Методическая статья

Отбор проб в реальном времени адвентиальной интерстициальной жидкости бедренной артериовеновой крысы с помощью установки микродиализа

437 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69551

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании введена техника микродиализа, которая позволяет в реальном времени, анатомически точно отбирать образцы адвентициальной интерстициальной жидкости (AISF) у анестезированных крыс, выявляя характерные метаболические вариации и подтверждая её уникальное физиологическое значение. По сравнению с существующими методами отбора проб интерстициальной жидкости (ISF), этот подход обеспечивает повышенное молекулярное разрешение и стабильность отбора проб.

Аннотация

Интерстициальная жидкость (ISF) является жизненно важным элементом внеклеточной микросреды, способствующим метаболическому обмену и межклеточной коммуникации. Тем не менее, анатомическая глубина и близость к сосудистым структурам делают адвентиальный ISF (AISF) особенно трудным для отбора образцов без внесения загрязнения или нарушения тканей. В этом исследовании мы предлагаем минимально инвазивный метод сбора AISF в реальном времени с помощью микродиализа у анестезируемых крыс. Двойные отсечные зонды мощностью 20 кДа были хирургически имплантированы в бедренную артериовенозную адвентию и яремную вену для непрерывного отбора проб ISF и крови соответственно. Перфузия искусственной внеклеточной жидкостью позволила селективно диффузионировать метаболиты низкомолекулярной массы. С помощью анализа главных компонентов (PCA) и ортогонального дискриминантного анализа с частичными наименьшими квадратами (OPLS-DA) была обнаружена заметная метаболическая дивергенция между AISF и кровью, выявившая 146 существенно дифференцированных метаболитов. Паттерны обогащения лактата и серотонина подтвердили анатомическую специфичность и функциональную надёжность метода. Важно, что AISF был обогащён локально синтезированными метаболитами, отсутствующими в плазме, что подчёркивает его уникальное физиологическое значение. В сравнении с современными методами отбора проб интерстициальной жидкости (ISF), такими как микроиглы, сосальные волдыри и обратный ионофорез, микродиализ обеспечивает повышенную молекулярную разрешительность, большую стабильность отбора проб и снижение инвазивности. Этот метод является надёжной платформой для анализа аналитов в интерстициальной жидкости in vivo и демонстрирует значительный потенциал для продвижения открытия биомаркеров и исследований сосудистой патофизиологии.

Введение

Тканевая жидкость, или интерстициальная жидкость (ISF), является ключевым элементом клеточной микросреды, научные исследования которых ведутся с конца XIX века. В 1896 году Старлинг ввёл теорию капиллярной фильтрации-реабсорбции, которая впервые охарактеризовала ISF как однородную жидкость, образующуюся с помощью ультрафильтрации плазмы, играющую важную роль в транспорте иннутриентов и удалении метаболическихотходов 1. За последние два десятилетия достижения в технологии микроскопической визуализации и молекулярной биологии углубили понимание исследователями значительного разнообразия анатомического распределения, состава и функцииISF 2.

Исследования интерстициальной жидкости (ISF) на различных анатомических участках прояснили её различные функции в различных тканях. Например, в ткани мозга ISF способствует очищению нейротоксичных метаболитов, таких как β-амилоид, во время сна через глимфатическуюсистему 3. Напротив, интерстициальная жидкость опухоли (TIF) способствует инвазии опухолей и избеганию иммунитета, способствуя формированию кислой микросреды за счёт накопления молочнойкислоты4. Эти данные свидетельствуют о том, что ISF функционирует не только как посредник метаболического обмена, но и как активный регулятор тканеспецифических патофизиологических процессов. В этом контексте адвентициальная интерстициальная жидкость (AISF) представляет собой уникальную исследовательскую задачу из-за своей специфической анатомической локализации и функциональной сложности. AISF расположен на границе между адвентицией и окружающимитканями 5, играя ключевую роль во взаимодействии сосудистой стенки с нервной и иммунной системами. Однако глубокое анатомическое расположение и близость к крови и лимфатическим жидкостям создают значительные технические трудности для отбора проб in situ и анализа состава.

