогенеза ПСР, в единую стандартизированнуюмодель 1,2,3. По сравнению с альтернативными методами, такими как те, что полностью опираются на обширные парадигмы CUMS, этот протокол предлагает более сфокусированный и воспроизводимый подход, применяя специфическую форму поведенческого сдержанности, предназначенную для имитации ограничений подвижности, часто встречающегося у пациентов с инсультом 3,4,5.

Эта модель вносит вклад в более широкую литературу по ПСД, предоставляя подробную практическую основу для индуцирования и оценки ПСР у грызунов, что удовлетворяет необходимость стандартизации в доклинических исследованиях. Исследователи, заинтересованные в изучении комбинированных патофизиологических эффектов церебральной ишемии и стресса после инсульта, либо в скрининге новых вмешательств при ПСР, могут найти этот протокол уместным, поскольку он четко определяет процедуры создания модели, применения стресса и оценки поведения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол исследования на животных был утверждён Комитетом по уходу за животными и использованию Пекинского университета китайской медицины. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка

  1. Получить 216 самцов крыс рода Sprague-Dawley (SD) без специфических патогенов (SPF) весом 300-320 г.
  2. Привыкните крыс к жилищной среде на неделю до эксперимента.
    1. Поддерживайте условия проживания на 23 ± 3 °C, влажности 45% ± 5% и 12-часовой цикл света и темноты (свет включается в 8:00, выключается в 20:00).
    2. Держите по пять крыс в каждой клетке с иммиграционным доступом к стерильному стандартному корму и воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать количество используемых животных и уменьшить страдания с помощью мягкого обращения и оптимизированных процедур (например, регулируемых ремней для предотвращения подавления дыхания).

2. Операция по окклюзии средней церебральной артерии (MCAO)

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается установление модели MCAO/реперфузии (MCAO/R), модифицированной по Бедерсону и др. 6.

  1. Подготовьте крыс к операции.
    1. Постите крыс ночью (12 часов) перед операцией (без ограничения воды).
    2. Анестезия крыс с помощью внутрибрюшнической инъекции пентобарбитала 1% натрия (50 мг/кг).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные анальгетики не применялись, так как пентобарбитал натрия использовался исключительно как анестетик.
      ВНИМАНИЕ: Пентобарбитал натрия — контролируемый анестетик. Держите в вытяжном контейнере, носите перчатки и очки, храните в запертом шкафу согласно институциональным нормам.
  2. Закрепите и подготовьте место операции.
    1. Поместите наркозированных крыс в положение на спине и закрепите их конечности.
    2. Сбрийте шерсть на шее и продезинфицируйте кожу соответствующим дезинфицирующим средством (например, 75% этанолом).
  3. Обнажите и подготовьте сосуды шеи.
    1. Сделайте разрез по центральной линии 2-3 см на коже шеи, затем тупо вскрыть подкожные железы и фасцию. Отдельте общую сонную артерию (ККА), внутреннюю сонную артерию (ИКА) и внешнюю сонную артерию (ЭКА), которые образуются ветвями ККК.
    2. Найдите CCA, положите под него два шва в резерв, один перевяжите у сердечного конца и завяжите живой узел рядом с разделением CCA с другим.
    3. Используйте артериальный зажим, чтобы закрыть дистальный конец CCA возле бифуркации.
    4. Найдите ЭКА и перевяжите его швом.
  4. Введите шов, чтобы закрыть MCA.
    1. Аккуратно вырежьте разрез на стенке между местом перевязки проксимального конца CCA и зажимом артериального клипса, затем введите в этот разрез специальный резьбовой пробку (монофиламентный шов).
    2. Откройте артериальный клипс и вставьте пробку резьбы в ICA от вилки, пока не почувствуете небольшое сопротивление, затем остановитесь (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина шва (18 мм ± 2 мм) критически важна для стабильной окклюзии MCA; Немного отрегулируйте в зависимости от веса крысы (300-320 г).
  5. Вызвать ишемию и реперфузию.
    1. Поддерживайте ишемию в течение 2 часов (строго фиксируйте секундомером).
    2. Через 2 часа аккуратно вытащите шов, чтобы восстановить кровоток MCA, срежьте лишний шов и снимите артериальный клипс.
  6. Закройте место операции и следите за восстановлением.
    1. Промыйте разрез стерильным физиологическим раствором, затем зашвите подкожную ткань и кожу.
    2. Поместите крыс в клетку для восстановления (поддерживайте при температуре 25 ± 1 °C), пока они не придут в сознание; Следите за кровотечением или стрессом в течение 24 часов.
  7. Создайте фиктивную оперативную группу.
    1. Проведите ту же диссекцию шеи и экспозицию сосудов, что и в шагах 2.1–2.3.
    2. Введите шов в CCA всего на 5 мм, затем немедленно его удалите; Наложите швы на разрез без окклюзии MCA.

