Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка неоваскулярных тканей из человеческих глиомных тканей для количественного протеомического анализа ангиогенеза опухолей

496 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69547

⸱

20 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Precision Oncology, Shandong Cancer Hospital and Institute, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 2Shandong Provincial Key Medical and Health Laboratory of Ovarian Cancer Multiomics, & Jinan Key Laboratory of Cancer Multiomics, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 3School of Medicine, Wayne State University, 4Department of Pathology, The Second Xiangya Hospital, Central South University, 5Hunan Clinical Medical Research Center for Cancer Pathogenic Genes Testing and Diagnosis,, 6Department of The 1st General Surgery, The Third Xiangya Hospital, Central South University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол успешно подготовил достаточное количество высококачественной неоваскулярной ткани из образцов глиомы с использованием микродиссекции лазерного захвата для количественного протеомического анализа ангиогенеза опухоли, преодолев ограничения исследований, традиционно сосредоточенных преимущественно на ангиогенных факторах, и предоставив масштабный протеомный профиль глиомного ангиогенеза.

Аннотация

Глиома представляет собой первичные злокачественные опухоли центральной нервной системы с высокой частотой заболеваемости и смертностью. Опухолевой ангиогенез является отличительной чертой патофизиологии глиомы и является важным событием в опухолевой среде. Аномальная структура неоваскуляризации опухоли выполняет две функции: источник питательных веществ и метастатический портал, обеспечивающий вторжение опухолевых клеток в кровоток. Антиангиогенезная терапия — актуальная тема в области рака. Большинство предыдущих исследований сосредоточены на активирующих и ингибиторных факторах ангиогенеза опухоли; однако это лишь проясняет ангиогенез опухолей в очень ограниченном диапазоне. Аномальная экспрессия белков или посттрансляционные модификации способствуют аномальной морфологии кровеносных сосудов при глиоме. Этот протокол использовал лазерно-захватную микродиссекцию (LCM) для выделения и очистки достаточного количества неоваскулярных тканей из тканей глиомы, что применялось для изотопно-маркированного количественного протеомического анализа с целью выявления дифференциально экспрессируемых белков в неоваскулярных тканях глиомы по сравнению с контрольными группами. Эти данные служат важнейшей научной основой для разъяснения патологических механизмов ангиогенеза опухоли, обнаружения антиангиогенных терапевтических целей и построения биомаркеров, основанных на ангиогенезе опухоли.

Введение

Глиомы — это высокогетерогенные опухоли центральной нервной системы (ЦНС), происходящие из глиальных клеток, которые обеспечивают структурную и метаболическую поддержкунейронам 1, и гистологически классифицируются на подтипы: астроцитомы, олигодендроглиомы и эпендимомы2. Согласно системе оценки ВОЗ, глиомы I и II степеней — это низкостепенные глиомы (LGG), обычно характеризующиеся медленными темпами роста и потенциальной долгосрочной стабильностью, часто подверженными хирургической резекции в зависимости от анатомического расположения. В отличие от этого, III и IV степени — это глиомы высокой степени (HGG), преимущественно недифференцированные и злокачественные, с высокоинвазивным поведением и плохимпрогнозом 3. Современные методы лечения остаются ограниченными и в значительной степени неэффективными; Хотя максимальная безопасная резекция в сочетании с послеоперационной лучевой терапией/химиотерапией умеренно улучшает прогноз, значительные ограничения и токсичность сохраняются из-за диффузного инфильтртративного роста опухолей и неясных границ, препятствующих радикальнойрезекции 4,5. Человеческие глиомы, особенно высокостепенные глиомы, представляют собой высокососудистые злокачественные опухоли, рост, пролиферация и инвазия которых сильно зависят от их аномальной неоваскуляризации, что является критически характерной чертой злокачественностиглиомы 6,7. Исследование ангиогенеза опухоли, направленное на цель, имеет значительные научные достоинства для терапевтических прорывов.

