Методическая статья

Очистка экстравиллированных трофобластов HLA-G+ из тканей плаценты человека для фенотипирования и функционального анализа

545 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69545

⸱

13 марта 2026 г.

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол позволяет очищать, характеризовать и культурировать первичные экстравиллированные трофобласты HLA-G+ (ЭВТ) из децидуа-базалиса и хорионической мембраны человеческих терминовых плацент. Первичные культуры ЭВТ сохраняют жизнеспособность в течение 96 часов, что позволяет проводить совместное культивирование с сопоставленными образцами материнских иммунных клеток и последующий проточный цитометрический и молекулярный анализ их взаимодействий.

Аннотация

Интерфейс человека между матерью и плодом представляет собой уникальную иммунологическую среду, где иммунные клетки матери и экстравильозные трофобласты плода (ЭВТ) вступают в прямой клеточный контакт для установления и поддержания иммунной толерантности. EVT демонстрируют особый иммунофенотип, характеризующийся экспрессией толерогенных молекул, включая HLA-G, PD-L1 и PD-L2, которые играют ключевую роль в модулировании материнских иммунных ответов. Кроме того, человеческие ЭВТ экспрессируют HLA-C, который может быть напрямую распознан материнскими NK и T-клетками и способствует их активации. Важно, что в животных моделях, используемых для исследований, ортологов HLA-C или HLA-G, а трофобласты мыши не имеют экспрессии MHC. Таким образом, изучение фенотипических и функциональных свойств человеческого ЭВТ из тканей плаценты, как в физиологических, так и в патологических условиях имеет решающее значение для выяснения механизмов, лежащих в основе поддержания беременности и патофизиологии воспаления плаценты, связанного с преэклампсией, преждевременными родами, ограничением роста плода и аккретой плаценты. Этот протокол описывает комплексную методологию выделения и характеристики первичного человеческого ЭВТ из здоровой ткани плаценты, а также после преждевременных родов и преэклампсии. Он включает: (1) рассечение тканей плацентарной и хорионной оболочек; (2) ферментативное расщепление и подготовка суспензий из одной клетки; (3) очистка EVT методом FACS; (4) Фенотипическая характеристика с помощью высокомерной потоковой цитометрии; и (5) краткосрочное in vitro культурирование и совместное выращивание с иммунными клетками матери до 96 часов. Особое внимание уделяется получению высокочистых и жизнеспособных ЭВТ, подходящих для последующих применений, таких как иммунологические функциональные анализы, анализ экспрессии белков и генов. Внедрение этого протокола обеспечивает надёжную и воспроизводимую платформу для продвинутого понимания взаимодействия ЭВТ и материнских иммунных клеток, а также их влияния как в здоровых, так и при сложных беременностях.

Введение

Плацента человека включает четыре широкие категории типов трофобластов: стволовые клетки трофобластов, синцитиотрофобласти, вильные цитотрофобласти и экстравиллированные трофобласты (ЭВТ), каждая из которых имеет свои функции и фенотипические характеристики. Среди них ЭВТ обладает уникальными иммунологическими признаками, включая высокую экспрессию иммуносупрессивных молекул, таких как HLA-G, PD-L1, PD-L2 и представителей семейства B7, а также полиморфныхHLA-C 1,2,3,4,5,6. ЭВТ глубоко проникает в материнскую децидуальную ткань, спиральные артерии и миометрий, приводя их в прямой контакт с иммунными клетками матери7. ЭВТ характеризуется выраженной экспрессией полиморфного HLA-C — ключевого медиатора взаимодействия с материнскими T- и NK-клетками, которые необходимо контролировать для сохранения иммунной толерантности во время беременности. Будучи единственной классической молекулой MHC, экспрессируемой EVT, HLA-C также обеспечивает презентацию антигена в Т-клетках материнской памяти и поддерживает иммуннуюзащиту 8. Однако несколько исследований показали, что EVT напрямую увеличивает регуляторные Т-клетки CD4 и толерогенные состояния CD8 Т-клеток и NK-клеток, защищая себя от цитотоксичности и иммунногоотторжения 9,10,11,12,13. Кроме того, некоторые исследования сообщали об иммунных изменениях в иммунных клетках матери и ЭВТ плаценты, полученных после преэклампсии, преждевременных родов или выкидыша по сравнению со здоровымиконтролями 14,15,16,17,18,19,20,21 . В основе этих иммунологических изменений может лежать несколько вариантов, включая i) предшествующую аномалию Т-клеток матери; ii) нарушение иммуносупрессивных функций ЭВТ; или iii) нарушение взаимодействий между двумя типами клеток. Для прояснения основных механистических факторов необходимы экспериментальные модели ex vivo, позволяющие оценивать иммунные клетки матери и взаимодействия с ЭВТ.