3. Группировка животных

  1. Случайным образом разделите крыс на шесть групп (первоначально n = 36 на группу) для неврологического оценки.
    1. Группа инсульта: только MCAO, без поведенческих ограничений или лечения лекарствами.
    2. Группа PSD: MCAO + поведенческое ограничение + изоляция, без медикаментозного лечения.
    3. Группа FXT: MCAO + поведенческое сдержанное средство + изоляционное помещение + гидрохлоридная флуоксетина.
    4. Группа YNJYP: MCAO + поведенческое ограничение + изоляционное жильё + рецепт Yi-nao-jie-yu (YNJYP).
    5. Пустая группа: операция не проводилась.
    6. Фиктивная операционная группа: нет закупорки средней мозговой артерии.
  2. Исключайте крыс с баллом 0 или 4 или тех, кто умер после операции.
    1. Проведите нейрологическую оценкуLonga 7 через 24 часа после MCAO для отбора квалифицированных крыс.
    2. Используйте 5-балльную шкалу Лонги: 0 = отсутствие дефицита; 1 = сгибание передней конечности при подъёме хвостом; 2 = круговое движение к паретической стороне; 3 = падающая в сторону паретической стороны; 4 = потеря сознания или неспособность ходить.

4. Введение гидрохлорида флуоксетина (FXT) и YNJYP

  1. Подготовьте YNJYP и FXT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: YNJYP содержит шесть китайских лекарственных веществ: циуцззя (корни Acanthopanax senticosus ) 30 г, юцзинь (корневища Curcuma longa ) 10 г, увэйцзы (плоды Schisandra chinensis ) 15 г, чиззи (плоды Gardenia jasminoides ) 10 г, даньшэнь (корни Salvia miltiorrhiza ) 15 г и чуаньсюн (Ligusticum chuanxiong ) корневища) 15 г (предоставлено кафедрой фармации Третьей аффилированной больницы Пекинского университета китайской медицины). Согласно предыдущимисследованиям 8, доза внутрижелудочного введения составляла 9,92 г/(кг·д).
    1. Растворите капсулы с гидрохлоридом флуоксетина в дистиллированной воде для достижения концентрации 0,233 г/л при использовании. Исходя из дозировки для взрослых, умноженной на семь, установите дозировку для крыс на уровне 2,33 мг/(кг·д).
  2. Вводите лекарства через гаваж.
    1. Начинайте гаваж с первого дня после MCAO и продолжайте до конца эксперимента, при этом процедура регулярно проводится утром во всех группах.
    2. Вводите FXT в группу FXT в дозе 2,33 мг/(кг·д), YNJYP в группу YNJYP при 9,92 г/(кг·д) и 0,9% нормального физиологического раствора (10 мл/кг) в группы инсульта и PSD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте иглу для гавада на 1 мл; Убедитесь, что игла введена в желудок (а не в трахею), чтобы избежать аспирации.