Ангиогенез по сути включает пролиферацию, миграцию и дифференцировку эндотелиальных клеток под определёнными стимулами, при этом исследования сосредоточены на регуляторах: (i) индукторах, включая сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)8, вазорин (VASN)9, фактор гипоксии-индуцирующий 1 (HIF1)10, трансформирующий фактор роста β (TGF-β)11, эндокан12, тромбоцитарный фактор роста (PDGF)13 и эпидермальный фактор роста (EGF)14; и (ii) ингибиторы, включая ангиостатин15, эностатин16, рецептор тромбоцитарного фактора-1 (TSP-1)17, а также тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMPs)18. В клинических испытаниях опухолей мозга фазы I/II/III большинство антиангиогенных препаратов нацелены на VEGF-сигнализацию из-за её центральной роли в ангиогенезе, что проявляется бевацизумабом — моноклональным антителом, подавляющим неоваскуларизацию через блокадуVEGF 19,20,21. Однако недавние исследования фазы II/III не показали значимой общей выживаемости у пациентов с выраженной глиобластомой, получающих бевацизумаб плюс ломустин по сравнению с одним тольколомустаном 19,20,21,22. Критически важно, что терапия против VEGF улучшает сосудистые аномалии, но лишь подавляет ангиогенез без прямой цитотоксичности опухолей и может вызвать устойчивость к лечению. Следовательно, использование одного или нескольких ангиогенных регуляторов не приводит к радикальному исцелению; Эффективные стратегии требуют одновременного подавления ангиогенеза и блокады инвазии и метастазирования опухолей через сосудистые пути. Диагностическая и прогностическая ценность белков при глиомах хорошо доказана, однако лечение злокачественной глиомы за десятилетия достигло ограниченного прогресса.

Протеомика может глобально анализировать все белки в биологических образцах, включая профили экспрессии, посттрансляционные модификации (PTM) и взаимодействия, используя методы масс-спектрометрии (MS), включая подходы сверху вниз (TDP) и снизу вверх (BUP). Высокопроизводительный рассеянный склероз позволяет выявлять десятки тысяч белков за один запуск, что делает его необходимым для изучения механизмов опухолей и терапевтической идентификации целей. Содержание белка и его ПТМ можно выявить в тканях глиомы и жидких биопсиях, таких как кровь и еёпроизводные 23, 24, 26 в спинномозговой жидкости имоча 27. Для опухолевых сосудистых систем патологические сосудистые изменения вызывают аномальные экспрессии белков и ПТМ. Изменения белка при неоваскуляризации глиомы можно идентифицировать с помощью протеомики, которая способствует разработке протокола для надёжного протеомного профилирования глиомной неоваскуляризации.

Однако неоваскулярные ткани являются лишь одним из компонентов всей ткани глиомы. Выделение и очистка неоваскулярных тканей из всей ткани глиомы — ключевой этап для точного количественного протеомного анализа ангиогенеза глиомы. Микродиссекция лазерного захвата (LCM)28,29,30,31 — эффективный метод изоляции и очистки неоваскулярных тканей из целых тканей глиомы. Очень сложно получить достаточное количество неоваскулярных тканевых белков для количественной протеомики. В 2007 году исследовательская группа попыталась использовать LCM для отделения неоваскулярных тканей от глиомы IV степени для протеомического анализа, который выявил только четыре белка с MS32. Впоследствии, в 2012 году, они непрерывно использовали LCM для обогащения неоваскулярных тканей глиом IV степени для количественного протеомического анализа, который выявил только 29 белков с MS33. Эти два исследования протеомных исследований ангиогенеза глиомы показывают очень низкую протеомную пропускную способность при глиомном ангиогенезе, что не может отражать сложный протеомный ландшафт глиомного ангиогенеза.

Этот протокол разработал процедуру, позволяющую получить достаточное количество неоваскулярных белков для количественного протеомного анализа глиомного ангиогенеза, тем самым создавая масштабный протеомный ландшафт опухолевой ангиогенеза. Это имеет значительную научную ценность для открытия эффективных биомаркеров, основанных на ангиогенезе, и терапевтических мишеней/препаратов/препаратов против ангиогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол, включающий образцы человеческих тканей, был одобрен Комитетом по медицинскому этическому обзору Первого медицинского университета Шаньдуна (Одобрение No R202211090133), и было получено информированное согласие от пациентов и их семей. Образцы глиомы, использованные в этом исследовании, были получены из нейрохирургических резекций отделения нейрохирургии больницы Сянья Центрального Южного университета, включая 7 случаев тканей астроцитомы III степени. Нормальные контрольные сосуды (n = 3) были взяты из микрососудов внутри повреждённой мозговой ткани, удалённых в результате черепно-мозговой травмы. Все пациенты были впервые без предварительной лучевой терапии или химиотерапии до операции, и все они были диагностированы патологоанатомическим отделением больницы Сянъя Центрального Южного университета. Три нормальные сосудистых ткани контроля получаются в результате нейрохирургической резекции очень крошечных сосудов из нормального повреждения мозга внешней силой (без глиомы) в больнице Сянья. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Использование LCM для выделения неоваскулярных тканей от человеческих глиомных тканей

