Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Формула травяной клизмы облегчает язвенный колит, ингибируя активацию кишечной глии через путь S100β/RAGE/NF-κB

564 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69571

⸱

28 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Была оценена травяная формула клизмы, сочетающая Sanguisorba officinalis, Bletilla striata и Acacia catechu , с использованием профилирования LC-MS/MS, стыковки S100β, модели колита DSS и энтрикальной глии, активируемой LPS/IFN-γ. Формула задействовала S100β, подавляла глиальную активацию и снижала экспрессию p-NF-κB/iNOS, что указывало на улучшение по оси S100β-RAGE-NF-κB.

Аннотация

Активация кишечных глиальных клеток (EGC) способствует патогенезу язвенного колита (UC). В этом исследовании изучалось, модулирует ли Dibai Enema Liquid (DBE) — травяная клизма, сочетающая Sanguisorba officinalis, Bletilla striata и acacia catechu — воспаление, вызванное EGC. Профили LC-MS/MS компонентов DBE и приоритетных соединений были связаны с S100β. Эффективность оценивалась при мышином колите, вызванном декстрансульфатом натрия (DSS), с использованием массы тела, длины толстой кишки, гистопатологии и уровней цитокинов (ELISA). Маркеры активации глии измерялись с помощью иммуногистохимии, колокализации иммунофлуоресценции, количественного ПЦР (qPCR) и иммуноблотирования. Модель in vitro использовала CRL-2690 энтерическую глию, активированную липополисахаридом и интерфероном-γ, при этом в качестве вмешательства использовалась сыворотка крыс с DBE-содержащим (15%). Стыковка показала сильное предсказанное связывание нескольких компонентов DBE с S100β. DSS повышал уровень TNF-α и IL-1β, нарушал плотные соединения и повышал уровень S100β/GFAP на уровнях мРНК и белка, что соответствует гиперактивации глии; DBE значительно отменил эти изменения. In vitro DBE восстановил S100β, RAGE, iNOS (NOS2) и фосфорилировал NF-κB p65. В совокупности DBE, по-видимому, облегчает UC, ингибируя активацию EGC и понижая оси S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, тем самым сохраняя целостность слизисты.

Введение

Язвенный колит (UC) — это основной подтип воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), характеризующийся хроническим слизистым воспалением толстой кишки, с увеличением глобальной нагрузки с 1990 года, и ЦК составляет значительную долю случаевВЗК 1,2. Типичные проявления включают боли в животе и кровавую диарею, что приводит к значительным физическим и психологическим страданиям и значительным затратам на лечение3. Хотя варианты лечения расширились, длительное воздействие иммуномодуляторов и биологических препаратов, подавляющих системный иммунитет, связано с повышенным риском лимфомы и оппортунистических инфекций, и часть пациентов остаётся рефрактерной илинепереносимой 4. ЮК широко считается иммунно-опосредованным состоянием, при котором нарушение слизистого иммунного гомеостаза является центральным элементомпатофизиологии 5. Однако накопленные данные указывают на то, что одних слизисто-иммунных механизмов недостаточно для объяснения всех признаков ВЗК; кишечная нервная система (ЭНС) способствует воспалению кишечника, расширяя понятие заболевания на нейровоспаление внутриВЗК 6.