Методы и подходы, представленные здесь, имеют ряд преимуществ по сравнению с существующими методами, использующими классические трофобластные линии, модели трофобластных стволовых клеток или органоиды. Самое главное — классические линии трофобластных клеток и трофобластные стволовые клетки не воспроизводят основные характеристики первичного ЭВТ, включая их профили экспрессииMHC 3,5,22,23. Во-вторых, сложные требования к среде человеческих трофобластных стволовых клеток (hTSC) и органоидных культур, включающих несколько молекулярных ингибиторов, напрямую влияют на функции иммунных клеток и фенотип, препятствуя адекватной оценке взаимодействий ЭВТ и иммунныхклеток 22,24,25,26,27 . Наконец, клеточное разнообразие культур hTSC после дифференцировки и внутренний характер органоидных структур плаценты позволяют иммунным взаимодействиям с трофобластами, не имеющими invivo значения, снижая ясностьисследований 22,27.

Здесь мы описываем методы очистки первичного HLA-G+ EVT из человеческих плацентарных тканей, что позволяет культурировать до 96 часов при наличии или отсутствии иммунных клеток. В среде отсутствуют молекулярные ингибиторы, влияющие на ЭВТ и функции иммунных клеток, сохраняя при этом их жизнеспособность. Этот подход предоставляет ценную платформу для прямых ex vivo исследований взаимодействия ЭВТ и иммунных клеток при здоровых и сложных беременностях. Ожидается, что он способствует выявлению ключевых факторов иммунной толерантности матери и плода и выявлению терапевтических целей для устранения воспаления плаценты.

Протокол

Институциональный экспертный совет Детской больницы Цинциннати одобрил этот исследовательский протокол (Одобрение #2021-0336), который соответствует требованиям по биоэтическим соображениям, обращению с личной информацией, инфекционными патогенами и процедурам информированного согласия в соответствии с законодательством США. Каждая лаборатория должна получить одобрение, соответствующее национальным исследовательским рекомендациям, перед началом эксперимента.

Этот протокол направлен на культивирование первичных HLA-G+ EVT, которые поддерживают жизнеспособность до 96 часов для вторичного функционального анализа, улучшая наш предыдущий протокол 2,28. Обратитесь к Hamilton et al.2 для установления клеточной линии, похожей на HLA-G+ EVT, и к Ikumi и др.28 для участия совпадающих децидуальных лимфоцитов матери.

1. Организуйте лабораторию (день 0).

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шкаф класса II для биобезопасности (BSL2) для обработки образцов.

  1. Установите две водяные бани при 39 °C и 37 °C. Установите увлажнённый инкубаторCO2 при температуре 37 °C.
  2. Подготовьте 1x PBS, промывку среду A, среду B, EVT-посева среды A, B и C (таблица 1 и таблица 2).
  3. Разморозить 15 мл раствора 10 мг/мл раствора ДНКазы I (Таблица 1) и 500 мл трипсина/ЭДТА 0,25% в водяной бане при 37 °C.
  4. Поместите контейнер с биоцидным/вируцидным раствором (например, 10% отбеливателя) в шкаф BSL2 для сбора жидких отходов. Поставьте контейнер для отходов с мешком для биологических опасностей в шкафу BSL2 для твёрдых отходов.
  5. Подготовьте впитывающие прокладки, инструменты для стерильной диссекции (изогнутые пинцеты и ножницы диаметром 6 1/2"), стерильные металлические фильтры, трубочные стойки и стерильные конические трубки объемом 50 мл в шкафу BSL2.
  6. Подготовьте три конических трубки по 50 мл (две по 1x PBS каждая и одну с промывкой A для сбора кусочков плацентарной ткани во время вскрытия).