Традиционные методы отбора проб ISF, включая метод фитиля и хирургический дренаж, сталкиваются с серьёзными трудностями при получении высококачественных образцов AISF из-за риска загрязнения крови и повреждения тканей. Например, хирургическое удаление сосудистого эпителия может привести к повреждению периферических нервов или лимфатических сосудов, что приводит к смешиванию нецелевыхбиомолекул 6. Кроме того, эти методы ограничены низкой частотой отбора проб, нестабильностью, восприимчивостью помех и низкой воспроизводимостью, часто вызванной воспалением, вызванным подкожным введениемфитиля 7 , и повреждением клеток во время имплантации мышц. Разработка микродиализа представляет собой более эффективный подход к исследованиям ISF. Эта техника позволяет на месте и динамично захватывать малые молекулы, такие как метаболиты и цитокины, внутри ISF без ущерба сосудистой структуре с помощью полупроницаемого мембранного зонда. Зонд можно точно расположить в сосудистом эпителиальном пространстве, что снижает риск заражения кровью или лимфатическими жидкостями. Кроме того, он способствует непрерывному отбору проб, что позволяет в реальном времени отслеживать динамические изменения метаболизма ISF при различных условиях. Обеспечьте непрерывный и стабильный мониторинг этих метаболических процессов во время эксперимента.

Протокол

Эксперименты на животных проводились после одобрения Комитета по этике животных Пекинского союзного медицинского колледжа. Все процедуры строго соответствовали установленным протоколам. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Проиллюструйте систему отбора проб при микродиализе и связанные с ней хирургические инструменты, как показано на рисунке 1.
  2. Подготовьте искусственную внеклеточную жидкость (aECF) с содержанием 153,5 мМ На, 4,3 мМ К, 0,41 мМ Мг, 0,71 мМ Ка, 139,4 мМ Кл и 1,25 мМ глюкозы и скорректируйте pH до 7,4.
  3. Подготовьте два mD-зонда мощностью 20 кДа и назначьте их как зонд 1 (зонд тканевой жидкости) и зонд 2 (зонд крови). Поместите зонд 1 в стерильную фильтрованную деионизированную воду (dH₂O), а зонд 2 — в 1% натриевого гепарина, чтобы кончики зонда оставались постоянно влажными.
  4. Установите две пары путей (Пути 1 и 2) для «притока» и «выхода». Соедините два сегмента FEP-труб диаметром 1 м с помощью трубы PE50, минимизируя пустое пространство. Подключите каждую трубку притока к шприцу Exmire объемом 1 мл: заполните шприц 1 dH₂O, а шприц 2 — 1% гепарина натрия. Подключите микрошприцы к зондам и подготовьте инфузию ЭКФ после установки зондов в яремную вену.
  5. Активируйте mD-насос и установите расход на 1,5 мкл/мин, пока жидкость не выйдет из выходной трубки. Подключите выходную трубку к линии сбора образцов.
  6. Заполните два микрошприца фильтрованным aECF и начните скачку со скоростью 1 мкл/мин.

2. Приготовление животных

  1. Выберите взрослых крыс рода Спраг-Доули весом 280 ± 20 г (n = 6).
  2. Индуцировать анестезию с использованием 3% изофлурана и поддерживать его с 1,8%-2,2% изофлурана в смеси воздуха и кислорода, контролируя сердечную активность (согласно утверждённым институциональными протоколами). Подтвердите глубокую анестезию, оценив отсутствие болевой реакции и отмечая снижение частоты сердечных сокращений (340-390 уд/мин). Положите крысу на термостатическое одеяло и обездвижите конечности.
  3. Нанесите крем для удаления волос на шею и левую заднюю конечность, распространяясь на левую нижнюю часть живота. Дважды продезинфицируйте депилированные участки йодофором и удалите остатки йод с помощью 75% медицинского спирта.

3. Двойное размещение зонда (бедренная адвентиция и яремная вена)

