Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Механизм деокции Цзяньпи Шэнсюэ в облегчённой циклофосфамид-индуцированной миелосупрессии у мышей

557 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69542

⸱

2 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hunan University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine /Integrative Oncology, Hunan Cancer Hospital/The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол систематически объясняет, как отвар Цзяньпи Шэнсюэ смягчает миелосупрессию, вызванную циклофосфамидом, с помощью интегрированного подхода сетевой фармакологии и экспериментов на животных, раскрывая его многоцелевые механизмы и потенциал как адъювантной терапии.

Аннотация

Цель статьи — исследовать, как отвар Цзяньпи Шэнсюэ (JPSXD) облегчает миелосупрессию, вызванную химиотерапией, с помощью сетевой фармакологии и экспериментов на животных. Для этого были проанализированы ключевые компоненты и мишени, а также созданы сети взаимодействия белков и белков (PPI) и сети трав-компонент-мишень. Обогащение генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) выявило основные пути. Модель миелосупрессии, индуцированной циклофосфамидом (CTX), была установлена у 60 мышей C57/BL6. JPSXD вводили в разных дозах в течение 7 дней. Оценивались периферические показатели крови, цитокины (тромбопоэтин [TPO], эритропоэтин [EPO], гранулоцитарно-макрофаговый колони-стимулирующий фактор [GM-CSF]), индекс тимуса, морфологию костного мозга, клетки CD34+, а также экспрессию AKT1, JAK2 и EGFR. Сетевой анализ выявил 172 соединения и 454 мишени, выделив пути PI3K-Akt и JAK-STAT. In vivo CTX снижал уровень лейкоцитов и сигнальных белков, в то время как JPSXD восстановил подсчета, повышал AKT1, JAK2 и EGFR, а также улучшил индекс тимуса (p < 0,05). Средне- и высокие дозы JPSXD увеличивали TPO, EPO, GM-CSF, CD34+ клетки и улучшали структуру костного мозга, при этом высокая доза показала наиболее сильный эффект. В заключение, JPSXD облегчает миелосупрессию за счет многоцелевой, многопутной регуляции, что подтверждает его потенциал как дополнительной терапии при лейкопении, вызванной химиотерапией.

Введение

Химиотерапия является краеугольным камнем в лечении различных злокачественных заболеваний, главным образом путём ингибирования пролиферации раковых клеток ивыживаемости 1,2, тем самым продлевая выживаемость пациентов. Однако из-за отсутствия селективности при воздействии на нормальные ткани химиотерапевтические препараты часто наносят серьёзные повреждения здоровым клеткам и тканям, приводя к ряду побочныхэффектов 3. Одним из самых распространённых и серьёзных побочных эффектов химиотерапии является миелосупрессия, характеризующаяся снижением производства кровяных клеток, включая лейкоциты (лейкоциты), эритроциты (эритроциты) и тромбоциты (PLT)2,4. Миелосупрессия серьёзно нарушает иммунную защиту, увеличивая риск инфекций, кровотечений, анемии и других осложнений. Это также значительно снижает качество жизни пациентов и может быть опасно дляжизни 5. Таким образом, облегчение и предотвращение миелосупрессии, вызванной химиотерапией, критически важно для повышения толерантности пациентов к химиотерапии и общей выживаемости.

Современные клинические методы лечения миелосупрессии в основном включают гемопоэтические факторы роста, такие как гранулоцитарный колонистимулирующий фактор [G-CSF], эритропоэтин [EPO]) и трансфузионнуютерапию 6,7. Однако эти подходы часто связаны с высокой стоимостью, возможными побочными эффектами и ограниченной эффективностью. В результате исследование более безопасных и эффективных методов профилактики и облегчения миелосупрессии остаётся основным направлением исследований. В последние годы традиционная китайская медицина (ТКМ) привлекла значительное внимание за свою роль в лечении рака и управлении побочными эффектами, вызваннымихимиотерапией 8,9. Считается, что многие составы ТКМ обладают тонизирующим и иммуннорегулирующим эффектом, например, отвар Шэнсюэбао10, таблеткиДихуан Шэнбай 11 и соединениягинсенозида 12, которые не только защищают нормальные клетки и снижают токсичные побочные эффекты, но и повышают противоопухолевую эффективность.

Отвар Цзяньпи Шэнсюэ (JPSXD) — это классическая формула ТКМ, которая иллюстрирует терапевтические принципы тонизации Ци и питаниякрови 13. Эта формула представляет собой сложную модификацию отвара Сицзюньцзы в сочетании с Эр Чжи Вань, объединяющей синергетические эффекты нескольких трав для борьбы с дефицитом ци икрови 14. Формула состоит из женьшеня (Жэнь Шэнь), астрагала (Хуан Ци), эпимедиума (Инь Ян Хо), атрактилодов (Бай Чжу), ямса (Шань Яо), сальвии (Дань Шэнь), приготовленной рехмании (Шу Ди Хуан), семян посудника (Ту Си Цзы), волчьей ягоды (Гоу Ци Цзы), лигуструма (Ню Чжэнь Цзы), анжелики (Данг Гуй), жареного ячменя (Чао Май Я), жареного куриного желудка (Чао Цзи Нэй Цзинь), сушёная мандариновая кожура (Чэнь Пи), семена койкса (И И Жэнь) и несколько других трав. Каждая трава играет определённую роль в формуле, соблюдая принцип ТКМ — суверенные, помощники, помощники и направляющие травы, что обеспечивает сбалансированный и целенаправленный терапевтический эффект.