2. Сбор образцов (день 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте человеческие плаценты с оболочками, полученными кесаревым сечением между 24 и 42 неделями беременности. Плацента, рожденная вагинально, может давать меньше ЭВТ.

  1. Начинайте обработку плаценты немедленно в шкафу BSL2, желательно в течение 1-2 часов после подачи, чтобы максимизировать выход жизнеспособных клеток. Поддерживайте плаценту при комнатной температуре в любое время.
  2. Осмотрите плаценту и, при необходимости, зафиксируйте её размер, вес и общий морфологический вид.

3. Рассечение тканей (день 0)

  1. Мембранная дисекция
    1. Разместите плаценту, обращённую к плодовой стороне вверх (видима часть для вставки пуповины). Удалите амнион — слой мембраны, расположенный ближе всего к плоду, вручную отслаивая её от латеральной мембраны к месту установки пуповины; Вырезать и убрать амнион.
    2. Разрежьте хориодецидуальную перепонку на полоски шириной 2 дюйма, начиная от основания плаценты вверх, при этом оставляя полоску перепонки прикреплённой к плаценте.
    3. Полоску хориодецидуальной мембраны наместите на оба пальца, обращённых децидуальной стороной вверх, и аккуратно соскреблите материнскую теменную мышцу с хориона стерильными изогнутыми щипцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте эффективно и не позволяйте хорионической мембране высохнуть.
    4. Соберите хорионическую мембрану в коническую трубку объёмом 50 мл с 20 мл Wash Medium A.
    5. Собирать париеталную децидуальную для выделения децидуальных лимфоцитов в конической трубке объёмом 50 мл с 20 мл PBS и следовать протоколу, описанному Икуми и др. для выделениялимфоцитов 28.
    6. Разрежьте хорионическую мембрану ножницами в трубке объёмом 50 мл, пока она не станет маленькими кусочками <2мм 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество осаждённой мембраны в идеале составляет 30 мл после резки.
    7. Сбросьте Wash Medium A и несколько раз промывайте PBS, пока супернатант не станет прозрачным.
  2. Рассечение плаценты
    1. Положите плаценту лицом к материнской стороне вверх и удалите тромбы. Резать кусочки базальной пластины плаценты (длина 2 см, ширина 2 см, глубина 0,5 см) стерильными ножницами, избегая некротических, кальцифицированных или ишемических частей.
    2. Положите кусок decidua basalis на пальцы, обращённые к ворсинкам (стороне плода) вверх. Аккуратно удалите ворсинки с децидуальной базалис ножницами, чтобы получить 2-3 мм мембраны, при этом на децидуальной базалисе останется только тонкий слой ворсинок.
    3. Соберите ткань decidua basalis в коническую трубку объёмом 50 мл с 20 мл PBS. Нарежьте decidua basalis до мелких кусочков <2мм 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество оседшей ткани в идеале составляет 15 мл после нарезки.
    4. Отбросьте PBS и несколько раз промывайте децидуальную базалис PBS, пока супернатант не станет прозрачным без видимой крови.
    5. Разделите 15 мл тканевой суспензии на две конические трубки по 50 мл (по 7,5 мл в каждой трубке).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол выделения лимфоцитов от decidua basalis отличается от этого протокола. См. протокол, приведённый в Hamilton и др. 2.