Энтерические глиальные клетки (EGC), которых больше, чем энтерические нейроны у взрослых млекопитающих, теперь признаны ключевыми регуляторами гомеостаза и воспалениякишечника 7,8. EGC модулируют функцию эпителиального барьера, высвобождая медиаторы, такие как GDNF, TGF-β1, S100β и 15d-PGJ2, тем самым влияя на проницаемость и целостностьслизисты 9. Среди этих медиаторов S100β может активировать низшие каскады — включая путь RAGE/NF-κB, приводящие к повреждению барьеров и воспалительной амплификации 10,11. EGC также формируют иммунные ответы, регулируя фенотип макрофагов и висцеральную чувствительность с помощью коннексина-43 и M-CSF, а также оказывая подавляющий эффект на Т-клетки in vitro, что подчёркивает активацию EGC как управляемую терапевтическую мишень приUC 12,13.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) всё чаще изучается в UC и демонстрирует многообещающие результаты в клинических и экспериментальныхусловиях 14,15. Классическое сочетание Sanguisorba officinalis (Diyu) и Bletilla striata (Baiji) вместе с Acacia catechu (Ercha) давно задокументировано для дизентерических расстройств в источниках materia medica и включено в Китайскую фармакопею для гемостатического, обезболивающего и заживляющего ран. Современные исследования сообщают о антибактериальной, противовоспалительной, антиоксидантной и противоязвенной активности этих ботанических веществ, а A. catechu также демонстрирует нейропротекторные свойства с катехином в ролизаметного компонента 16,17. По сравнению с традиционной системной иммуносупрессией, формулировка, задействующая нейроиммунные пути, ориентированные на EGC, может обеспечить дополнительную эффективность с определённым механизмом и потенциально меньшими системными рисками, связанными симмунитетом 18,19.

В данном исследовании оценивается, снижает ли комбинированная подготовка Дию, Байдзи и Эрча (DBE) UC, подавляя активацию EGC. Используется интегрированный подход: нецеленаправленное профилирование LC-MS/MS для приоритизации компонентов, молекулярное стыкованное соединение с S100β, валидация в модели колита, индуцированного сульфатом натрием, и механистические анализы в EGC. Работа акцентирует внимание на нейроиммунном механизме — S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, который ранее изучался в предыдущих методах лечения UC, и описывает практические последствия для выбора дозы, оптимизации формулы и последующих трансляционных исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Пекинского университета китайской медицины [BUCM-2023-0912] и проводились в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных. Человеческие субъекты не участвовали.
Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Реагенты и материалы

На всех этапах использовались аналитические растворители и реагенты молекулярно-биологического уровня. Вся коммерческая информация, включая производителей, каталожные номера и лицензионные данные программного обеспечения, размещена в Таблице материалов (xlsx). Вода для всех препаратов была деионизирована и фильтрована. Все буферы были подготовлены свежими или хранятся в условиях, указанных ниже.

2. Настройка оборудования и программного обеспечения

Система UPLC-MS/MS, связанная с квадрупольным масс-спектрометром времени полёта; рефрижераторную центрифугу с ротором с поворотным ведром; CO₂-инкубатор, поддерживаемый при 37 °C, 5% CO₂ и относительной влажности ≥95%; считыватель микропластин (450 нм); термоциклер ПЦР в реальном времени; электрофорез и аппарат для протирания; а также использовался флуоресцентный микроскоп с фиксированными фильтрами возбуждения/излучения. Управление приборами и анализ данных проводились в MassLynx v4.2 для хроматографических и масс-спектрометрических данных и AutoDock 4.2 с AutoDockTools 1.5.7 для стыковки. Анализ изображения проводился в ImageJ/Fiji v1.53.

3. Приготовление жидкой клизмы Дибай (DBE)

Травяная смесь, состоящая из дию (50 г), байцзи (50 г) и эрча (20 г), была крупно измельчена и замочена в деионизированной воде 1 200 мл при комнатной температуре в течение 30 минут для полного увлажнения. Замочённую смесь отварили под интенсивным кипячением в течение 30 минут, время от времени перемешивая, чтобы предотвратить склеивание. Горячий отвар фильтровался через стерильную многослойную медицинскую марлю в стерильную стеклянную посуду для удаления нерастворимого материала. Фильтрат концентрировался в вакууме в водяной бане при температуре не более 45 °C, пока не получался концентрат, соответствующий конечной концентрации запаса 1,98 г/мл (высокодозовый запас). Рабочие растворы средней и низкой дозы при 0,99 г/мл и 0,50 г/мл готовились путём разбавления стерильной деионизированной водой до конечных объёмов по 100 мл каждый. Каждый раствор пропускался через мембрану диаметром 0,22 мкм в стерильных условиях, раздавался в маркированные стерильные контейнеры и хранился при 4 °C до семи дней. Перед использованием растворы аккуратно перемешивали; приемлемая внешность была прозрачной или слегка опалесцентной, без видимых частиц.