Отвар Сицзюньцзы, основополагающая формула в ТКМ, известен своей способностью тонизировать Ци и укреплять селезёнку. Он широко применяется для лечения состояний, связанных с Ци и дефицитом крови, таких как усталость, плохой аппетит и ослабленный иммунитет. Современные фармакологические исследования показали, что отвар Sijunzi усиливает иммунную функцию, способствует гемопоэзу и улучшает способность организма ксамовосстановлению 15,16. Опираясь на эту основу, JPSXD включает дополнительные травы для дальнейшего повышения эффективности в питании крови и устранения более сложных дефицитов. Например, приготовленная рехмания и ангелика — ключевые питательные травы17, а астрагал и женьшень работают синергетически, усиливая Ци и повышая общую жизненнуюсилу 18.

Недавние исследования выявили потенциальные противоопухолевые эффекты JPSXD, предполагая, что его многокомпонентный, многоцелевой подход может подавлять рост опухолей и повышать эффективность традиционного лечения рака19,20. Способность формулы модулировать иммунные ответы и улучшать функцию гемопоэтической терапии делает её особенно ценной при поддержке пациентов, проходящих химиотерапию или лучевую терапию, которые часто сталкиваются с дефицитом ци и крови как побочным эффектомлечения 21. Кроме того, включение таких трав, как сальвия и эпимедиум, показало, что улучшает микроциркуляцию и усиливает механизмы клеточного восстановления, что способствует общей терапевтической пользеформулы 22.

Современные фармакологические исследования показали, что каждая отдельная трава в JPSXD обладает фармакологической активностью, связанной с гемопоэтической функцией, антимиелосупрессией, иммуномодуляцией и антиоксидантами, а также микроциркуляторным улучшением, что обеспечивает косвенную исследовательскую поддержку применения JPSXD для облегчения миелосупрессии, вызванной химиотерапией. Таблица 1 суммирует основные фармакологические эффекты каждой травы вместе с соответствующими источниками, с акцентом на исследования, изучающие гемопоэз, антимиелосупрессивную активность, иммуномодуляцию и антиоксидантные или микроциркуляционные свойства. Сложная синергия компонентов в JPSXD включает как кооперативные, так и антагонистические взаимодействия между травами, направленные на несколько путей для достижения целостного терапевтического эффекта. Например, женьшень и астрагал работают вместе для тонизации ци, а сальвия и подготовленная рехмания питают кровь и улучшают кровообращение. В то же время такие травы, как сухоя мандариновая кожура и жареный ячмень, помогают регулировать пищеварение и предотвращают застой, обеспечивая эффективное усвоение и использование тонизирующего эффекта формулыорганизмом. Этот многогранный подход соответствует философии ТКМ, направленной на лечение коренной причины заболевания при одновременном устранении его симптомов.

В заключение, JPSXD — это хорошо сбалансированная и научно подтверждённая формула ТКМ, воплощающая принципы Ци и детоксикации крови. Его потенциальные применения в укреплении иммунитета, стимулировании гемопоэза и поддержке противоопухолевой терапии делают его ценным дополнением как к традиционной, так и к современной медицинской практике. Однако высококачественных клинических доказательств, непосредственно оценивающих эффективность JPSXD в облегчении миелосупрессии, вызванной химиотерапией, остаётся отсутствующим. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения его основных механизмов и оптимизации клинических стратегий применения. Поэтому данное исследование направлено на подтверждение концепции потенциальных терапевтических эффектов JPSXD с доклинической механистической точки зрения.

Сетевая фармакология, обладающая своей системной и интегративной природой, широко используется для идентификации активных компонентов китайских лекарств и разъяснения их механизмов действия24,25. В этом исследовании была использована сетевая фармакология для анализа потенциальных сигнальных путей и ключевых мишеней, затронутых JPSXD в контексте миелосупрессии. Кроме того, была создана модель мышей миелосупрессии, индуцированная циклофосфамидом (CTX), для оценки соответствующих показателей и оценки влияния JPSXD на миелосупрессию. Также была проведена предварительная валидация ключевых целей и путей, выявленных с помощью сетевой фармакологии. Это первое исследование, систематически интегрирующее сетевую фармакологию с экспериментами на животных для выяснения молекулярного механизма, с помощью которого JPSXD облегчает миелосупрессию, вызванную химиотерапией, через многоцелевую регуляцию сигнальных путей, таких как путь PI3K-AKT, заполняя тем самым пробел в механистическом понимании гемопоэтических защитных эффектов этого соединения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с Правилами об управлении лабораторными животными и этическими нормами Центра экспериментальных животных Онкологической больницы Хунань. Протокол исследования был утверждён Комитетом по этике животных онкологической больницы Хунань (номер одобрения: KNZY-202416). На протяжении всего исследования учёные прилагали все усилия, чтобы минимизировать количество используемых животных и облегчить их страдания.

Приготовление животных
Всего было получено 60 10-недельных самцов C57/BL6 от компании Hunan Slack Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. (номер лицензии: SCXK [Hu] 2021-0002). Все мыши содержались в Центре экспериментальных животных Онкологической больницы Хунань в контролируемых условиях: температура: 23 ± 2 °C, влажность: 50% ± 10%, и 12-часовой цикл свет/тёмный (8:30–20:30). Мыши имели иммиграционный доступ к еде и воде. До экспериментов их акклиматизировали к окружающей среде через ежедневное обращение по 5 минут в течение трёх дней. После акклиматизации все 60 мышей были стратифицированы по массе тела и случайным образом распределены на шесть групп (n = 10 на группу) с помощью компьютерной таблицы случайных чисел. Группы включали: контрольный бланк, модельный, нормальный физиологический раствор (NS), высокие дозы JPSXD (40 мг/кг), средняя доза JPSXD (30 мг/кг) и низкие дозы JPSXD (20 мг/кг). Процесс рандомизации обеспечил отсутствие значимых различий в средней массе тела между группами (p > 0,05). Последовательность рандомизации была сгенерирована и выполнена исследователями, не участвовавшими в последующих экспериментальных процедурах, чтобы минимизировать смещения.