4. Пищеварение тканей (день 0)

  1. После окончательной промывки хорионической мембраны и decidua basalis в секции 3 заполните все трубки 1x PBS, центрифугайте их при 200 × г в течение 1 минуты и вылейте супернатантом.
  2. Приготовьте коктейль ферментов для переваривания тканей (таблица 1). Добавьте 150 мл тёплого коктейля для переваривания тканей в стеклянную бутылку объёмом 300 мл, затем 30 мл хорионической мембраны.
  3. Добавьте 20 мл тёплого DMEM/F20 и 80 мл тёплого коктейля Tissue Digestion Enzyme Cocktail в две стеклянные бутылки по 300 мл, а затем добавьте 7,5 мл decidua basalis в каждую бутылку.
  4. Инкубировать бутылку с хорионной мембраной в водяной бане при температуре 39 °C, а две бутылки с decidua basalis — в водяной бане при температуре 37 °C. Во время 15-минутной инкубации встряхивайте все бутылочки каждые 3-4 минуты (сначала пищеварение).
  5. После переваривания фильтруйте переваренную ткань через металлические сита (размер сетки 40). Добавьте в салфетки Medium B для промывания и растворения желатинового вещества.
  6. Фильтруйте клеточные суспензии над фильтром 100 мкм в трубки объёмом 50 мл, маркированные типом ткани и номером пищеварения.
  7. Переходите ко второму пищеварению, перемещая непереваренную ткань обратно в средние бутылки объемом 300 мл, добавляйте ферментный коктейль для переваривания тканей, как описано в шаге 4.2, и повторяйте шаги 4.2–4.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все ткани decidua basalis перемещаются в одну бутылку объёмом 300 мл. Разделяйте клетки, полученные после первого и второго пищеварения.
  8. Вращайте ячейку на 650 × g в течение 8 минут и отбрасывайте супернатант.
  9. Объедините гранулы (но разделяйте первую и вторую пищеварение отдельно) одного типа тканей и количества пищеварения в одну трубку. Заполните Medium B до 25 мл.

5. Градиент плотности Фиколла (день 0)

  1. Подготовьте четыре конических трубки по 50 мл с маркировкой типа ткани и номером пищеварения. Налейте 12 мл Ficoll в трубки.
  2. Аккуратно загрузите подвески ячеек на Ficoll. Центрифугуйте трубы при 800 × г в течение 20 минут (комнатной температуры) без тормоза.
  3. Аккуратно переместите клеточный слой на границе Фиколл и среду в чистые конические трубки объёмом 50 мл, маркированные типом ткани и номером пищеварения после центрифугирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно собирайте слой, не нарушая интерфейс, используя стерильную трансферную пипетку.
  4. Заполните трубки Wash Medium B и центрифугуйте при 650 × г на 8 минут.
  5. Сбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточные гранулы с оставшейся средой (примерно 0,5 мл). При необходимости держать примерно 10% клеточной суспензии отдельно для фенотипирования и использовать 90% для сортировки клеток. Подсчитайте клетки, чтобы определить количество и жизнеспособность ячеек.

6. Сортировка EVT (день 0)

  1. Поместите ревзвешенные клеточные гранулы в стерильные FACS-трубки, маркированные типом ткани и номером пищеварения. Добавьте анти-CD45-BV785 (1:100), анти-HLA-G-APC (1:125) и анти-EGFR1-BV711(1:160) (Таблица 3). Инкубировать трубки 20 минут при комнатной температуре в темноте.
  2. Добавьте 1 мл Wash Medium B и центрифугуйте при 650 × г на 8 минут.
  3. Сбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточные гранулы с помощью Wash Medium B, чтобы получить примерно 1 × 106 клеток / мл.
  4. Фильтруйте клетки через сито 40 мкм непосредственно перед сортировкой клеток и сортируйте CD45-HLA-G+EGFR+ EVT в трубки с 1 мл среды культуры EVT в соответствии с стратегией гейтинга, описанной на рисунке 1A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной жизнеспособности трофобластов следует использовать сортировщик ячеек jet-in-air (например, Bigfoot или MoFlo) с соплом диаметром 100 мкм. Сортировщики на основе флюидных клеток (например, DB S6 или Sony Nano) могут снижать жизнеспособность трофобластов, тогда как магнитные методы сортировки клеток (например, Easysep или MACS) могут сохранять жизнеспособность при низкой чистоте, что приводит к чрезмерному росту стомальных клеток в культурах.
  5. Центрифугуйте трубки FACS отсортированными клетками, сбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточные гранулы с помощью EVT Cultural Medium B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к следующему разделу, чтобы подготовить культурные пластины во время сортировки ячеек.