  1. Используйте зонд с окном активного диализа диаметром 10 мм (CMA-20, отсечение 20 кДа, диаметр вала 0,5 мм), как показано на рисунке 2A.
  2. Подготовьте направляющую иглу и трубку для отрыва (рисунок 2B).
  3. Вытяните заднюю конечность крысы так, чтобы линия, соединяющая коленный сустав и середину паховой складки, была перпендикулярна продольной оси тела. Измерьте отрезок длиной 2 см вдоль кожи паховой области в направлении задней конечности, чтобы определить хирургическую ориентировую область (рисунок 2C). Определите среднюю точку этой паховой области как точку позиционирования микроокна. Отметьте место прокола в 2 см боковой стороны от этой точки положения (рисунок 2D).
  4. Поместите животное под стереомикроскоп.
  5. Сделайте разрез диаметром 0,5–0,8 см в середине паховой складки для облегчения визуализации и точного размещения зонда внутри периваскулярной мембраны. Грубо вскрыть подкожную ткань, чтобы обнажить бедренную артерию и вену, подкожную вену и поверхностную вену брюшной стенки (рисунок 2E).
  6. Оберните внешний слой иглы в отрываемую трубку, чтобы создать направляющую иглу.
  7. Убедитесь, что под кожей в месте прокола нет кровеносных сосудов. Введите иглу вертикально через кожу, затем отрегулируйте угол до 45°, чтобы войти в тканевое пространство вокруг подкожной вены.
  8. Продвигайте иглу в направлении кровотока внутри большой подкожной вены, поддерживая тесный контакт со стенкой сосудов на протяжении всей процедуры. Используйте стереомикроскоп, чтобы в реальном времени отслеживать положение иглы и предотвращать повреждения сосудов или загрязнение крови. Затем направляйте иглу в адвентицию бедренной вены (рисунок 2F).
  9. Вынимите иглу для проколов, оставив отрывающую трубку на месте внутри ткани (рисунок 2G).
  10. Введите зонд тканевой жидкости в разрываемый катетер и аккуратно откройте катетер, чтобы открыть место отбора образцов и получить образец ткани (рисунок 2H). Убедитесь, что зонд точно расположен в адвентиции бедренной артерии и вены (рисунок 2I). Закрепите датчик на коже перед наложением шва (рисунок 2J). Проводите все процедуры в строгих асептических условиях, стараясь избежать нарушения сосудистой адвентиции и предотвратить воспаление тканей или реакции инородных тел, которые могут нарушить сбор тканевой жидкости.
  11. Проверьте положение зонда, сфотографировав хирургическую линейку вместе с фиксированным зондом, чтобы задокументировать длину экспонирования, и представить это изображение, как показано на рисунке 2I.
  12. Сделайте кожный разрез диаметром 2 см примерно на 0,5 см латерально от средней линии шеи, начиная на 1 см выше грудинной выемки.
  13. Грубо рассечивают грудино-ключно-соместовидную мышцу, чтобы обнажить яремную вену, расположенную латерально от сонной артерии и отличающуюся по тёмно-синей окраске. Используйте увлажнённую ватную палочку, чтобы аккуратно отделить фасцию, стараясь избежать контакта с блуждающим нервом.
  14. С помощью микроскопических щипцов аккуратно поднимите внешнюю мембрану яремной вены и аккуратно удалите окружающую соединительную ткань, чтобы получить не менее 1 см длины свободного сосуда. Проксимально наместите шов из шелка 4-0, чтобы он служил резервной лигатурой (рисунок 2K).
  15. Для венозного прокола сделайте косой разрез под углом 45°, примерно на треть диаметра сосуда. Используйте микропинцет, чтобы аккуратно открыть разрез и создать вход для введения зонда.
  16. Аккуратно введите кончик зонда в вену и медленно продвигайте её на глубину 3,5–4,0 см, чтобы кончик достиг входа в правый предсердий (рисунок 2L).
  17. Закрепите зонд, затянув проксимальную шёлковую лигатуру двойным узлом. Закройте мышечный слой швами 4-0 Vicryl, затем наложите швы на кожу прерванными швами. Прикрепите внешнюю часть зонда к поверхности кожи, чтобы предотвратить смещение.

4. Сбор образцов и изъятие зонда

  1. Сбор образцов: Оценить связь между диализом тканей и переносом образца в пробирку. Поддерживайте общий объём 20 мкл между зондом и коллектором.
    1. Дайте образцу 20 минут, чтобы пройти через зонд и трубку и достичь конца трубки для сбора при расходе 1 мкл/мин. Соберите достаточный объём для достижения необходимой концентрации для анализа. Соберите 30 мкл диализа в каждую пробирку.
  2. Хранение образцов: предварительное охлаждение пробирок с полипропиленом объёмом 0,5 мл до 4 °C. Сразу после сбора закройте трубки, заморозьте их в жидком азоте на 30 секунд и переведите в морозильник при температуре -80 °C в течение 2 минут.
  3. Исходная выборка: Полное уравновесление выборки перед началом сбора образца. Возьмите три образца с каждой крысы под анестезией для установления стабильного базового уровня измерений.
  4. Удаление зонда: После завершения сбора образца извлечь зонд с головы животного и поместить его в ампулу с 1% натриевым гепарином. Эвтаназия животного, вдыхая избыток изофлурана.
  5. Сохранение зонда: тщательно прополосните зонд физиологическим раствором и храните его в флаконе с физиологическим раствором. Промывайте трубки физиологическим раствором с помощью шприца, чтобы предотвратить рост микробов. Повторно используйте зонд только если он сохраняет достаточный поток и мембрана остаётся целой.