Подготовка материалов
Безопасность и утилизация отходов: В этом исследовании использовался CTX — высокотоксичный химиотерапевтический агент. Все процедуры проводились строго в соответствии с Правилами по управлению безопасностью опасных химикатов и лабораторными стандартами второго уровня биобезопасности. Особые меры предосторожности включали использование одноразовой защитной одежды, нитриловых перчаток, респираторов N95 и защитных очков всем персоналом. Подготовка и введение CTX проводились внутри биобезопасности класса II. Подготовка раствора для инъекции CTX проводилась в выхлопной вытяжке с использованием специализированных приборов для предотвращения образования аэрозолей. Острые изделия и предметы, заражённые CTX, такие как шприцы и перчатки, выбрасывались в контейнеры, устойчивые к проколам. Другие загрязнённые материалы (например, подстилка, ткани животных) были инактивированы погружением в 10% гипохлорита натрия в течение 24 часов и затем сожжжён сертифицированным поставщиком медицинских отходов. В случае разлива CTX область немедленно покрывалась абсорбирающим хлопком и нейтрализовалась раствором тиосульфата натрия 1%. Инцидент был затем сообщен руководителю по безопасности.

Лекарства и реагенты: инъекция CTX была получена компанией Baxter Oncology GmbH, Германия (серия No: HJ20160467). JPSXD был подготовлен кафедрой традиционной китайской медицины Онкологической больницы Хунань. Он состоял из 15 традиционных трав — женьшень Panax, Astragalus membranaceus, Epimedium brevicornum, Atractylodes macrocephala, Dioscorea opposita, Salvia miltiorrhiza, Rehmannia glutinosa, Cuscuta chinensis, Lycium barbarum, Ligustrum lucidum, Angelica sinensis, жареного солода, оболочки куриного желудка, сушёной мандариновой кожуры и семени Coix — объединённых по классическим коэффициентамсовместимости 20. Напой концентрировали до конечной концентрации 3 кг/л (то есть 3 г/мл). Перед запуском концентрат разбавляли NS для достижения необходимых концентраций для каждой дозовой группы: 4 мг/мл для группы с высокими дозами (40 мг/кг), 3 мг/мл для группы средней дозы (30 мг/кг) и 2 мг/мл для группы с низкой дозой (20 мг/кг)26. Объём гаважа был рассчитан как 0,1 мл на 10 г массы тела, что дало итоговый объём введения 0,2-0,25 мл на мышь (при диапазоне веса 20-25 г)27.

Наборы для ИФС: Использовались коммерчески доступные наборы для ИФА для гранулоцитно-макрофагового колони-стимулирующего фактора (GM-CSF), ЭПО и тромбопоэтина (TPO) у мышей. Образцы сыворотки были разбавлены в буфере PBS 1:5 (pH 7,4) перед тестированием. Стандарты были восстановлены в 100 мкл на скважину.

Вторичное антитело: IgG, конъюгированный с HRP-конъюгированным козлиным антикром, был разведён с содержанием 1:5000 (конечная концентрация: 0,04 мкг/мл) в буфере TBST, содержащем 5% обезжиренного сухого молока и 0,05% Tween-20. Раствор был свежеприготовлен и инкубирован при комнатной температуре в течение 1 часа.

Первичные антитела к западному блоту: использовались GAPDH (кроличий поликлональный), AKT (кроличий поликлональный), JAK2 (кроличий моноклональный) и EGFR (мышиный моноклональный). Все антитела разбавлялись в буфере TBST, содержащем 5% BSA: GAPDH (1:1000), AKT (1:1000), JAK2 (1:800) и EGFR (1:800). Объём инкубации составлял 100 мкл на мембрану.

Фиксация тканей: Раствор 4% параформальдегида (PFA) был получен путём растворения порошка PFA в PBS (pH 7,4). Ткани были фиксированы на 24 часа.

Раствор для окрашивания гематоксилина и эозина (H&E): раствор гематоксилина (0,1% гематоксилин Харриса) и раствор эозина Y (0,5%) были подготовлены согласно стандартным патологоанатомическимпротоколам 28. Продолжительность окрашивания составляла 5 минут для гематоксилина и 3 минуты для эозина.

Иммунофлуоресцентный блокирующий буфер: Для блокировки использовался буфер PBS, содержащий 10% козьей сыворотки и 1% BSA, с инкубацией 30 минут.

Буфер разбавления антител для иммунофлуоресценции: Первичные антитела (CD34+, TPO, EPO, GM-CSF) для иммунофлуоресценции были разведены в буфере PBS с 1% BSA, согласно рекомендованному производителем коэффициенту разбавления (1:200), что дало итоговую концентрацию 2,5 мкг/мл. Инкубационный объём составлял 50 мкл на срез ткани.

Индукция животной модели
60 мышей были случайным образом разделены на шесть групп (n = 10 на группу): контрольная пустота, модельная, высокая доза, средняя доза, низкая и контрольная система NS. За исключением контрольной группы, все мыши получали внутрибрюшинные инъекции CTX (20 мг/кг) 1 раза в день в течение трёх последовательных дней для создания модели миелосупрессии. Все модельные мыши демонстрировали лейкоциты < 1,8 × 109/л, PLT < 85 × 10⁹/л и >55% уменьшение клеток костного мозга через 24 часа после финальной инъекции. Этот протокол соответствует установленным моделям миелосупрессии, индуцируемойCTX, 29,30. После инъекции мышей ежедневно наблюдали за общим состоянием, включая уровень активности, внешний вид шерсти и изменения массы тела. С самого начала моделирования и до конца эксперимента масса тела фиксировалась в одно и то же время каждый день с помощью электронного веса. Скорость изменения массы тела рассчитывалась следующим образом: (окончательный вес / начальный вес) x 100% для оценки общего физиологического состояния и потенциального защитного эффекта JPSXD. После инъекции мышей содержали в индивидуально вентилируемых клетках (IVC), каждая из которых была чочно обозначена как заражённая CTX. Подстилка менялась каждые 2 дня, а вся использованная подстилка утилизировалась в соответствии с описанными выше протоколами по опасным отходам.