7. Первичная культура HLA-G+ EVT для вторичного анализа (дни 0–1)

  1. Покрыть колодцы плоскодонных 96-колодцевых клеточных культивных пластин 50 мкл фибронектина (таблица 2) при комнатной температуре в течение 45 минут.
  2. Удалите фибронектин и добавьте суспензию клеток с EVT Cultural Medium B в колодцы. Стремитесь к 0,5 × 105 базалисов клеток EVT/200 мкл среднего/скважины и 1,0 × 105 хорионических клеток EVT/200 мкл среднего/скважины. Инкубировать пластины клеточной культуры в течение 12–18 часов в увлажнённом инкубаторе сCO2 при 37 °C (инкубация в день 0).
  3. В первый день удалите среду B, аккуратно промыйте клетки 1x PBS и добавьте EVT Cultural Medium C с Т-клетками или без них для дальнейшего (сов)культивирования (см. раздел 8).

8. Совместная культура первичного HLA-G+ EVT с активированными Т-клетками (дни 0–4)

  1. Стимуляция CD8+T-клеток от донора3-х сторон (дни 0-1)
    1. Во время сортировки HLA-G+ EVT (0-й день) изолируйте периферические популяции иммунных клеток крови из образцов материнской крови или неродственных доноров, используя упомянутый человеческий коктейль обогащения CD8+ T-клеток (см. таблицу материалов), после чего проводите центрифугирование с градиентом плотности Фиколла или сортировку FACS.
    2. Престимулируйте T или NK-клетки анти-CD3/28 шариками или цитокинами (например, IL2, IL15, IL12 или IL18) в среде лимфоцитной клеточной культуры по мере необходимости.
  2. Совместная культура ЭВТ с активированными Т-клетками (дни 1-4)
    1. Подсчитайте количество лимфоцитов и создайте суспензии клеток с помощью среды для культивирования лимфоцитов при концентрации 0,5 × 106 / мл. Добавьте 1 × 105 лимфоцитов в первичные колодцы EVT (объём среды EVT C: среда для культивирования лимфоцитов = 1:1). Инкубировать пластины в течение 24-72 часов в увлажнённом инкубаторе сCO2 при 37 °C.
    2. Собирать лимфоциты для анализа потоковой цитометрии и собирать супернатанты для анализа цитокином.
    3. Собирайте EVT с помощью трипсинизации и собирайте его в трубки FACS для анализа проточной цитометрии на 4-й день (см. раздел 9).

9. Фенотипирование первичного HLA-G+ EVT

ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно приступайте к проточному цитометрическому окрашиванию и держите EVT и все необходимые растворы при комнатной температуре постоянно.

  1. Центрифугуйте трубки FACS с первичным EVT при 650 × г в течение 7 минут и отбросьте супернатант.
  2. Добавьте раствор для окрашивания каспазы 3/7 (Таблица 3) в клеточные гранулы и аккуратно перемешайте.
  3. Окрашивайте клетки антителами (Таблица 3), аккуратно перемешайте их и инкубируемые ещё 20 минут (всего 30 минут инкубации).
  4. Добавьте 1 мл EVT Cultural Medium C, центрифугуйте трубки при температуре 650 × г в течение 7 минут и выбросьте супернатант.
  5. Повторно суспензировать клеточную гранулу с помощью 0,4 мл среды EVT Cultural Medium C. Добавьте раствор окрашивания 7-AAD (5 мкл/суспензия клетки) в трубки и немедленно проанализируйте на проточном цитометре.