  1. Подготовьте слайд LCM: Вручную покрыть мембрану полиэтиленнафталата (PEN) на многоразовых металлических затворах и хранить покрытые стекли при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее покрытые металлические стекли будут использоваться для прямого прикрепления замороженных срезов ткани.
  2. Приготовьте раствор для окрашивания толуидина синим (0,5%): растворите 0,25 г толуидина синего в 40 мл ddH₂O. Добавьте одну таблетку ингибитора протеазы и перемешайте до полного растворения. Отрегулируйте объём до 50 мл с помощью ddH₂O, фильтруйте и храните на льду.
  3. Обработка ткани: Поддерживайте криостат при рабочей температуре (-25 °C камеры/головка образца). Извлечь ткань глиомы из хранилища при температуре -80 °C, перенести на лёд, удалить кровь с помощью фильтрующей бумаги и выбрать подходящие блоки тканей для вложения.
  4. Протокол вложения тканей: диск образца предварительного охлаждения. Нанесите встраивающую среду и быстро введите тканевой блок. Заморозьте весь блок при -25 °C на 10 минут для затвердевания.
  5. Ткани сечения и сосуды с экраном: ткани сечения толщиной 8 мкм. Срезы тканей монтируются на стандартные стекла, окрашивают ткани раствором для окрашивания толуидина синим и проводят скрининг неоваскулярных сосудов под оптической микроскопией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если сосудов не обнаружено, отбросьте 3–5 срезов ткани и повторяйте цикл окрашивания, пока не появятся области неоваскулярных сосудов.
  6. Закрепить срез ткани с положительным сосудом на подготовленный слайд LCM: перенесите срезы с положительным сосудом на PEN-покрытые стекли LCM, запечатают, маркируют и храните при -80 °C.
  7. Фиксировать срезы тканей, установленные на слайде LCM, в предварительно охлаждённом этаноле 70% (4 °C, 1–2 минуты); слив и окрашивание толуидиновым синим цветом 0,5% (4 °C, 30 с); Сливите морилку, дважды прополосните в ddH₂O (4 °C; две отдельные ванны для промывания), слийте жидкость, инкубируют в растворе ингибитора протеазы (30 с) и храните при -80 °C.
  8. Заранее запустите прибор LCM, нагрейте 30 минут, используйте твердотельный инфракрасный лазер для предварительного нагрева ещё 30 минут, а затем установите устройство для сбора микроцентрифуг на 500 мкл.
  9. Загрузите срезы LCM, установленные в образце ткани (хранящиеся при -80 °C) на подготовленный инструмент LCM, и корректируйте фокус на неоваскулярных сосудах в тканях глиомы с помощью совместимого программного обеспечения.
  10. Точно обведите линию лазерной маркировки вдоль внешнего края неоваскулярного сосуда (избегайте сосудистой стенки), используйте лазер для обжига и разделения неоваскулярных сосудов, а затем собирайте их в крышку трубки EP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте второй лазерный ожог, чтобы убедиться, что неоваскулярные сосуды полностью отслоились.
  11. Инвертируйте и герметизируйте собранный пробирку неоваскулярного сосуда, а затем храните его в морозильнике при температуре -80 °C.

2. Извлечение белков из неоваскулярных тканей глиомы, выделенных LCM, и количественная оценка содержания белка

  1. Приготовьте буфер для экстракции белка, содержащий 4% додецилсульфата натрия (SDS), 1 мМ дитиотрейтола (DTT) и 150 мМ Tris-HCl (pH 8,0).
    ПРИМЕЧАНИЕ: SDS — это опасная пыль, которая сильно раздражает глаза, кожу и дыхательные пути, которые необходимо взвешивать в выхлопной вытяжке; а ДТТ — это раздражитель, который нужно взвешивать в выхлопной жидкости.
  2. Ресуспензировать ткани неоваскулярных сосудов глиомы, собранные LCM, в буфере экстракции. Соник на ледяной водяной ванне в течение 1 минуты для полного лизиса.
  3. Центрифугировать при 16 000 x g в течение 10 минут и перенести супернатант в новые микроцентрифугальные трубки.
  4. Аликвот минимальный супернатант для количественного определения белков. Добавьте DTT в оставшийся супернатант (итоговая концентрация: 1 мМ DTT), аккуратно перемешайте с помощью пипетки, чтобы избежать пузырей. Аликвот и хранить при -80 °C.
  5. Проведите анализ белков бицинхониновой кислоты (BCA), следуя следующим следующим шагам:
    1. Подготовьте рабочий раствор (реагент A:B = 50:1).
    2. Приготовьте стандартную дозу альбумина для сыворотки крупного рогатого скота (BSA) (0,5 мг/мл).
    3. Добавьте соответствующие решения согласно таблице 1.
    4. Смешайте образцы/стандарты с рабочим раствором и перенесите на пластину на 96 лунок.
    5. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут.
    6. Измерьте поглощение при 562 нм.
    7. Рассчитывайте концентрации по стандартной кривой.