Внутрижелудочное введение
Мыши из групп с высокими, средними и низкими дозами получали JPSXD через гаваж в дозах 40 мг/кг, 30 мг/кг и 20 мг/кг соответственно. Контрольная группа физиологического раствора получила равный объём NS. Растворы для гаважа были приготовлены в концентрациях 4 мг/мл, 3 мг/мл и 2 мг/мл соответственно и введены в объёме 0,1 мл на 10 г массы тела. Всех мышей дважды в день в течение 7 дней подряд. Группа физиологического контроля получила 0,2-0,25 мл NS на мышь. Никакой обработки группы пустых и модельных групп не проводились. Отсутствие кашля или борьбы во время подачи указывало на правильную технику применения.

Анализ крови и подготовка сыворотки
Натретий день после инъекции CTX из хвостовой вены было взято 0,2 мл крови для оценки успеха создания модели с помощью измерения количества периферических кровяных клеток с помощью полностью автоматизированного гематологического анализатора. Через 24 часа после окончательного забора JPSXD кровь была взята из орбитального синуса случайно выбранных мышей (n = 10 на группу). Часть крови использовалась для полного анализа анализа крови, а остальная часть — для приготовления сыворотки. Образцы центрифугировали при 3 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Супернатант (прозрачный, бледно-жёлтый верхний слой) был собран в виде сыворотки и алицитирован для хранения при -80 °C для последующих анализов на ИФА и тестирования функции печени и почек. Слой сыворотки был чётко отделён от слоя кровяных клеток, без признаков гемолиза или мутности. Гематологические параметры включали уровни лейкоцитов, эритроцитов, ПЛТ и уровни гемоглобина (Hb).

Оценка функции печени и почек
Полностью автоматизированный биохимический анализатор был использован для измерения маркеров функции печени в сыворотке — аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) — а также маркеров функции почек — азота мочевины в крови (BUN) и креатинина (Cre). Все процедуры следовали стандартному протоколу работы прибора. В частности, 100 мкл сыворотки смешивалось с соответствующими наборами для анализа (ALT, AST, BUN и Cre) и инкубировалось при 37 °C в течение 5 минут. Поглощение измерялось на уровне 340 нм. Каждый образец тестировался в дубликате, и для анализа использовалось среднее значение.

Расчёт индекса органов
Через 24 часа после окончательного введения JPSXD мышей эвтаназии постепенно вдыхались углекислым газом (CO2) (расход: 20% объёма камеры/мин), после чего вторичным методом следовала шейная дислокация31. Сразу после эвтаназии печень, почки, селезёнка и тимус асептически извлекали через вентральный средний разрез. Органы аккуратно отделялись от окружающих соединительных тканей и жира, затем промывались ледяным физиологическим раствором (NS) для удаления остаточной крови. Органы промокались досуха предварительно взвешенной фильтрующей бумагой под стандартизированным давлением (3 мягких пресса) и взвешивались немедленно на калиброванном электронном весах (точность: ±0,1 мг) при комнатной температуре (22 ± 1°C).

Все процедуры проводились на предварительно охлаждённом лотке из нержавеющей стали для минимизации аутолиза. Индекс органа рассчитывался как масса органа (мг) на массу тела (г) для оценки влияния JPSXD на основные органы. Части каждой ткани были зарезервированы для анализа западного блота, а остальные образцы фиксировались в 4% PFA для последующего гистологического обследования.

ЭЛИЗА
Концентрации в сыворотке TPO, EPO и GM-CSF измерялись с помощью наборов ELISA согласно инструкциям производителя. Все этапы центрифуга, включая промывку образца и восстановление реагента, проводились при комнатной температуре при 1000 x г в течение 5 минут. Этапы промывки проводились с использованием буфера PBST (PBS содержит 0,05% Tween-20), с добавлением 300 мкл раствора для промывки в одну скважину и повторением три раза. После промывки на дне колодцев не осталось остаточных жидкостей. После развития цвета появился отчетливый синий осадок. Поглощение измерялось на 450 нм с помощью считывателя микропластин после завершения реакции.

Окрашивание H&E
После эвтаназии были собраны тимус и бедренная кости. Тимус взвешивали для расчёта индекса тимуса (масса тимуса [mg]/масса тела [g]). После взвешивания часть тимуса использовалась для анализа западного блота, а остальная часть вместе с бедренной кости фиксировалась в 4% PFA. Образцы бедренной кости подверглись градуированному обезвоживанию этанола (70%, 80%, 95% и 100%, каждый в течение 1 часа). Правильное обезвоживание отмечалось равномерно белым видом, без смягчения или деформации. Блоки тканей, вложенные в парафин, были разрезаны толщиной 4 мкм с помощью вращающегося микротома с высокоточными лопастями из карбида вольфрама (тип H31). Секции плавали в водяной бане при температуре 40 °C с раствором желатина 0,5% для устранения складок, затем устанавливались на микроскопические стекла. Все срезы имели целостную морфологию, гладкие края и равномерную прозрачность при световой микроскопии, что подтверждало оптимальное качество секционирования. Была проведена окрашивание H&E, затем крепление водным монтажнымматериалом 28. После окрашивания ядра стали синими, а цитоплазма — розовой, с чётко очерченной клеточной архитектурой под микроскопическим наблюдением с помощью инвертированного микроскопа. Гистоморфологический анализ проводился с использованием программного обеспечения. Для каждого участка, окрашенного H&E, были выбраны три случайных поля с увеличением 200 раз. Программное обеспечение автоматически количественно определяло количество ядерных ячеек на единицу площади после ручного определения интересующей области, и результаты выражались в среднем ± стандартном отклонении (x̄ ± с).