Результаты

Ожидаемые выходы ячеек

Из 15 мл децидуальной базалии ожидаемый HLA-G+ EVT даёт 0,1-0,3 × 106 клеток при первом расщеплении и 0,1-0,6 × 106 клеток при втором расщеплении (всего 0,2-0,8 × 106 клеток). Из 30 мл хорионической мембраны ожидаемые выходы HLA-G+ EVT составляют 0,4-1,0 × 106 клеток при первом расщеплении и 0,4-1,5 × 106 клеток при втором расщеплении (всего 0,8-2,5 × 106 клеток). Ожидается, что доля каспазы 3/7-7-AAD живого ЭВТ в изолятах составит 90-95%.

Основная культура HLA-G+ EVT

Анализ проточной цитометрии маркеров линии (HLA-G, HLA-C, EGFR) и маркеров клеточной гибели показал, что этот протокол обеспечивает жизнеспособную первичную культуру EVT до 4-го дня (96 часов после нанесения отсортированного EVT) (рисунок 1B-D). Репрезентативные световые микроскопические изображения первичной хорионической и d.basalis HLA-G+ EVT показаны после 24, 48 и 72 часов посева (рисунок 2A-F).

Совместная культура первичного HLA-G+ EVT с Т-клетками

Этот протокол повысил жизнеспособность первичного EVT через 96 часов после выделения из плаценты, что стало улучшением по сравнению с нашим предыдущимотчетом 1,2,10. Таким образом, он позволяет анализировать ответы на ЭВТ после совместной культуры с предстимулированными лимфоцитами, имитируя острое воспаление на границе матери и плода. EVT экспрессирует полиморфные HLA-C, а также иммуносупрессивные коингибирующие молекулы, такие как PD-L1, PD-L2, PVR (также известный как CD155), B7H3 и HLA-E, определяемые внеклеточным проточным цитометрическим окрашиванием (рисунок 3A, B). ЭВТ увеличил экспрессию HLA-C, а также PD-L1, PD-L2 и HLA-E, но не увеличил экспрессию PVR и B7H3 при совместном культивировании с активированными лимфоцитами в течение 72 часов согласно разделу протокола 8 (рисунок 4A,B). Кроме того, не наблюдалось увеличения смертности от ЭВТ, что показано при окрашивании 7AAD и каспазой 3/7 (рисунок 4C,D).

Рисунок 1
Рисунок 1. Стратегия гейтинга для сортировки клеток EVT и потоковой цитометрии после культивирования отсортировала EVT. (A) Репрезентативная стратегия гейтинга для сортировки decidua basalis EVT и хорионического EVT. R1 — это живой элемент в диаграмме рассеяния напрямую. R2 — это ворота для исключения лейкоцитов CD45+. R3 — это элемент HLA-G+EGFR+EVT. R4 — это 7-AAD-caspase3/7- живой EVT. Хотя затвор R4 не обязательно необходим для сортировки, здесь он демонстрируется для демонстрации жизнеспособности первичного EVT. (B) Репрезентативные графики проточной цитометрии сортированных HLA-G+EGFR+EVT, после 96 часов культуры in vitro. (C,D) Частоты каспазы 3/7-7-AAD — живой EVT в период сортировки (0-й день) и 96 часов культивирования (4-й день). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Морфология ЭВТ во время культуры in vitro . Репрезентативные световые микроскопические изображения хорионического ЭВТ после (A) 24 ч, (B) 48 ч и (C) 72 часа посева и decidua basalis EVT после (D) 24 ч, (E) 48 и (F) 72 часов культуры. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Иммунологические фенотипы первичного ЭВТ . (A) Репрезентативные графики потока HLA и коингибирующих молекул на первичном ЭВТ, определяемые методом окрашивания внеклеточной цитометрии потока (день 0). (B) Парные линейные графики показывают чистое MFI контроля IgG и полное окрашивание каждого маркера от d. basalis EVT (синий) и хорионического EVT (зелёный) на день 0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Иммунологические фенотипы первичного ЭВТ с активированными лимфоцитами или без них (день 4). (A) Репрезентативные графики потока ЭВТ после 72-часовой культуры (день 4) с активированными сторонними лимфоцитами или без них. (B) Парные линейные графики показывают MFI EVT с активированными сторонними лимфоцитами или без них. Синие графики обозначают decidua basalis EVT, а зелёные — хорионический EVT. (C) Репрезентативные графики потоковой цитометрии для каспазы 3/7-7-AAD — живой EVT с активированными сторонними лимфоцитами или без них на 4-й день. (D) Парные линейные графики показывают частоты каспазы 3/7-7-AAD — живого EVT с активированными сторонними лимфоцитами или без. Синие графики обозначают decidua basalis EVT, а зелёные — хорионический EVT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Ключевые реагенты для рассечения тканей и пищеварения. См.также 1, 2, 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2. Ключевые реагенты для культуры ЭВТ и совместного культивирования с Т-клетками. См.также 1, 2, 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3. Ключевые антитела и реагенты для сортировки и анализа проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Критические шаги в протоколе