5. Хронический лёгкий стресс (поведенческие ограничения) в сочетании с изоляционным жильём

  1. Начинайте процедуру поведенческих ограничений и изоляционное содержание на 7-й день после MCAO (чтобы избежать фазы острого инсульта).
  2. Подготовьте индивидуальную T-образную платформу для фиксации.
    1. Платформа состоит из основания (20 см × 10 см × 2,8 см) и зоны крепления (22 см × 6,6 см).
    2. Зона фиксации содержит прорези для крепления головы и конечностей крысы, а также три регулируемых ремня для разных размеров крыс (рисунок 2, рисунок 3 и рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа модифицирована по сравнению с Chen3 иTian 4, с добавленными слотами для передних конечностей для имитации паретической позы пациентов с инсультом.
  3. Соблюдайте ежедневные ограничения.
    1. Случайным образом выбирайте двухчасовое окно каждый день (например, с 9:00 до 11:00 или с 14:00 до 16:00), чтобы избежать циркадного смещения.
    2. Закрепите каждую крысу на платформе с помощью прорезей и ремней; Регулировать сжатость, чтобы предотвратить трудности, но не подавлять дыхание.
    3. Сохраняйте ограничение в течение 2 часов непрерывно в течение 7 дней подряд.
  4. Домашние крысы в изоляции.
    1. Переместить крыс в группах PSD, FXT и YNJYP из группового содержания (по пять крыс в клетке) в одиночные клетки в начале действия поведенческих ограничений.
    2. Сохраняйте одиночное жилье до завершения соблюдения поведенческих ограничений (после 14-го дня MCAO).

6. Тест на потребление сахарозы (SCT)

ПРИМЕЧАНИЕ: Случайным образом выберите шесть крыс из каждой группы через 2, 4 и 8 недель после MCAO. Проверьте всех крыс в порядке SCT, OFT и FST.

  1. Подготовьте крыс к тесту.
    1. Быстро и лишьте крыс воды за 24 часа до теста.
    2. Убедитесь, что температура в тестовой комнате (23 ± 2 °C) и освещение соответствуют условиям помещения.
  2. Проведите тест.
    1. Поставьте в каждую клетку по две бутылки (по 150 мл каждая): одна с водопроводной водой, другая — с раствором сахарозы 1%.
    2. После часа свободного питья записывайте объёмы сахарозного раствора и потребленной воды.
  3. Рассчитайте предпочтения сахарозы.
    1. Используйте формулу: предпочтение сахарозы (%) = (объём употребленного раствора сахарозы / общий объём потребления) × 100%.
    2. Поменяйте места между двумя бутылками в середине периода питья, чтобы устранить смещение позиции.

7. Тест на открытом поле (OFT)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите одну и ту же партию крыс из каждой группы, используемую для FST, на 2, 4 и 8 недель. Постите и лишьте крыс воды в течение 24 часов до теста, чтобы поддерживать стабильные физиологические условия.

  1. Подготовьте оборудование для открытого поля.
    1. Используйте чёрный квадратный квадрат с полом, разделённым на 25 равных сеток.
    2. Держите тестовую комнату тихой и слабо освещенной.
  2. Проведите тест.
    1. Поместите каждую крысу в центральную сетку коробки и запустите таймер на 5 минут.
    2. Фиксировать горизонтальную активность (количество пересечений сетки с тремя четвертями лап в новой сетке) и вертикальную активность (количество задних с двумя четвертями лап над полом, вручную наблюдая с помощью ручных счетчиков).
    3. Записывайте время, проведённое в центральной сетке, и частоту груминга (по желанию, для дополнительной поведенческой информации).

8. Тест на принудительное плавание (FST)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите одну и ту же партию крыс из каждой группы, используемую для FST, на 2, 4 и 8 недель. Постите и лишьте крыс воды в течение 24 часов до теста, чтобы поддерживать стабильные физиологические условия.