Вестерн блот
Ткани тимуса (50 ± 2 мг/образец) были гомогенизированы в ледяном буфере RIPA с 1x коктейлем ингибиторов протеазы при точном соотношении 100 мг ткани на 1 мл буфера с использованием моторизованного гомогенизатора из пеллетных пестиков, оснащённого пестиками без РНаз. Гомогенизация проводилась на льду с 15 импульсами (1 с импульсом/2 с паузой), после чего следовала 30-минутная инкубация на льду с вихрем каждые 10 минут. Гомогенат был центрифугирован при 12 000 x г в течение 20 минут при 4 °C, а полученный супернатант был собран для количественной оценки белков. Супернатант выглядел прозрачным и прозрачным, без осадков и липидных слоёв. Концентрация белка измерялась с помощью набора для анализа белков BCA со стандартным диапазоном кривой от 0 до 2000 мкг/мл. Western blot проводился для оценки уровней экспрессии AKT1, JAK2 и EGFR в ткани тимуса с использованием GAPDH в качестве внутреннего контроля. После электрофореза и переноса мембраны белковый маркер (10-200 кДа) показал чёткие полосы, а целевые полосы совпали с ожидаемыми молекулярными массами (AKT1: 60 кДа, JAK2: 130 кДа, EGFR: 170 кДа и GAPDH: 37 кДа).

Денситометрический анализ западных блот-полос проводился с помощью программного обеспечения. Перед анализом полоски были визуально осмотрены для подтверждения отсутствия размазивания или диффузии. Процедура анализа включала: ручной выбор целевых зон полосы после импорта изображения с автоматическим определением краёв программным обеспечением, а затем локальное фоновый вычитание с использованием областей, прилегающих к полосам для коррекции серых значений. Затем был выполнен расчет отношения значения грея между целевой белком и внутренним контролем для относительной количественной оценки. Использованная формула нормализации была следующей:

Относительная экспрессия целевого белка = (серое значение целевой зоны −локальный фон) / (серое значение внутреннего контроля −локальный фон)

Иммуногистохимия
Иммуногистохимическое окрашивание проводилось на срезах бедренной кости. Срезы были проницаемы с помощью 0,1% Triton X-100 в течение 10 минут, затем блокировали 30 минут. Первичные антитела инкубировали ночью при 4 °C, а вторичные — в течение 1 часа при комнатной температуре. После окрашивания под световым микроскопом наблюдались чёткие положительные сигналы с низким фоном и без неспецифического окрашивания. Стекли монтировались с помощью среды против выцветания с DAPI, который окрашал ядра в синий цвет. Затем была оценена экспрессия CD34+, TPO, EPO и GM-CSF. Изображения иммуногистохимии анализировались с помощью программного обеспечения для цифровой патологии (версия 2.1.0). Перед анализом изображения проверялись на отсутствие переэкспонирования или ухудшения сигнала. Процедура анализа32включала:

Выбор модели: Предварительно обученная модель сегментации костного мозга (на базе U-Net) была использована для автоматической идентификации областейтканей 33.
Установка порогов: Пороги положительного сигнала определялись на основе отрицательной контрольной группы. Области с хромогенной интенсивностью, превышающей фоновую среднюю на три стандартных отклонения, классифицировались как положительные.
Определение ROI: Программное обеспечение автоматически делило каждое поле на 500 × 500 мкм сетки и рассчитывало количество положительных ячеек на единицу площади (положительное количество ячеек/площадь поля).
Экспорт данных: Статистический отчёт о положительной плотности клеток был автоматически сгенерирован.

Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS (версия 22.0). Данные выражались в виде x̄ ± s. До межгрупповых сравнений нормальность оценивалась с помощью теста Шапиро-Уилка, а однородность дисперсий — с помощью теста Левина. Если подтверждались как нормальное распределение (p > 0,05), так и однородность дисперсии (p > 0,05), для сравнения групп использовалась односторонняя ANOVA. Пост-хок множественные сравнения проводились с использованием метода наименее значимой разницы (LSD); для контроля ошибки типа I все пост-хок P-значения были скорректированы с помощью коррекции Бонферрони, при этом скорректированный p < 0,05 считался статистически значимым.

Если данные не соответствовали предположениям нормальности или однородности дисперсии (p ≤0,05 в любом из тестов), применялся тест Крускаля–Уоллиса, за которым следовал тест Данна для пост-хок анализа с коррекцией Бонферрони. Все статистические графики и визуализации генерировались с помощью GraphPad Prism (версия 9.0). Уровень значимости был установлен на уровне α = 0,05. Все зарегистрированные p-значения были скорректированы. Выбросы были выявлены с помощью теста Граббса (α = 0,05) и исключались только при явной связи с экспериментальной ошибкой. Все оставшиеся данные были включены в итоговый анализ. Результаты представлены как x̄ ± s.

Методология сетевой фармакологии
В этом исследовании использовался подход сетевой фармакологии для изучения возможных механизмов, с помощью которых JPSXD облегчает миелосупрессию, вызванную химиотерапией. Во-первых, химические компоненты JPSXD и соответствующие им цели были извлечены из базы данных и аналитической платформы фармакологии традиционных китайских медицинских систем (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php). Критерии скрининга были установлены следующим образом: пероральная биодоступность (OB) ≥30% и похожие на лекарства (DL) ≥0,18. Для соединений, не включённых в базу данных TCMSP, прогнозирование целей проводилось с помощью платформы SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch/).