Для получения жизнеспособного ЭВТ крайне важно сразу после родов начать выделение клеток из плаценты и выполнять все процедуры — от выделения до сортировки при комнатной температуре. Поскольку ЭВТ крупнее и более адгезивны по сравнению с лимфоцитами, при сортировке следует соблюдать следующие меры предосторожности, чтобы избежать закупорки: i) пропускать суспензию клетки через сито размером 40 мкм перед сортировкой, ii) использовать среду с ДНКазой для суспензии клеток, iii) избегать чрезмерной концентрации суспензий клеток (желательно ~1 × 10⁶ клетки/мл), и iv) использовать размер сопла не менее 100 мкм. Сортировщик Jet-in-Air (например, Bigfoot, MoFlo) обеспечивает более высокий жизнеспособный выход EVT по сравнению с сортировщиками клеток на основе жидкости (например, сортировщики BD, Sony Nano).

Модификации и устранение неисправностей метода

Переваренная или недостаточно перевариваемая после первого переваривания decidua basalis EVT

Эффективность пищеварения ткани decidua basalis варьируется между плацентами. Переваренные ткани образуют крупные, липкие заполнятели, которые трудно проходить через металлическое сито. Обычно добавление 10-30 мл промывочной среды B помогает рассредоточить эти заполнители во время фильтрации. Если это не решает проблему, добавляйте 1-2 мл ДНКазы непосредственно в ткани. Если первое пищеварение приводит к переварению, уменьшите концентрацию ферментного коктейля для переваривания тканей с 80% до 70% во втором. После фильтрации первого переваривания остаточный объём ткани должен уменьшиться примерно до половины. Если остаточный объём ткани остаётся неизменным, увеличите концентрацию ферментного коктейля для переваривания тканей с 80% до 90-100% во время второго пищеварения. Ткани хорионической оболочки стабильно перевариваются по плацентам. Поэтому корректировка концентрации фермента тканей обычно не требуется.

Для пищеварения больших объёмов тканей, чем описано в протоколе выше

Для пищеварения более 30 мл хорионной мембраны или более 15 мл ткани decidua basalis используйте дополнительные флаконы с коктейлем ферментов для переваривания тканей. Увеличение объёма тканей в одной бутылке обычно приводит к недоварению.

Ограничения метода

Ожидается снижение результатов ЭВТ при плаценте, рожденных вагинально. EVT нельзя криоконсервировать до или после сортировки, так как они чувствительны к стрессу замораживания и оттаивания, что значительно ограничивает их жизнеспособность и функционирование. Таким образом, этот протокол не включает точки остановки.