5. Анализ данных

  1. Проведите анализ основных компонентов (PCA), ортогональный дискриминантный анализ с частичными наименьшими квадратами (OPLS-DA) и дополнительные статистические анализы с помощью MetaboAnalyst 6.0. Используйте OPLS-DA специально для определения важности переменной в проекции (VIP).
  2. Применять непараметрические тесты, включая оценки P-значений и анализ изменения сверст, для изучения дифференциальных метаболитов. Установите критические пороги для скрининга дифференциальных метаболитов: VIP > 1, FC ≥ 2 или FC ≤ 0,5 и P < 0,05.
  3. Аннотировать выявленные метаболиты с помощью базы данных KEGG Compound Database.

6. HPLC — MS/MS

  1. Выполните квантифицированную оценку метаболита с помощью масс-спектрометра AB Sciex 6500+ с тройным квадрупольным масс-спектрометром, оснащённым источником электрораспылительной ионизации (ESI), работающим в режиме положительных ионов.
  2. Настройте параметры прибора следующим образом: завесный газ — 40 psi; Столкновенный газ — 10 psi; ионный газ 1 (GS1), 50 psi; ионный газ 2 (GS2), 55 psi; напряжение ионного распыления — 4500 В; и исходная температура — 550 °C.
  3. Управление системой в режиме многократного мониторинга реакций (MRM). Оптимизировать переходы MRM, потенциалы декластеризации и энергии столкновений отдельно для каждого метаболита. Выполнять сбор данных с помощью программного обеспечения Analyst 1.7.1 и количественный анализ с использованием MultiQuant 3.0.3.
  4. Для хроматографического разделения используют колонку C18 (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм), поддерживаемую при температуре 45 °C. Подготовьте подвижные фазы как (A) 0,1% муравьиной кислоты в воде и (B) 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Установите расход на 0,35 мл/мин, а объём впрыска — на 6 мкл. Поддерживайте температуру автопромпера на уровне 4 °C перед анализом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании каждый забег длился примерно 25 минут в общей сложности.

Результаты

Набор данных нормализовался с помощью суммирования и логарифмических преобразований, после чего прошёл комплексный набор статистических анализов. Был проведён анализ основных компонентов (PCA) (рисунок 3A), который выявил выраженные разделения и выявил метаболические различия. Впоследствии была разработана модель Ортогонального дискриминантного анализа с частичными наименьшими квадратами (OPLS-DA), результаты которой показаны на рисунке 3B, демонстрируя дискриминационную эффективность модели. При оценке 618 метаболитов вулканические диаграммы с сопоставлением AISF и образцов крови выявили 146 дифференциальных метаболитов, при этом тканевая жидкость демонстрирует как пониженные, так и повышенные метаболиты (рисунок 3C). Кроме того, была создана тепловая карта для сравнительного обзора 50 основных дифференциальных метаболитов (рисунок 3D).

Для оценки надёжности метода отбора проб использовались серотонин и молочная кислота в качестве положительных контролей, представляющих компоненты тканевой жидкости и кровь соответственно. Результаты совпали с установленными закономерностями распределения этих компонентов в различных телесных жидкостях, как показано на рисунке 4. Дополнительный рисунок 1 показывает стабильность лактата и серотонина в микродиализатных аликвотах, хранящихся при -80 °C.

146 дифференциальных метаболитов систематически классифицировались на несколько категорий: нуклеосиды, нуклеотиды и их аналоги; жирные кислоты и их производные; аминокислоты, пептиды и их аналоги; углеводы и сопряжённые углеводы; органические кислоты и их производные; биогенные амины; пурины и пиримидины; витамины и стероиды; а также другие соединения (рисунок 5A). Дополнительная таблица 1 показывает дифференцированные метаболиты, обнаруженные в крови. Анализ тепловых карт дополнительно проясняет паттерны обогащения биогенных аминов и аминокислот, пептидов и их аналогов в различных телесных жидкостях (рисунок 5B,C). Анализ дифференциального обогащения метаболитов представлен на рисунке 6. Дополнительная таблица 2 содержит коэффициент вариации (CV) для пятнадцати случайно выбранных метаболитов в трёх последовательных периваскулярных образцах ткани и жидкости.