  1. Подготовьте тестовое оборудование.
    1. Наполните стеклянный цилиндр соответствующим объёмом воды, убедившись, что уровень воды достаточно высок, чтобы крыса не могла поддерживать себя, касаясь ногами о дно.
    2. Отрегулируйте температуру воды на 25 ± 1 °C.
  2. Проведите тест.
    1. Поместите каждую крысу в цилиндр и дайте ей поплавать 5 минут.
    2. Запишите общее время неподвижности за 5 минут.
    3. Определите «неподвижность» как пассивное плавание (минимальные движения, чтобы нос оставался над водой), а «активность» — как гребля конечностями или царапание стены.
  3. Ухаживайте за крысами после теста.
    1. Вынимите крысу из цилиндра через 5 минут, высушите полотенцем и поместите под нагревательную лампу (30 ± 2 °C) на 30 минут, чтобы избежать переохлаждения (рисунок 5).

9. Статистический анализ

  1. Организуйте данные по среднему ± стандартному отклонению (среднее ± SD).
  2. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения SPSS версии 20.0.
  3. Перед проведением параметрических тестов проверьте данные на нормальность (с помощью теста Шапиро-Уилка) и однородность дисперсий (с использованием теста Левина). Данные каждой группы соответствуют нормальному распределению и удовлетворяют однородности дисперсии.
    1. Используйте односторонний анализ дисперсии (односторонний ANOVA) для сравнения выборочных средних между группами, в сочетании с тестами наименее значимой разницы (LSD) и тестами Студента-Ньюмана-Кюлса (SNK). Используйте тест Уэлча, когда дисперсии неравны.
  4. Установите статистическую значимость на p < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании было создано всего 5 экспериментальных групп для соответствующего обнаружения. После статистического анализа поведенческих данных каждой группы крыс было установлено, что на 4-й неделе эксперимента время неподвижности крыс группы PSD в FST значительно увеличилось по сравнению с крысами группы инсульта, а разница между двумя группами была статистически значимой (P < 0,01); в то же время предпочтение сахарозы у крыс группы PSD в SCT было значительно ниже, чем у крыс гру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В процессе построения модели ишемии мозга у крысы существуют различные методы моделирования, включая метод лигации, краниотомии, асфиксии и метода окклюзии проволоки. По сравнению с тремя методами моделирования — лигацией, краниотомией и асфиксией — метод окклюзии проволоки обладает значительными и уникальными преимуществами. Эти преимущества в основном заключаются в трёх ключевых аспектах: минимально инвазивном характере операции, точности управления временем и пространством, а также на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Юанькай Су и Юнхао Сун написали рукопись, включая интерпретацию результатов и раздел обсуждения. Хуилин Тянь проводил эксперименты и анализировал данные. Нин Дин и Син Ван провели рецензию на рукопись. Цзытун Ян и Цзинъяо Чжао внесли вклад в поиск данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Взрослые самцы крыс рода Спраг-ДоулиЛаборатория по технологиям животных реки Витал, Пекин, КитайНет. SCXK2012-0001300– 320 г
Капсулы с гидрохлоридом флуоксетинаПатеон, Франция, Цзянсу, Китай0943A
Гранулы YNJYPКафедра фармации Третьей аффилированной больницы Пекинского университета китайской медициныДомашние приготовления
Открытая коробка для теста на открытом полеДомашние приготовления -
Пентопенобарбитал натрияКорпорация Сигма АмерикиP3761-5
Нить окклюзииBeijing Shadong Biotechnology Co., Ltd2838-A4
Водяной резервуар для эксперимента с принудительным плаваниемДомашние приготовления -