4. UPLC - MS/MS анализ DBE

Порошок из каждого лекарственного компонента точно взвешивался в 50 мг и экстракцировал с 1,0 мл 80% (v/v) метанола с помощью ультразвукового перемешивания в течение 30 минут при окружающей температуре. Экстракты возвращались к комнатной температуре после соникации, центрифугировали при 15 000 × г в течение 10 минут при 4 °C, а супернатанты фильтровались через мембраны 0,22 мкм в автопробопробные флаконы. Хроматографическое разделение проводилось на колонке обратной фазы (2,1 × 100 мм, 1,8 мкм; полярно-концевый тип C18) при температуре 35 °C; бренд/модель столбцов и каталожный номер приведены в Таблице материалов. Мобильная фаза A: 0,1% муравьиной кислоты в воде; Мобильная фаза B: ацетонитрил. Расход: 0,30 мл/мин; объём инъекции: 10 мкл. Градиент: 5% B на 0-2 минуты; 5→95% B с 2 до 20 минут; 95% B на 20-23 минуты; 95→5% B с 23,0 до 23,1 мин; переуравновесить на 5% B до 26 минут (полная таблица градиентов приведена в таблице 1).

Масс-спектрометрия использовала электроспрейную ионизацию с положительным/отрицательным переключением и независимое от данных получение с низко- и высокоэнергетическими (MSE) сканированиями. Массовый диапазон: м/з 100-1 500; капиллярное напряжение: 2,0 кВ; конус отбора проб: 20 В; температура источника: 120 °C; температура разогревания: 360 °C; конусный газ: 50 л/ч; Газ дезолвации: 600 л/ч. Высокоэнергетическая функция использовала ступенчатую энергию столкновения 20-50 эВ. Данные обрабатывались в MassLynx v4.2 с коррекцией массы замка и стандартными параметрами обнаружения пиков. В Дополнительной таблице 1 представлен полный список из 105 идентифицированных компонентов (молекулярные формулы, наблюдаемые m/z, время удержания и оценки доверия).

5. Молекулярная стыковка

Стыковка проводилась в AutoDock 4.2 по протоколу индуцированной посадки. Трёхмерная структура S100β (PDB 3HCM) была подготовлена путём удаления кристаллографических молекул воды, добавления полярного водорода и назначения зарядов Коллмана. Структуры лигандов, представляющие характерные компоненты DBE, были построены, протонированы при физиологическом pH и минимизированы по энергии. Место связывания определялось по нативным лигандным координатам; Аминокислотные остатки в пределах 6 Å от нативного лиганда рассматривались как гибкие при стыковке. Сеточные боксы охватывали весь карман с расстоянием между сетками 0,375 Å. Параметры ламаркистского генетического алгоритма: размер популяции 150; до 2,5 × 10⁶ энергетических оценок; 100 независимых партий на лиганд. Финальные позы ранжировались по предсказанной свободной энергии связывания и кластеризовались по RMSD; Были визуализированы паттерны взаимодействия (водородные связи, гидрофобные контакты π-π взаимодействия) для согласованности с известными комплексами S100β.

6. Животная модель колита, вызванного DSS, и лечения DBE.

Самцы мышей C57BL/6J (8 недель, 20-22 г) акклиматизировались не менее 7 дней при температуре 22 ± 2 °C, относительной влажности 50%-60%, 12 часов цикла светло-тёмный, с едой и водой ad libitum. Животных случайным образом разделили на шесть групп (n = 10/группу): контрольная, модель декстрансульфат натрия (DSS), контрольная группа с положительным результатом сульфасалазина (SASP), а также лечение с низкими, средними и высокими дозами DBE. Сотрудники, ответственные за гистологические оценки и количественную оценку изображений, были ослеплены к распределению групп.