Рисунок 1
Рисунок 1: Изображения экспериментального аппарата. (A) Охлаждённый сборщик фракций. (B) Насос для шприца. (C) Микрошприцы. (D) Хирургические инструменты, включая сосудистые ножницы и пинцет и др. (E) Анестезиологический аппарат. (F) Зонды микродиализа. (G) Зонды микродиализа, направляющая игла для тканей и рваная трубка. (H) Сборки игл для направляющих тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Ключевые этапы исследования. (A) Схематическое изображение, показывающее расположение места операции и ориентацию зонда. (B) Идентификация критически сосудистых соединений для обеспечения точного наблюдения за местами размещения зондов. (C) Введение направляющей иглы, которая проникает в кожу и продвигается в тканевое пространство. (D) Втягивание направляющих иголок убирается, оставляя разрываемую трубку внутри ткани. (E) Микродиализа вводится в ткань через установленный канал. (F) Аккуратное втягивание рваной трубки. Разрываемая трубка аккуратно убирается после закрепления зонда. (G) Визуализация зондов, расположенных в эпителии бедренной, артериальной и венозной сосудов. (H) Отделение ткани от яремной вены. (I) Размещение зонда в яремной вене. (J) Микродиализ закреплен на поверхности кожи. (K) изоляция яремной вены. (L) Введение зонда в яремную вену. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Многомерный статистический анализ интерстициальной жидкости (ISF) и крови. (A) Данные были уменьшены для выделения значительных разделений, демонстрируя явные различия между ISF и компонентами крови. (B) Результаты модели анализа ортогонального частного наименьших квадратов (OPLS-DA) показывают значения R2Y и Q2 соответственно 0,925 и 0,811. (C) Вулканический график показывает 146 дифференциальных метаболитов, из которых 85 метаболитов понижены, а 61 — в ISF. (D) Соответственно, тепловые карты, сравнивающие 30 основных метаболитов ISF и крови, показывают чёткое различие между этими двумя наборами компонентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Представление серии графиков показало уровни обогащения лактата и серотонина в ISF и крови. Все точки данных представляют среднее ± SEM; Для всех количественных панелей отображаются полоски ошибок. Панель (A) показывает, что образцы ISF демонстрируют значительно большее обогащение лактата по сравнению с образцами крови. В отличие от этого, панель (B) демонстрирует, что серотонин более обогащён в образцах крови, которые одновременно демонстрируют более низкий уровень лактата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Изображена схема классификационных кольцев дифференциальных метаболитов и тепловая карта аминокислот, пептидов и их аналогов, а также биогенных аминов .(A) Каждый цветовой блок соответствует отдельному классу метаболитов. Аминокислоты, пептиды и аналоги составляют крупнейшую категорию, составляющую 19,29% от общего числа, за ними следуют нуклеосиды, нуклеотиды и аналоги (15%), жирные кислоты и производные (12,86%), углеводы и углеводные конъюгаты (7,86%), органические кислоты и производные (10%), биогенные амины (7,14%), пурины/пиримидины (5,71%), витамины и стероиды (8,57%) и другие соединения, включая индолы, азепины, пиридины и бензены, с 13,57%. (B) В интерстициальной жидкости (ISF) уровень обогащения таких соединений, как дезоксикарнитин и спермидин в категории биогенных аминов, значительно выше по сравнению с уровнем в крови, тогда как уровень серотонина (D4), серотонина, триптамин и родственных соединений значительно снижается. (C) В ISF большинство метаболитов, связанных с аминокислотами, пептидами и аналогами, значительно ниже, чем в крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Анализ обогащения метаболитного множества (MSEA) нормальной интерстициальной жидкости показал, что метаболическая активность преимущественно распределена по путям, связанным с производством энергии, редокс-гомеостазом и оборотом аминокислот . Лучшие обогащённые пути включают метаболизм бутаноат, пуринов и глутатион, что отражает поддержание энергоснабжения митохондрий и антиоксидантной способности в физиологических условиях. Кроме того, представлены несколько путей, связанных с аминокислотами, таких как метаболизм аргинина и пролина, метаболизм триптофана, а также метаболизм цистеина и метионина, что указывает на активное взаимное преобразование аминокислот и регуляцию азотного баланса в внеклеточной микросреде. Эти данные свидетельствуют о том, что нормальный интерстициальный метаболом поддерживает динамическое равновесие между биоэнергетическими процессами, окислительной защитой и метаболизмом аминокислот, поддерживая гомеостаз тканей и микроциркуляционную стабильность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Стабильность лактата и серотонина в микродиализаторных аликвотах, хранящихся при -80 °C. Данные средние ± SEM (n = 6 репликий на точку времени). Ни один анализ не отклонялся >5% от исходного значения за 72 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Дифференциальные метаболиты, обнаруженные в крови и адвентиальном интерстициальном микродиализате. Сюда входят имя метаболита, изменение сверстки (FC), значение P теста Стьюдента и VIP (OPLS-DA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Коэффициент вариации (CV) для пятнадцати случайно выбранных метаболитов в трёх последовательных образцах периваскулярных тканевых жидкостей. Все резюме — <20%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Интерстициальная жидкость (ISF) — это водная микросреда, покрывающая каждую клетку ткани и составляющая примерно 75% внеклеточного жидкогокомпартмента 8,9. Образуемый капиллярной фильтрацией плазмы, ISF не содержит клетки и высокого содержания белка крови, но сохраняет электролиты, мелкие растворённые вещества и воду9. Этот состав позиционирует ISF как ключевую границу между сосудистым и клеточным мирами. Функционально ISF является динамической транспортной средой. Он транспортирует кислород, глюкозу, аминокислоты и микроэлементы из кровотока к клеткам, одновременно собирая углекислый газ, мочевину и другие метаболические отходы для возвращения вкровообращение. Жидкость также служит смазкой и буфером, стабилизируя интерстициальное осмотическое давление, pH и ионныйбаланс 11. Помимо метаболизма, ISF поддерживает иммунный надзор, перемещая лейкоциты, антитела и цитокины через тканевые пространства и выступая в роли коммуникационной арены для гормонов и паракринныхсигналов 12,13. По сравнению с кровью, ISF по сути является безклеточным, низкобелковымфильтратом-14. Кровь, ограниченная сосудистым деревом, содержит эритроциты и белые клетки, тромбоциты, а также высокие концентрации альбумина и факторов свертывания. Уровень кислорода и питательных веществ в крови выше и постепенно ниже в ISF из-за клеточного поглощения, тогда как отходы накапливаются в ISF до попадания в лимфатический или венозныйвозврат 10. Отсутствие крупных белков и клеток в нормальной ISF минимизирует онкотическое давление и позволяет быстро диффузию, однако воспалительные состояния могут временно изменять этотпрофиль 15.