Ссылки

  1. Sun, P., et al. Effects of "Tong-du-tiao-shen" acupuncture on hippocampal neuron protection and monoamine neurotransmitters in rats with post-stroke depression. Chin. Acupunct Moxibustion. 39 (7), 741-747 (2019).
  2. Sun, M., et al. Dynamic observation on hippocampal morphology and glucocorticoid receptor expression in rats with chronic unpredictable stress model. J Jiangsu Univ. (Med. Ed.). 26 (5), 369-374 (2016).
  3. Sun, Y., et al. Establishment and evaluation of post-stroke depression rat model. Chin J Stroke. 11, 891-894 (2007).
  4. Chen, J., et al. Effects of three traditional Chinese medicine formulations on BDNF and TrkB in chronic restraint-stressed rats. Chin J Pathophysiol. 23 (7), 1296-1300 (2007).
  5. Wang, Q., et al. Establishment and evaluation of rodent models of post-stroke depression. Chin J Rehabil Med. 29 (12), 1196-1199 (2014).
  6. Bederson, J. B., et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation and development of a neurologic examination. Stroke. 17 (3), 472-476 (1986).
  7. Longa, E. Z., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  8. Tian, H., et al. Effects of Yi-nao-jie-yu prescription on hippocampal neurogenesis and Notch signaling in PSD rats. Chin J Tradit Chin Med. 59 (4), 333-338 (2018).
  9. Wu, Z., et al. Comparison of chronic cerebral ischemia models in rats. Chin J Rehabil Med. 27 (3), 206-210 (2012).
  10. Hou, Z., et al. Cerebral ischemia rat model induced by D-galactose and vascular ligation. Chin J Neuroimmunol Neurol. 22 (4), 255-262 (2015).
  11. Xu, J., et al. Insertion depth of suture in rat MCAO model. Shanghai Lab Anim Sci. 34 (4), 209-212 (2014).
  12. Tian, H. Yi-nao-jie-yu prescription and hippocampal neuroregeneration via Notch pathway [Master's thesis]. , Beijing Univ. Chin. Med. (2018).
  13. Huang, Q., et al. Comparison of two depression models induced by corticosterone and CUS. J Anat. 48 (3), 273-281 (2017).
  14. Bernhardt, J., et al. Standards in stroke recovery research. Int J Stroke. 12 (5), 444-450 (2017).
  15. Oppenheimer, S. M., et al. Left-insular cortex lesions affect autonomic tone. Clin Auton Res. 6 (3), 131-140 (1996).
  16. Arvidsson, A., et al. Neuronal replacement after stroke from endogenous precursors. Nat Med. 8 (9), 963-970 (2002).
  17. Sapolsky, R. M., et al. How glucocorticoids influence stress responses. Endocr Rev. 21 (1), 55-89 (2000).
  18. Robinson, R. G., Jorge, R. E. Post-stroke depression: a review. Am J Psychiatry. 173 (3), 221-231 (2016).
  19. Nakayama, H., et al. Recovery of upper extremity function after stroke: Copenhagen Stroke Study. Arch Phys Med Rehabil. 75 (4), 394-398 (1994).
  20. Luo, L. Effects of Bu-yang-huan-wu decoction on hippocampal neuroregeneration via MAPK/ERK pathway. [Doctoral dissertation]. , Hunan Univ. Tradit. Chin. Med. (2015).
  21. Wang, S., et al. Mandatory exercise therapy in stroke rats. Chin J Gerontol. 37 (18), 4440-4443 (2017).
  22. He, J. Y., et al. Medical and clinical syndromes of ischemic PSD animal models. J. Guangzhou Univ Chin Med. 41 (7), 1926-1930 (2024).
  23. Xiao, W., et al. Acupuncture and neurotransmitter gene expression in PSD rats. Chin. Acupunct Moxibustion. 37 (6), 637-641 (2016).
  24. Deplanque, D., et al. Brain ischemia alters long-term response to antidepressants in mice. Behav Brain Res. 219 (2), 367-372 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель депрессии у крыстест принудительного плаваниятест потребления сахарозытест «открытое поле»нейрогенез у крысиндивидуальное содержание
Влияние рецепта И-Нао-Цзе-Ю на постинсультную депрессию у крыс с использованием окклюзии средней церебральной артерии в сочетании с поведенческим ограничением
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.