Экспериментальный колит был индуцирован 2,0% (w/v) DSS в питьевой воде в течение 7 дней, затем 1,0% DSS в течение 3 дней, а затем обычная вода в течение 4 дней до эвтаназии. DBE вводился один раз в день клизмой при 10 мл/кг с помощью гибкого катетера, вставленного на 2,5 см в прямую кишку; Животных держали вертикально в течение 30 минут, чтобы минимизировать протечку. Дневные дозы DBE составляли соответственно 12,35, 27,4 и 49,4 г/кг/день для низких, средних и высоких групп; SASP был введён в 0,5 г/кг в день как положительный контрольный результат. Ежедневно фиксировались масса тела, консистенция кала и скрытая кровь кала для вычисления индекса активности заболевания. В конечном итоге мышей анестезиировали пентобарбитал натрия 50 мг/кг в..; кровь собиралась из ретро-орбитального синуса с помощью гепаринизированных капилляров; Животных усыпляли с помощью вывиха шейки матки. Толстая кишка была вырезана от илеоцекального соединения к прямой кишке, аккуратно вытянута, а длина измерена при минимальном натяжении. Представительные сегменты фиксировались в 4% параформальдегида; оставшаяся ткань быстро замораживалась в жидком азоте и хранилась при −80 °C.

7. Приготовление сыворотки, содержащей лекарственные вещества

Самцы крыс Спрага-Доули были рандомизированы в контрольные и DBE-группы (n = 6/группа). Группа DBE получала 12,34 г/кг в день пероральной гаважей один раз в день в течение 7 дней; Управление получало очищенную воду равного объёма. Через двадцать четыре часа после последней дозы животных анестезировали, а из брюшной аорты взяли цельную кровь. Сыворотка отделялась после 30 минут свертывания при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 1500 × г в течение 10 минут при 4 °C. Сыворотки инактивировались при температуре 56 °C в течение 30 минут и фильтровались через мембраны диаметром 0,22 мкм в стерильных условиях перед хранением. Сыворотка алицитировала в стерильные трубки и хранилась при −80 °C. Гемолизованные образцы, выявленные по повышенной абсорбции около 414 нм, были исключены.

8. Гистологическое исследование (H&E)

Ткань толстой кишки, закрепленная в 4% параформальдегиде в течение 24 часов, была обезвожена с помощью градированных этанолов, очищена ксилолом и вложена в парафин. Срезы (5 мкм) нарезали, депарафинизировали, регидратировали и окрашивались гематоксилином в течение 5 минут, затем посинялись в проточной воде в течение 5 минут и контрокрашивались эозином в течение 2 минут. Стекли были установлены с использованием смолы и исследованы на архитектуру крипты, плотность клеток кубка, непрерывность эпителия и воспалительную инфильтрацию. Репрезентативные изменения будут отмечены стрелками/наконечниками стрелок и обозначены в надписях рисунков; В легендах будут указаны полосы масштаба (например, 200 мкм) и заранее определённые визуальные пороги.

9. Иммуногистохимия (IHC)

Парафиновые срезы подвергались забору антигена в цитратном буфере (pH 6,0) в течение 15-20 минут при 95-98 °C, закалку эндогенной пероксидазы с 3% перекисью водорода в течение 10 минут и блокировку 5% нормальной сыворотки в течение 1 часа при комнатной температуре. Первичные антитела инкубировали ночью при 4 °C в увлажнённой камере. После промывки секции обрабатывались с помощью системы обнаружения стрептавидин-пероксидазы, разработанной с помощью DAB на 2 минуты (микроскопический мониторинг), окрашивались гематоксилином, дегидрировали и монтировали. В каждую партию были включены отрицательные контрольные группы без первичного антитела.