3. Использование количественной протеомики для анализа подготовленных неоваскулярных белков

  1. Подготовьте образцы триптических пептидов извлеченных неоваскулярных белков.
    1. Добавьте ледяной ацетон в каждый экстракционный образец белка (опухоль; контрольный) (образец: ацетон = 1:5, v/v), тщательно перемешайте и инкубуйте при -20 °C в течение 1 часа. Центрифуга при 12 000 x g (4 °C) в течение 15 минут. Отбросить супернатант для удаления белковых реагентов (SDS, DTT и Tris-HCL) и ресуспензировать гранулу в буфере растворения объемом 20 мкл с 1 мкл 1% SDS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ацетон с достаточной вентиляцией при ношении защитных очков, избегайте источников возгорания и утилизируйте отходы в специальном, искроустойчивом контейнере.
    2. Добавьте к каждому образцу 2 мкл восстановительного реагента (DTT), тщательно перемешайте и инкубуйте при 60 °C в течение 1 часа. Добавьте 1 мкл реагента, блокирующего цистеин (йодоацетамид), затем инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.
    3. Добавляйте трипсин (белок: трипсин = 20:1, v/v) в каждый образец. Смешайте вихрь и инкубируем при 37 °C ночью.
  2. Используйте изобарические тарги для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRAQ) реагентов для маркировки подготовленных триптических пептидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для маркировки образцов триптических пептидов (опухоль; контрольные) используются шестиплексные iTRAQ реагенты (метки Plex 113, 114, 115, 116, 117 и 118), каждый тип образца маркируется три раза (Таблица 2).
    1. Восстановите каждую трубку реагента iTRAQ с 50 мкл изопропанола.
    2. Добавьте образцы триптических пептидов в соответствующие реагентные пробирки, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
    3. Прекратите реакции, добавив сверхчистую воду объемом 3×, затем инкубуйте 30 минут при комнатной температуре.
    4. Также объедините шесть промеченных образцов, тщательно перемешайте и лиофилизуйте.
  3. Используйте сильный катионообмен (SCX) для фракционирования образца триптического пептида, маркированного iTRAQ.
    1. Восстановить лиофилизированные пептиды в растворе A объёмом 2 мл (10 мМ KH₂PO₄, 25% ACN, pH 2,7). Нагрузка на сульфоэтил-функционализированный катионообменный столб (4,6 × 100 мм, 5 мкм, 200 Å).
    2. Элют с постоянным расходом 1 мл/мин с использованием раствора B (500 мМ KCl, 10 мМ KH₂PO₄, 25 % ACN, pH 2,7): 0 %→10 % (2 мин) → 10 %→20 % (25 мин) → 20 %→45 % (5 мин) → 50 %→100 % (5 мин). Проводите мониторинг на 214 нм на протяжении всего процесса, собирайте каждую минуту на пробирку, всего 30 фракций.
    3. Концентрируйте каждую фракцию методом вакуумного центрифуга, а затем восстанавливайте с 40 мкл трифторуксусной кислоты (TFA) с добавлением 40 мкл (v/v). Все 30 порций хранятся в морозильнике при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TFA сильно коррозийна и токсична, вызывает серьёзные повреждения кожи и глаз, а также раздражает дыхательную систему; Он должен обрабатываться в выхлопчике с соответствующими средствами индивидуальной защиты, включая кислотостойкие перчатки, очки и лабораторный халат, а отходы должны собираться как кислотные отходы.
  4. Используйте LC-MS/MS для анализа каждого фракционированного образца пептида.