Чтобы убедиться, что выбранные соединения охватывают основные биоактивные компоненты JPSXD, была сделана ссылка на Фармакопею Китайской НароднойРеспублики 34. В частности, мы идентифицировали маркерные соединения, такие как гинсенозиды, астрагалозид IV, икарин и сальвианоловые кислоты, изучив разделы идентификации и анализ для каждой травы. Эти соединения, часто используемые в качестве маркеровконтроля качества 35, имеют определённые химические структуры и количественные требования. Для точности мы сопоставили Общие уведомления и приложения фармакопеи для подтверждения наименования и аналитических методов (например, высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ). Анализ подтвердил, что критерии скрининга (OB ≥30%, DL ≥0,18) эффективно охватывают основные соединенияформулы 36, включая ключевые фармакопейные компоненты, такие как гинсенозиды Rg1 и Rb1 (из женьшеня Panax), астрагалозид IV (из Astragalus membranaceus) и икарин (из Epimedium brevicornum), что указывает на то, что выбранные соединения являются репрезентативными и включают основные активные компоненты, отвечающие за тонификация ци и крови JPSXD эффекты.

Впоследствии генные мишени, связанные с миелосупрессией, были извлечены из базы данных GeneCards (https://www.genecards.org/), и результаты загружались в таблицу. Для дальнейшего анализа были отобраны гены с показателем релевантности ≥44. Пересечение лекарственных мишень и генов, связанных с заболеваниями, визуализировалось с помощью диаграммы Венна, а перекрывающиеся гены импортировались в базу данных STRING (https://string-db.org/). Организм был установлен как человек, а источники взаимодействия ограничивались экспериментами и базами данных с минимальным требуемым показателем взаимодействия > 0,7. Полученная сеть взаимодействия белков и белков (PPI) затем была проанализирована на топологические характеристики для выявления основных мишеней и визуализирована с помощью Cytoscape 3.10.2.

На основе выявленных основных целей были проведены анализы обогащения Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Ges and Genomes (KEGG) с использованием базы данных DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). Параметры были установлены: Count ≥5, EASE score ≥0,05 и p-значение < 0,01. Результаты обогащения визуализировались через платформу Microbiological Letter (http://www.bioinfo-cloud.org/). Анализ путей дополнительно прояснил ключевые сигнальные маршруты и регуляторные маркеры, выявив потенциальные механизмы, с помощью которых JPSXD смягчает миелосупрессию, вызванную химиотерапией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сетевой фармакологический анализ
Идентификация активных соединений и целей
Сначала мы определили основные маркерные соединения каждой травы в JPSXD на основе литературы, чтобыобеспечить всесторонний отбор34. В частности, изучив фармакопеиальные записи по соответствующим травам (например, женьшень Panax, Astragalus membranaceus, Angelica sinensis), мы составили список официальных маркерных компонентов для всех 15 травяных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

На фоне роста глобальной заболеваемости раком медицинское сообщество сталкивается с двумя проблемами: не только лечением самого рака, но и управлением сопутствующими побочными эффектами, среди которых миелосупрессия является особенно распространённой и тяжёлой побочнойреакцией 43. В этом исследовании систематически изучалась роль и потенциальные механизмы JPSXD в облегчении миелосупрессии, вызванной CTX, у мышей, используя сочетание сетевой фармакологии и эксперим...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было финансово поддержано проектом Integrative Western and Traditional Chinese Medicine Focus-DCA Mode Intervention for Prevention Postopative Infections у пожилых пациентов с желудочно-кишечными злокачественными заболеваниями, проект с номером A2023053, финансируемым провинциальной администрацией традиционной китайской медицины провинции Хунань.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% параформальдегид (PFA)Сигма-ОлдричP6148
AKT (сковорода) Rabbit mAbТехнология клеточной сигнализации#4691
Автоматическая мойка микропластинBioTek (Agilent)ELx405
Автогематологический анализатор BC-2800vetMindrayBC-2800vet
Микротом КриостатаТермо Фишер СайентификCryoStar NX50
Инъекция циклофосфамидаBaxter Oncology GmbHНет (Партия: HJ20160467)
Микроскоп E100NikonE100
Антитела к EGFR (A-10)Санта-Крус БиотехнологияSC-373746
Машина вложенияLeicaEG1150
EPO (мышь) ELISA KitR& D SystemsMEP00B
GAPDH Rabbit Polyclonal AntibodyProteintech10494-1-AP
GM-CSF (мышь) ELISA комплектR& D SystemsMMC00B
Козла против кроликов IgG с HRP конъюгированнымJackson ImmunoResearch111-035-003
H& Набор для окраски EСигма-ОлдричHT10
Высокоскоростная холодильная центрифугаТермо Фишер СайентификСорвалл ST 16R
Моломолка для салфеток с высокой производительностьюServicebioKZ-II
Перо по иммуногистохимииVector LaboratoriesH-4000
JAK2 Rabbit mAbAbcamab108596
Отвар Цзяньпи Шэнсюэ (JPSXD)Аптека онкологической больницы ХунаньИндивидуальная формулировка
Считыватель микропластинBioTek (Agilent)Синергия H1
Обычный физиологический растворБакстер2B1324X
Ротационный микротомLeicaRM2016
Процессор тканейLeicaASP300S
TPO (мышь) ELISA KitR& D SystemsMTP00B
Вихревой миксерServicebioMX-F