10. Анализ иммунофлуоресценции (IF)

Срезы, вложенные в парафин, были депарафинированы и подвергнуты антигенному извлечению в буфере ЭДТА (pH 8.0). После охлаждения неспецифическое связывание блокировалось 3% бычьей сывороткой альбумина в течение 1 часа при комнатной температуре. Секции инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против GFAP (1:500) и S100β (1:200), затем вторичные антитела, конъюгированные фторофором (1:500) в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Ядра окрашивались DAPI, а затворы устанавливались в анти-фейд среде. Изображения были сделаны с использованием одинаковых объективов, фиксированного времени экспозиции 100 мс и усиления детектора 1,0 в разных группах. Средняя интенсивность флуоресценции была количественно измерена в ImageJ/Fiji v1.53 после калибровки размера пикселя, вычитания фона (радиус вращающегося шара 50 пикселей) и нормализации до DAPI-положительной области. Было проанализировано как минимум пять биологических реплик на группу и три неперекрывающихся поля на каждую реплику.

11. Клеточная культура и лечение

Глиальные клетки кишечника крыс (обозначение CRL-2690) были культивированы в DMEM с дополнением 10% сыворотки плода бычьего скота и 1% пенициллин-стрептомицином при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Идентичность клеток была подтверждена коротким тандемным повторным профилированием, а культуры были свободны от микоплазмы. Эксперименты проводились в отрывках 5-15. Клетки были засеяны в пластины с 6 колодцями при 2,0 × 10⁵ ячейках на скважину в среде 2,0 мл/скважина и давали прикрепиться в течение 24 часов. Экспериментальные группы включали: необработанный контроль, контроль транспортных средств, модель, DBE-сыворотка и ингибитор.

Для индукции моделей клетки подвергались воздействию липополисахарида (LPS, 1 мкг/мл) плюс IFN-γ (20 нг/мл) в течение 24 часов в полной среде; соответствующее значение U/mL для IFN-γ указано в Таблице материалов согласно специфической мощности участка. Для лечения сывороткой DBE-клетки получали 15% (v/v) термически инактивированную (56 °C, 30 мин), 0,22 мкм фильтрованную сыворотку крыс с DBE, в полной среде в течение 24 часов (диапазон дозы 5%-20% используется для оптимизации жизнеспособности, как указано в разделе CCK-8). Для лечения ингибиторами применялся селективный ингибитор S100β SBI-4211 (10-50 мкм; 45 мкм для ключевых показаний) в течение 24 часов. Управление автомобилем сопоставило содержание растворителя (0,1% DMSO (v/v)) с аналогичной средой. Если не указано иное, процедуры готовились в предварительно нагретой (37 °C) среде, а клетки промывались 2× с помощью PBS перед заменой обработки. После лечения клетки собирались для экстракции РНК, анализа белков и иммунофлуоресценции, как подробно описано в последующих разделах. Биологическая репликация была не ≥ 5 независимых культур на каждое состояние.

12. Анализ жизнеспособности клеток CCK-8

Клетки засеивались в пластины с 96 лунками при 5 × 10³ ячейках на скважину в среде 100 мкл и оставались на ночь. Среда была заменена на сыворотку, обработанную DBE, на 5%, 10%, 15% или 20% (v/v) в течение 24 часов. Был добавлен реагент CCK-8 (10 мкл/скважины), а пластины инкубировали 1 час при 37 °C. Абсорбация была измерена на 450 нм с вычитанием пустых элементов (среда + реагент, без клеток). Жизнеспособность выражалась в процентах управления транспортным средством. Каждое состояние, используемое n ≥ 5 биологических репликаций (независимых культур) с тремя техническими репликами на культуру.

13. ELISA для тканевых цитокинов

Ткань толстой кишки была гомогенизирована на льду в PBS (1:9, в/в), содержащие ингибиторы протеаз. Гомогенаты очищались 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C; супернатанты анализировались на IL-1β и TNF-α согласно протоколам KIT. Стандарты и образцы выполнялись в дубликате, а кривые оснащались четырёхпараметрической логистической (4PL) моделью с R² ≥ 0,99; Заранее рассчитанные стандарты принимались в пределах 85%-115% от номинала. Поглощение считывалось при 450 нм с эталонным диапазоном 620-650 нм, когда это было доступно. Концентрация цитокинов нормализовывалась до массы ткани (pg/mg ткани). Каждая группа включала n ≥ 5 биологических репликат.