Однако изучение ISF остаётся ограниченным из-за отсутствия простых, быстрых и надёжных методов отбора проб. Современные методы включают микроигольные пластыри (MN), сосальные волдыри, обратный ионофорез, термическую абляцию и микродиализ. Пластыри MN создают микроканалы для экстракции ISF через кожу, при этом варианты с оболочкой сердца извлекают ISF менее чем за 30 секунд, а осмотические гидрогелевые MN — примерно за 3 минуты. Их можно сочетать с датчиками для анализа на участке, но они ограничены объёмом и требуют баланса между силой и отёком. Сосущие волдыри обеспечивают чистый ISF с минимальным загрязнением крови, но они инвазивны, болезненныи медленны 16,17,18. Обратный ионофорез (РИ) использует низкие электрические токи для транспортировки заряженных аналитов, таких как глюкоза и литийные ионы, на поверхность кожи для неинвазивного мониторинга. Однако он сталкивается с такими проблемами, как низкая пропускная способность, вариабельность между людьми и возможное раздражение кожи19,20. Трансдермальное введение (ТА) нарушает слой роговицы с помощью локального нагрева, позволяя ISF пассивно проникать в гидрофильные микроканалы. Хотя конструкция устройства проще, она собирает менее 5 мкл жидкости, что требует высокочувствительного обнаружения и тщательного термического управления для предотвращенияожогов 21,22. В отличие от этого, микродиализ (MD), основанный на диффузии через имплантированные полупроницаемые зонды, обеспечивает уникальную молекулярную селективность через регулируемые мембраны с отсечением молекулярной массы (MWCO), такие как 10 кДа для глюкозы и 100 кДа для белков ицитокинов (23,24). Эта техника поддерживает непрерывное и минимально инвазивное отбор проб. Однако MD операционно сложна, требует калибровки in vivo и демонстрирует переменные темпы восстановления для гидрофобных видов. Стоит отметить, что MD — единственная техника, способная к селективному выделению крупных биомолекулпо размеру 25. Сравнительные исследования диализата, собранного рядом с сосудистой адвентицией, по сравнению с кровью демонстрируют разные профили лактата и серотонина, что подтверждает стабильность и специфичность подхода МД.