Ссылки

  1. Wang, D. H., et al. Validated herbal extracts for alleviating chemotherapy-induced myelosuppression: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 141, 156659(2025).
  2. Goldschmidt, J., et al. Burden of chemotherapy-induced myelosuppression among patients with ES-SCLC in US community oncology settings. Future Onco. 18 (35), 3881-3894 (2022).
  3. Jia, W., Li, X., Zhang, T., Wang, C., Zhen, M. Efficiently normalizing leukopoiesis by gadofullerene nanoparticles to ameliorate radiation-triggered myelosuppression. J Mater Chem. B. 11 (31), 7401-7409 (2023).
  4. Hart, L., et al. Burden of chemotherapy-induced myelosuppression among patients with extensive-stage small cell lung cancer: A retrospective study from community oncology practices. Cancer med. 12 (8), 10020-10030 (2023).
  5. Pan, L., Zhang, T., Cao, H., Sun, H., Liu, G. Ginsenoside Rg3 for Chemotherapy-Induced Myelosuppression: A Meta-Analysis and Systematic Review. Front Pharmacol. 11, 649(2020).
  6. Schneider, A., Kuhn, H. -G., Schäbitz, W. R. A role for G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) in the central nervous system. Cell Cycle. 4 (12), 1753-1757 (2005).
  7. Hart, C., Grassinger, J., Andreesen, R., Hennemann, B. EPO in combination with G-CSF improves mobilization effectiveness after chemotherapy with ifosfamide, epirubicin and etoposide and reduces costs during mobilization and transplantation of autologous hematopoietic progenitor cells. Bone Marrow Transpl. 43 (3), 197-206 (2008).
  8. Miao, K., Liu, W., Xu, J., Qian, Z., Zhang, Q. Harnessing the power of traditional Chinese medicine monomers and compound prescriptions to boost cancer immunotherapy. Front Immunol. 14, 1277243(2023).
  9. Li, S., et al. Tailoring traditional Chinese medicine in cancer therapy. Mol Cancer. 24 (1), 27(2025).
  10. Ma, L. X., Ai, P., Li, H., Vardy, J. The prophylactic use of Chinese herbal medicine for chemotherapy-induced leucopenia in oncology patients: a systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials. Support Care Cancer. 23 (2), 561-579 (2015).
  11. Han, J., et al. Study of the Effects and Mechanisms of Ginsenoside Compound K on Myelosuppression. J Agr Food Chem. 67 (5), 1402-1408 (2019).
  12. Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi Decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302, 115876(2023).
  13. Zhao, N., et al. Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction improves the energy metabolism of psoriasis mice by regulating the electron transfer of oxidative phosphorylation. J Ethnopharmacol. 324, 117714(2024).
  14. Zhang, S., et al. Jianpi Huayu Jiedu Decoction prevents the progression of H. pylori and MNU-induced gastric precancerous lesions by inhibiting ferroptosis and remodeling linoleic acid metabolism. J Ethnopharmacol. 352, 120217(2025).
  15. Gao, B., Wang, R., Peng, Y., Li, X. Effects of a homogeneous polysaccharide from Sijunzi decoction on human intestinal microbes and short chain fatty acids in vitro. J Ethnopharmacol. 224, 465-473 (2018).
  16. Luo, X., et al. STAT3 as a critical target of Sijunzi Decoction in the treatment of gastric cancer: evidence from integrated network pharmacology and experimental validation. Front Mol Biosci. 12, 1683806(2025).
  17. Zhang, L., et al. Danggui buxue decoction attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity by inhibiting ZBP1-mediated PANoptosis in vivo and in vitro. Phytomedicine. 145, 157037(2025).
  18. Mei, Z. G., et al. Fermented Chinese formula Shuan-Tong-Ling attenuates ischemic stroke by inhibiting inflammation and apoptosis. Neural Regen Res. 12 (3), 425-432 (2017).
  19. Huang, Q., et al. Jian-Pi-Bu-Xue-Formula Alleviates Cyclophosphamide-Induced Myelosuppression via Up-Regulating NRF2/HO1/NQO1 Signaling. Front Pharmacol. 11, 1302(2020).
  20. Yang, J., et al. Effect of Jianpi Shengxue Tablet on Iron Metabolism and Nutritional Status in Patients with Renal Anemia: A Prospective, Randomized, Open, Parallel Controlled and Multicenter Clinical Study. Curr Med Sci. 44 (3), 603-610 (2024).
  21. Hou, B., et al. Oral Chinese Herbal Medicine as an Adjuvant Treatment for Chemotherapy, or Radiotherapy, Induced Myelosuppression: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Evid-Based Compl Alt. 2017, 3432750(2017).
  22. Han, J. Y., et al. Ameliorating effects of compounds derived from Salvia miltiorrhiza root extract on microcirculatory disturbance and target organ injury by ischemia and reperfusion. Pharmacol Therapeut. 117 (2), 280-295 (2007).
  23. Liu, Y., et al. Integration of Network Pharmacology and Experimental Validation to Explore Jixueteng - Yinyanghuo Herb Pair Alleviate Cisplatin-Induced Myelosuppression. Integr Cancer Ther. 23, 15347354241237969(2024).
  24. Liu, Y., et al. Anti-Alzheimers molecular mechanism of icariin: insights from gut microbiota, metabolomics, and network pharmacology. J Transl Med. 21 (1), 277(2023).
  25. Zhang, H., et al. Bioinformatics and Network Pharmacology Identify the Therapeutic Role and Potential Mechanism of Melatonin in AD and Rosacea. Front Immunol. 12, 756550(2021).
  26. Qu, W., et al. Effect of Jianpi Shengxue Granule on Fertility and Early Embryo Development Toxicity of Rats. Chin J Integr Med. 37 (3), 356-359 (2017).
  27. Ouyang, X., et al. Induction of anaplastic lymphoma kinase (ALK) as a novel mechanism of EGFR inhibitor resistance in head and neck squamous cell carcinoma patient-derived models. Cancer Biol Ther. 19 (10), 921-933 (2018).
  28. Cinque, L., et al. Novel association of MEN1 gene mutations with parathyroid carcinoma. Oncol Lett. 14 (1), 23-30 (2017).