Значение метода по сравнению с существующими методами

Ранее мы публиковали протокол установления клеточных линий, похожих на HLA-G+ EVT, из терминовых плацент с использованием среды для культуры тканей B и пластин, покрытых коллагеном. Однако несколько ингибиторов в среде и коллагене потенциально влияют на функцию Т-клеток в системекокультуры 2. Другие предыдущие отчёты, не использовавшие среду для культуры тканей B, позволяли оценивать Т-клетки в совместной культуре, но не ЭВТ из-за изменчивостиклеток 1,10. Преимущество данного протокола заключается в том, что он минимизирует влияние культурных средств и одновременно способствует формированию жизнеспособного первичного EVT. Этот протокол предоставляет экспериментальную платформу для изучения иммунологической функции ЭВТ и их функциональных изменений в ответ на окружающие иммунные клетки — область, которая остаётся недостаточно изученной.

Раскрытие информации

В этом исследовании нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Шерри Торнтон и исследовательский центр цитометрии потока в отделении ревматологии Медицинского центра Детской больницы Цинциннати за всю их помощь в проточной цитометрии и сортировке клеток; Все медсёстры и врачи участвующих больниц за их усилия по сбору плацентарных материалов; Всем членам лаборатории Тилбурга и преподавателям иммунологии CCHMC за полезные обсуждения; Эта работа была поддержана NIH R01HD116852 (T.T.); Фонду исследований детей Цинциннати (T.T.); Премия Burroughs Wellcome Fund Next Gen Pregnancy #NGP10115 (T.T.); и совместный грант March of Dimes Ohio (T.T.). S.T. поддерживается грантами JSPS KAKENHI с номерами 22KK0287 и 25K12697.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Центрифужные пробиркиThermo Fisher14-955-238
-20 °C морозильниклюбой поставщик
37 °C 5% CO2 Инкубаторлюбой поставщик
4 °C холодильниклюбой поставщик
50 мл Конические центробежные пробиркиThermo Fisher14-955-240
55 мМ β-МеркаптоэтанолGibco21985-023
6 ½” ножницылюбой поставщик
7-AAD Способ окрашивания жизнеспособностиBiolegend420403
-80 °C морозильник любой поставщик
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, мышиный, IgG1 k контроль изотипаBiolegend400144
APC/Cy7 крысиный IgG2a, κ контроль изотипаBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE анализатор клетокBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichA3294
Шафа биобезопасности BSL2любой поставщик
BV605 Мышиный IgG1, κ контроль изотипаBD Biosciences562652
BV750 Мышиный IgG1, κ контроль изотипаBiolegend400105
BV785 Мышиный IgG1, κ контроль изотипаBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Ситечко для диссоциации клетокMillipore Sigma CD1-1KT (размер сетки 60)
Ситечко для клеток 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent каспаза-3/7 зеленое средство обнаруженияinvitrogenC10423
Центрифугалюбой поставщик
CHIR99021, 3мМSigma-AldrichSML 1046-5MG
Пипетки с изогнутым концомлюбой поставщик
Диметиловый сульфоксид (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
ДНКаза ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 для расширения и активации Т-клетокThermo Fisher Scientific11131D
ЭФР, человеческий, рекомбинантный, без животныхPeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
Программное обеспечение FACS DIVABD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
Программное обеспечение FlowJoFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Человеческая АВ сывороткаCorning35060CI
Человеческий хорионический гонадотропин (хГЧ) (2500 МЕ/мл)Sigma-AldrichC1063
Человеческий фибронектин (1 мг/мл)Corning354008
Человеческий рекомбинантный ИЛ-2PeproTech200-02
Инсулин-трансферрин-селеновый раствор, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Аскорбиновая кислотаSigma-AldrichA0278
Магнитный сепараторpromegaZ5342
Новорожденная сыворотка телёнка (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 мышиный, IgG1 k, контроль изотипаBiolegend400126
PE/Dazzle594 Мышиный IgG1, κ контроль изотипаBiolegend400176
Пенициллин и стрептомицин Gibco15140-122
Фосфатный буфер с солью 10XThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 мМApex-Bio

Ссылки

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HLA GFACS

Похожие статьи