Исследования на животных показали, что при синергетической регулировке сердца и лёгких ISF может течь в адвентициях, связанных с крупными артериями, венами и периферическиминервами 5,9. Обычно ISF содержит метаболиты, полученные непосредственно из плазмы, а также локально синтезируемые втканях 26,27,28. Таким образом, возможно, что выявленные перекрытия и различия метаболитов в AISF и плазме отражают участие ISF в транспортировке и очищении питательных веществ и метаболитов в тканях вдоль сосудистой системы. Метод, основанный на микродиализе, представленный здесь для отбора образцов AISF, значительно улучшит исследования системной циркуляции ISF в регулировании метаболизма в различных органах и тканях по всему телу.

Мембрана с отсечением молекулярной массы (MWCO) мощностью 20 кДа, используемая в данном исследовании, оптимально разработана для количественного восстановления мелких метаболитов, включая глюкозу, лактат, пируваты и аминокислоты. Однако он постоянно недооценивает или полностью исключает множество биологически значимых макромолекул, таких как цитокины, хемокины, факторы роста и внеклеточные ферменты. Клинические и методологические обзоры показали, что стандартные катетеры по 20 кДа эффективны для сбора мелких гидрофильных метаболитов, однако демонстрируют низкие показатели восстановления белков и воспалительныхмедиаторов 29. Следовательно, для точной количественной оценки цитокинов необходимы мембраны с более высоким MWCO (например, 100 кДа) или альтернативные стратегии отбора проб. Поэтому в будущих исследованиях, проводимых нашей группой, будут использоваться мембраны с более крупными MWCO для характеристики макромолекулярного состава периферической интерстициальной жидкости. В этом исследовании диализаты были собраны под общей анестезией. Микродиализ ранее был проверен у бодрствующих, свободно движущихся животных, и несколько методов «открытого потока» микроперфузии были адаптированы для использования в сознательныхмоделях 32. Однако адаптация дизайна и протокола имплантации зонда для использования у бодрствующих животных потребует решения проблем, связанных с привязкой, стрессом у животных, стабильностью зонда, артефактами движения и долгосрочной проездностью. В настоящее время мы разрабатываем легкую систему с поворотом троса и планируем провести сознательный отбор проб в нашем следующем исследовании.

Раскрытие информации

Нет финансовых конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2025YFC3507601) и Фондами фундаментальных исследований для Центральных институтов общественного благополучия (No ZZ-YC2023007).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система мониторинга ЭКГAD Instruments, АвстралияPowerLabОборудование
ЩипцыF.S.T(Fine Science Tools) Германия11252-00Хирургические инструменты
Гепарин натрийСигма-Олдрич, США9041-08-1Материал
Высокопроизводительный тандемный масс-спектрометр для жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-МС/МС)SCIEX, СШАExionLC-20ACОборудование
Стандартные ножницы IRISF.S.T(Fine Science Tools) Германия14060-09Хирургические инструменты
ИзофлуранRWD Life Science, КНРR510-22-10Материал
Система низкотечевой анестезииKent Scientific, СШАSomnoSuiteОборудование
Микродиализ с перфузионной жидкостью T1CMA Microdialysis, ШвецияP000034Материал
Зонд микродиализа, 20 EliteCMA Microdialysis, Швеция8010436Материал
Шприцы для микродиализа 1 мл газонепроницаемыеCMA Microdialysis, Швеция8309020Материал
Рефрижераторный коллектор фракцийCMA Microdialysis, Швеция470Оборудование
Разделённая трубка для зондов CMA 20CMA Microdialysis, Швеция8309019Материал
Стереоскопический микроскопОлимп, ЯпонияSZ61Оборудование
Шприцовый насосCMA MD AB, Швеция800310Оборудование

Ссылки

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

Адвентициальная интерстициальная жидкостьбедренная артерия крысыметаболомный профильанализ главных компонентнизкомолекулярные метаболитыпоиск биомаркеровпатофизиология сосудов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.