    1. Для обезсоли используйте картридж C18 с обратной фазой для извлечения твердой фазы (стандартная плотность, I.D. слоя 7 мм, объём 3 мл).
    2. Используйте колонку обратной фазы жидкой хроматографии (LC) C18 (длина 10 см, диаметр 75 мкм, смола 3 мкм) для элюирования 10 мкл каждой фракции раствором C (0,1 % муравьиной кислоты) и градиентом раствора D (80 % ацетонитрила и 0,1 % муравьиной кислоты) со скоростью 250 нл/мин в течение 140 минут.
    3. Онлайн-ввод пептидов, разделённых с LC, в высокоразрешающий масс-спектрометр для анализа MS/MS.
    4. Преобразуйте необработанные спектральные файлы (.raw), сгенерированные Q Exactive, в формат .mgf с помощью Proteome Discoverer 1.4, а затем отправьте эти .mgf-файлы на сервер MASCOT 2.2 — встроенный модуль программы для поиска в базе данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческая база данных Uniprot (всего 146 704 последовательностей; скачано 20 июля 2025 года с http://www.uniprot.org) используется с подробными параметрами поиска (Таблица 3).
    5. Получите полученные файлы поиска (.dat) с сервера MASCOT обратно в Proteome Discoverer 1.4. Данные для фильтрации при пороге коэффициента ложного обнаружения (FDR) <0,01 для получения идентификации с высокой точностью.
    6. Определить последовательность аминокислот белков с помощью данных MS/MS, количественно определить содержание белка с помощью интенсивности ионов репортера iTRAQ.
    7. Рассчитать экспериментальную воспроизводимость для определения срега дифференцированно экспрессированных белков (ДЭП) плюс значимость p<0,05.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании сроговое значение определяется как fold-change (FC) > 1.4, что эффективно устраняет систематические ошибки.
  5. Проанализировать функциональные характеристики неоваскулярных ДЭПов глиомы.
    1. Получите доступ к главной странице DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, версия 6.7; https://david.ncifcrf.gov/) и выберите Start Analysis в строке меню, чтобы начать анализ.
    2. Выберите левую панель, которая служит интерфейсом загрузки; вводите идентификаторы белков или генов в поле ввода Step 1 по запросу (используя функцию копирования-вставки).
    3. Для шага 2 выберите тип идентификатора, соответствующий загруженным белкам; в этом исследовании использовался UniProt Accession.
    4. Для шага 3 выберите список генов или настройки фона: анализ обогащения гена требует выбора фонового набора генов. Система по умолчанию использует весь геном вида, или пользователи могут загрузить пользовательский список белков/генов в качестве фона.
    5. Нажмите на «Отправить список », чтобы отправить записи и начать анализ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты анализа отображаются справа в панели «Аннотация Summary Results». Пользователи могут выбирать результаты в зависимости от аналитических потребностей; в этом исследовании специально использовался список GOTERM_BP_FAT для анализа биологических процессов, связанных с ДЭП.
    6. Получить биологические процессы (BPs), клеточные компоненты (CC), молекулярные функции (MF) и пути KEGG для неоваскулярных ДЭПов глиомы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для количественной протеомики было получено достаточное количество образцов белков, выделенных в LCM