  29. Huyan, X. H., Lin, Y. P., Gao, T., Chen, R. Y., Fan, Y. M. Immunosuppressive effect of cyclophosphamide on white blood cells and lymphocyte subpopulations from peripheral blood of Balb/c mice. Int Immunopharmacol. 11 (9), 1293-1297 (2011).
  30. He, Y., et al. Mesenchymal stem cells empower T cells in the lymph nodes via MCP-1/PD-L1 axis. Cell Death Dis. 13 (4), 365(2022).
  31. Recordati, C., et al. Repeated oral administration of low doses of silver in mice: tissue distribution and effects on central nervous system. Part Fibre Toxicol. 18 (1), 23(2021).
  32. Ram, S., et al. Pixelwise H-score: A novel digital image analysis-based metric to quantify membrane biomarker expression from immunohistochemistry images. Plos One. 16 (9), e0245638(2021).
  33. Woo, B., et al. Automated anomaly-aware 3D segmentation of bones and cartilages in knee MR images from the Osteoarthritis Initiative. Med Image Anal. 93, 103089(2024).
  34. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopeia of the People's Republic of China. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2005).
  35. Chen, Y., et al. Quality Control of Glehniae Radix, the Root of Glehnia Littoralis Fr. Schmidt ex Miq. Along its Value Chains. Front Pharmacol. 12, 729554(2021).
  36. Ru, J., et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminformatics. 6, 13(2014).
  37. Matsuura, S., et al. Negative effects of GM-CSF signaling in a murine model of t(8;21)-induced leukemia. Blood. 119 (13), 3155-3163 (2012).
  38. Tsiftsoglou, A. S. Erythropoietin (EPO) as a Key Regulator of Erythropoiesis, Bone Remodeling and Endothelial Transdifferentiation of Multipotent Mesenchymal Stem Cells (MSCs): Implications in Regenerative Medicine. Cells. 10 (8), 2140(2021).
  39. Yu, L., Wei, J., Liu, P. Attacking the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway for targeted therapeutic treatment in human cancer. Semin Cancer Biol. 85, 69-94 (2021).
  40. Alves, C. L., Ditzel, H. J. Drugging the PI3K/AKT/mTOR Pathway in ER+ Breast Cancer. Int J Mol Sci. 24 (5), 4522(2023).
  41. Guan, P., Cui, R., Wang, Q., Sun, Y. A 3D hydrogel loaded with exosomes derived from bone marrow stem cells promotes cartilage repair in rats by modulating immunological microenvironment. Nanfang Yike Daxue Xuebao. 42 (4), 528-537 (2022).
  42. Liu, Z., et al. Activating Angiogenesis and Immunoregulation to Propel Bone Regeneration via Deferoxamine-Laden Mg-Mediated Tantalum Oxide Nanoplatform. Acs Appl Mater Inter. 16 (19), 24384-24397 (2024).
  43. McCloskey, E. V., Guest, J. F., Kanis, J. A. The clinical and cost considerations of bisphosphonates in preventing bone complications in patients with metastatic breast cancer or multiple myeloma. Drugs. 61 (9), 1253-1274 (2001).
  44. Lin, L., et al. Characterization of Differences in Chemical Profiles and Antioxidant Activities of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera Based on Multi-Technique Data Fusion. Molecules. 29 (20), 4865(2024).
  45. Dabeek, W. M., Marra, M. V. Dietary Quercetin and Kaempferol: Bioavailability and Potential Cardiovascular-Related Bioactivity in Humans. Nutrients. 11 (10), 2288(2019).
  46. Li, W., et al. Flavonoids from Glycyrrhiza pallidiflora hairy root cultures. Phytochemistry. 60 (4), 351-355 (2002).
  47. Nian, Q., Liu, R., Zeng, J. Unraveling the pathogenesis of myelosuppression and therapeutic potential of natural products. Phytomedicine. 132, 155810(2024).
  48. Kellogg, C., Equils, O. The role of the thymus in COVID-19 disease severity: implications for antibody treatment and immunization. Hum Vaccin Immunother. 17 (3), 638-643 (2020).
  49. Liu, X., et al. Critical role of niche S100A8 for acute myeloid leukemia progression and hematopoiesis regeneration. Blood Adv. 9 (24), 6575-6589 (2025).
  50. Jafari, M., Ghadami, E., Dadkhah, T., Akhavan-Niaki, H. PI3k/AKT signaling pathway: Erythropoiesis and beyond. J Cell Physiol. 234 (3), 2373-2385 (2018).
  51. Novoplansky, O., et al. Activation of the EGFR/PI3K/AKT pathway limits the efficacy of trametinib treatment in head and neck cancer. Mol Oncol. 17 (12), 2618-2636 (2023).
  52. Weidemann, A., Johnson, R. S. Nonrenal regulation of EPO synthesis. Kidney Int. 75 (7), 682-688 (2009).
  53. Pallard, C., et al. Thrombopoietin activates a STAT5-like factor in hematopoietic cells. Embo J. 14 (12), 2847-2856 (1995).
  54. Stasi, R., et al. Thrombopoietic agents. Blood Reviews. 24 (4-5), 179-190 (2010).
  55. He, K., et al. G-CSF/GM-CSF-induced hematopoietic dysregulation in the progression of solid tumors. FEBS Open Bio. 12 (7), 1268-1285 (2022).
  56. Patsoukis, N., et al. Immunometabolic Regulations Mediated by Coinhibitory Receptors and Their Impact on T Cell Immune Responses. Front Immunol. 8, 330(2017).
  57. Geraud, A., et al. Clinical Pharmacology and Interplay of Immune Checkpoint Agents: A Yin-Yang Balance. Annu Rev Pharmacol. 61, 85-112 (2020).
  58. Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
  59. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte Accumulation in the Bone Marrow during Obesity and Aging Impairs Stem Cell-Based Hematopoietic and Bone Regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  60. Zhang, L., et al. Qingjie Fuzheng Granule attenuates 5-fluorouracil-induced intestinal mucosal damage. Biomed Pharmacother. 118, 109223(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Миелосупрессиявызванная циклофосфамидомсетевая фармакологиясеть белок-белковых взаимодействийKEGG-обогащениеонтология геновпуть PI3K-Aktпуть JAK-STATCD34-положительные клеткилейкопенияиндуцированная химиотерапией

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.