Для получения надёжных протеомных профилей дифференциально экспрессируемых белков в неоваскулярных тканях глиомы в этом исследовании был выбран наиболее распространённый подтип глиомы — астроцитома III степени, а также изолированные неоваскулярные ткани с помощью LCM благодаря наличию обогащённых неоваскулярных сосудов. Кроме того, количественн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ЛКМ в сочетании с количественной протеомикой, маркирующей изотопами, выявила первый крупномасштабный протеомный профиль глиомного ангиогенеза

Опухолевой ангиогенез является критической патологической отличительной чертой глиом, тесно связанной с их высокой инвазивностью и терапевтическойустойчивостью 6,7. Традиционные антиангиогенные терапии (такие как ингибиторы VEGF) демонстрируют ог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81272798 до X.Z. и 82203592 к N.L.), Фондом естественных наук провинции Шаньдун (ZR2022QH112 по N.L.), специальными фондами Шаньдунского провинциального проекта Taishan Scholar Engineering (NO.tstp20221143 до X.Z), Национальной программой высококлассных иностранных экспертов Китая (H20240743; Иностранный эксперт: X.Z.), а также Научно-исследовательский проект по развитию Первого медицинского университета Шаньдуна в новых стратегических областях (202403).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-скважинная плитаThermo Fisher Scientific (США)468667Расходные материалы
АцетонНаньцзинский реагент (Китай)C0720114023Реагент
АцетонитрилMerck (Китай)CN34892Реагент
Набор для анализа белков BCAAbcam (Великобритания)ab102536Реагент
Стандарт бычьей сыворотки альбумина (BSA)Solarbio (Китай)PC0001-1Реагент
Центрифугная трубка (50ML)Кирген (Китай)KG2811Расходные материалы
Микротом КриостатаLeica (Германия)C1900Оборудование
ЦистеинАладдин (Китай)C108238Реагент
DL-дитиотрейтол(DTT)Амреско (США)D8220Реагент
Колонка EASY-Spray C18 с обратной фазой ВЭЖХThermo Scientific (США)ES800AРасходные материалы
Электронный балансСарториус (США)BSA224SОборудование
Среда встраиванияLeica (Германия)39475237Расходные материалы
Патроны Empore SPE C18Sigma-Aldrich (США)66872-UРасходные материалы
Труба ЭппендорфаКирген (Китай)KG2211Расходные материалы
Фильтрующая бумагаCytiva (США)Grade42Расходные материалы
Муравьиная кислотаАладдин (Китай)F112032Реагент
Стеклянная стаканSHUBO (Китай)1015479Расходные материалы
Стеклянный градуированный цилиндрSHUBO (Китай)1601Расходные материалы
‌ Высокоразрешающая жидкостная хроматография-масс-спектрометрияThermo Scientific (США)Q-ExactiveОборудование
Изолированный контейнерФефон (Китай)LCZYX-12Расходные материалы
Инвертированный микроскоп и nbsp;Leica (Германия)XDS-1Оборудование
ЙодоацетамидSolarbio (Китай)I8010Реагент
ИзопропанолАладдин (Китай)I112018Реагент
Реагенты iTRAQSigma-Aldrich (США)4381663Реагент
KClБейотиме (Китай)ST1596Реагент
KH2PO4Шанхай Юанье (Китай)S24278Реагент
Микродиссекция с лазерным захватомLeica (Германия)LMD 6000Оборудование
Слайд с микродиссекцией с лазерным захватомLeica (Германия)3800040Расходные материалы
Одноразовые лезвия Leica высокого профиляLeica (Германия)14035838926Расходные материалы
Контейнер с жидким азотомКЕЙКРИО (Китай)YDS-3Оборудование
Магнитный горячий мешалShanghaiSILE (Китай)LAB-0002-0068-SHSLОборудование
Считыватель микропластинTECAN (Швейцария)INFNITE F200Оборудование
PEN  МембранаLeica (Германия)11505189Расходные материалы
pH-метрСарториус (США)PB-10Оборудование
ПипеттЭппендорф (Германия)3123000268Оборудование
ПипеттЭппендорф (Германия)3123000241Оборудование
ПипеттЭппендорф (Германия)3123000225Оборудование
Полисульфоэтил АPolyLC Inc (США)104SE0303Расходные материалы
Ингибитор протеазыRoche (Швейцария)05892791001Реагент
Рефрижераторная центрифугаБекман (США)AllegraTM X-22RОборудование
ХолодильникМЭЙЛИН (Китай)BCD-180KCTОборудование
Додецилсульфат натрия (SDS)Амреско (США)1027P033Реагент
Банка для окрашиванияБейотиме (Китай)FG005Расходные материалы
Воздухозаборник из нержавеющей сталиМузисин (Китай)XYS-101Расходные материалы
СоветыКирген (Китай)KG1313Расходные материалы
Раствор для окрашивания толуидина с голубым цветомSigma-Aldrich (США)198161-5G/198161-25GРеагент
Трифторуксусная кислотаАладдин (Китай)T103293Реагент
Tris-HClАмреско (США)T8230Реагент
Решение трипсина-EDTASolarbio (Китай)T1300Реагент
Морозильник с ультранизкой температуройSanyo (Япония)MDF-382EОборудование
Ультрачистый очиститель водыELGA (Великобритания)PureLAB flexОборудование
Ультразвуковой клеточный разрушительQSONICA (США)Q500Оборудование
Вакуумная сублимированная сушилкаThermo (США)SNL 315SVОборудование
Вихревой миксерCrystal Technology & Промышленность (США)HYQ-3110Оборудование
Инкубатор водяной баниШанхайский технологический инструмент Yiheng (Китай)HWS-26Оборудование
Бумага для взвешиванияCole-parmer (США)133802Расходные материалы

Ссылки

  1. Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
  2. Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025).
  3. Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  4. Kan, L. K., et al. Potential biomarkers and challenges in glioma diagnosis, therapy and prognosis. BMJ Neurol Open. 2 (2), e000069(2020).
  5. Bertolini, G., et al. Prognostic impact of second surgical resection in IDH wildtype recurrent glioblastoma following chemo-radiation therapy: a propensity score analysis cohort study. J Neurooncol. 174 (3), 789-798 (2025).
  6. Ma, X., et al. Long non-coding RNA HOTAIR enhances angiogenesis by induction of VEGFA expression in glioma cells and transmission to endothelial cells via glioma cell derived-extracellular vesicles. Am J Transl Res. 9 (11), 5012-5021 (2017).
  7. Wang, R., et al. MCPIP1 promotes cell proliferation, migration and angiogenesis of glioma via VEGFA-mediated ERK pathway. Exp Cell Res. 418 (1), 113267(2022).
  8. Seyedmirzaei, H., Shobeiri, P., Turgut, M., Hanaei, S., Rezaei, N. VEGF levels in patients with glioma: a systematic review and meta-analysis. Rev Neurosci. 32 (2), 191-202 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Vasorin exocytosed from glioma cells facilitates angiogenesis via VEGFR2/AKT signaling pathway. Mol Cancer Res. 22 (7), 668-681 (2024).
  10. Domènech, M., Hernández, A., Plaja, A., Martínez-Balibrea, E., Balañà, C. Hypoxia: The cornerstone of glioblastoma. Int J Mol Sci. 22 (22), 12608(2021).
  11. Chen, Z., et al. Prrx1 promotes stemness and angiogenesis via activating TGF-β/smad pathway and upregulating proangiogenic factors in glioma. Cell Death Dis. 12 (6), 615(2021).
  12. Bastola, S., et al. Endothelial-secreted Endocan activates PDGFRA and regulates vascularity and spatial phenotype in glioblastoma. Nat Commun. 16 (1), 471(2025).
  13. Krenzlin, H., et al. Cytomegalovirus promotes murine glioblastoma growth via pericyte recruitment and angiogenesis. J Clin Invest. 129 (4), 1671-1683 (2019).
  14. Hong, G., et al. EGFL7: Master regulator of cancer pathogenesis, angiogenesis and an emerging mediator of bone homeostasis. J Cell Physiol. 233 (11), 8526-8537 (2018).
  15. Feldo, M., et al. Effect of diosmin administration in patients with chronic venous disorders on selected factors affecting angiogenesis. Molecules. 24 (18), 3316(2019).
  16. Anakha, J., Dobariya, P., Sharma, S. S., Pande, A. H. Recombinant human endostatin as a potential anti-angiogenic agent: therapeutic perspective and current status. Med Oncol. 41 (1), 24(2023).
  17. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  18. Qi, J. H., Anand-Apte, B. Deglycosylation increases the aggregation and angiogenic properties of mutant tissue inhibitor of metalloproteinase 3 protein: Implications for sorsby fundus dystrophy. Int J Mol Sci. 23 (22), 14231(2022).
  19. Sandmann, T., et al. Patients with proneural glioblastoma may derive overall survival benefit from the addition of bevacizumab to first-line radiotherapy and temozolomide: Retrospective analysis of the AVAglio trial. J Clin Oncol. 33 (25), 2735-2744 (2015).
  20. Funakoshi, Y., et al. Update on chemotherapeutic approaches and management of bevacizumab usage for glioblastoma. Pharmaceuticals (Basel). 13 (12), 470(2020).
  21. Sferruzza, G., Malcangi, M., Bosco, L., Finocchiaro, G. Reassessing the efficacy of bevacizumab in newly diagnosed glioblastoma: A systematic review and external pseudodata-based analysis. Neurooncol Adv. 6 (1), vdad174.31(2024).
  22. Ahir, B. K., Engelhard, H. H., Lakka, S. S. Tumor development and angiogenesis in adult brain tumor: glioblastoma. Mol Neurobiol. 57 (5), 2461-2478 (2020).
  23. Hallal, S., et al. A comprehensive proteomic SWATH-MS workflow for profiling blood extracellular vesicles: A new avenue for glioma tumour surveillance. Int J Mol Sci. 21 (13), 4754(2020).
  24. Westphal, M., Lamszus, K. Circulating biomarkers for gliomas. Nat Rev Neurol. 11 (10), 556-566 (2015).
  25. Santangelo, A., Tamanini, A., Cabrini, G., Dechecchi, M. C. Circulating microRNAs as emerging non-invasive biomarkers for gliomas. Ann Transl Med. 5 (13), 277(2017).
  26. Gahoi, N., et al. Multi-pronged proteomic analysis to study the glioma pathobiology using cerebrospinal fluid samples. Proteomics Clin Appl. 12 (2), 201870013(2018).
  27. Hao, X., et al. Urinary protein biomarkers for pediatric medulloblastoma. J Proteomics. 225, 103832(2020).
  28. Mustafa, D., Kros, J. M., Luider, T. Combining laser capture microdissection and proteomics techniques. Methods Mol Biol. 428, 159-178 (2008).
  29. Zheng, P. P., et al. Differential expression of splicing variants of the human caldesmon gene (CALD1) in glioma neovascularization versus normal brain microvasculature. Am J Pathol. 164 (6), 2217-2228 (2004).
  30. Miyai, M., Iwama, T., Hara, A., Tomita, H. Exploring the vital link between glioma, neuron, and neural activity in the context of invasion. Am J Pathol. 193 (6), 669-679 (2023).
  31. Komiyama, K., et al. Glioma facilitates the epileptic and tumor-suppressive gene expressions in the surrounding region. Sci Rep. 12 (1), 6805(2022).
  32. Mustafa, D. A. N., et al. Identification of glioma neovascularization-related proteins by using MALDI-FTMS and nano-LC fractionation to microdissected tumor vessels. Mol Cell Proteomics. 6, 1147-1157 (2007).
  33. Mustafa, D. A. N., et al. A proteome comparison between physiological angiogenesis and angiogenesis in glioblastoma. Mol Cell Proteomics. 11 (6), M111.008466(2012).
  34. Li, C., et al. Accurate qualitative and quantitative proteomic analysis of clinical hepatocellular carcinoma using laser capture microdissection coupled with isotope-coded affinity tag and two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 3 (4), 399-409 (2004).
  35. Woo, J., Schoenfeld, M., Sun, X., Iraguha, T., Zhou, Z., Zhang, Q. Mouse paneth cell-enriched proteome enabled by laser capture microdissection. Proteome Res. 21 (10), 2435-2442 (2022).
  36. Zhang, Y., et al. Quantitative phosphoproteomics reveals molecular pathway network alterations in human early-stage primary hepatic carcinomas: potential for 3P medical approach. EPMA J. 14 (3), 477-502 (2023).
  37. Yang, H., et al. Ubiquitinomics revealed disease- and stage-specific patterns relevant for the 3PM approach in human sigmoid colon cancers. EPMA J. 14 (3), 503-525 (2023).
  38. Wen, S., et al. Quantitative acetylomics revealed acetylation-mediated molecular pathway network changes in human nonfunctional pituitary neuroendocrine tumors. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 753606(2021).
  39. Su, J., Yang, L., Sun, Z., Zhan, X. Personalized drug therapy: Innovative concept guided with proteoformics. Mol Cell Proteomics. 23 (3), 100737(2024).
  40. Yang, L., et al. What does one-dimensional gel electrophoresis-based western blotting data really mean in the reality of proteoforms. Talanta. 295, 128266(2025).
  41. Fang, Z., et al. Proteoformics: Current status and future perspectives. J Proteomics. 321, 105524(2025).
  42. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA J. 9 (1), 77-102 (2018).
  43. Jia, W., Gong, X., Ye, Z., Li, N., Zhan, X. Nitroproteomics is instrumental for stratification and targeted treatments of astrocytoma patients: Expert recommendations for advanced 3PM approach with improved individual outcomes. EPMA J. 14 (4), 673-696 (2023).
  44. Gong, X., et al. Glioma angiogenesis phosphoproteome landscape and biomarker sets identified with phenome-centered multiomics toward 3P medical approaches. EPMA J. 16 (4), 831-856 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ангиогенез глиомылазерная микродиссекциясосудистая сеть опухолидифференциальная экспрессия белкованализ LC-MS/MSсеть белковых взаимодействийопухолевые биомаркерыантиангиогенная терапия
Подготовка неоваскулярных тканей из человеческих глиомных тканей для количественного протеомического анализа ангиогенеза опухолей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.