14. Количественная ПЦР в реальном времени (qPCR)

Общая РНК из ткани толстой кишки (или клеток, в зависимости от случая) была выделена с помощью набора спин-колонны с кремнеземной мембраной. Целостность РНК была подтверждена методом A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1 и агарозного геля. КДНК первой цепи была синтезирована из 1 мкг РНК с геномным удалением ДНК. qPCR использовал мастер-микс SYBR Green на откалиброванном термоциклере с программой: 95 °C 30 с; 40 циклов при температуре 95 °C 5 с, 60 °C 30 секунд; кривая плавления 65-95 °C с шагами 0,5 °C/5 с. GAPDH выступал в качестве эндогенного контроля. Относительная экспрессия была рассчитана с помощью 2⁻ΔΔCt после проверки эффективности грунтовых (90%-110%, по наклонам стандартной кривой). Были включены элементы управления без RT и без шаблонов. Последовательности праймеров приведены в таблице 2. В каждой группе было n ≥ 5 биологических реплик и два технических повтора на образец.

15. Вестерн-блот анализ

Белки из ткани (или клеток) толстой кишки извлекались в буфере RIPA с ингибиторами протеаз/фосфатазы и количественно измерялись с помощью BCA-анализа. Равномерный белок (30 мкг/полоса) денатурировался, растворялся на 4-20% градиентном SDS-PAGE и переносился в PVDF (0,45 мкм; 0,2 мкм для ≤ целей по 20 кДа). Мембраны блокировались в 5% обезжиренном молоке в течение 2 часов при комнатной температуре и инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против GFAP (1:1 000), S100β (1:1 000), iNOS (1:1 000), NF-κB p65 (1:1 000), фосфо-NF-κB p65 (Ser536, 1:1 000), окклюдина (1:1 000), клаудина-1 (1:1 000) и GAPDH (1:5 000). Вторичные антитела, сопряжённые с HRP (1:5 000), применялись в течение 1 часа при комнатной температуре. Сигналы разрабатывались с помощью ECL; время экспозиции ограничивалось линейным динамическим диапазоном (10–90 с). Переносы были подтверждены обратимым мембранным окрашиванием до блокировки. Интенсивность полос была количественно измерена в ImageJ/Fiji v1.53 после фонового вычитания и нормализована до GAPDH. Ожидаемая молекулярная масса: GFAP ~49 кДа, S100β ~10-12 кДа, NF-κB p65 ~65 кДа, iNOS ~130 кДа, Окклюдин ~65 кДа, Клаудин-1 ~22 кДа, GAPDH ~36-37 кДа. Каждый анализ включал n ≥ 5 биологических репликатов.

16. Статистический анализ

Данные были проанализированы в GraphPad Prism 8.0 и представлены как среднее ± SEM. Для многогрупповых сравнений использовался односторонний ANOVA, за которым следовал пост-хок тест Тьюки; для парных сравнений при необходимости применялись t-тесты Student с двумя хвостами без пары. Для временного или двухфакторного дизайна (например, лечение × дозы или лечение × времени) использовалась двусторонняя ANOVA (повторные измерения при необходимости) с коррекцией Тьюки или Даннетта, указанная в таблице рисунков. Тесты Шапиро-Уилка и Левена использовались для изучения нормальности и гомоскедастичности перед параметрическим тестированием; когда предположения нарушались, данные преобразовывались в логарифмии или анализировались с помощью соответствующих непараметрических тестов (Крускал-Уоллис с пост-хоком Данна; Манн-Уитни U для парных игроков). Точные p-значения и размеры эффекта (η² для ANOVA, d Коэна для t-тестов) указаны в легендах рисунков, где это применимо. Двустороннее p < 0,05 считалось статистически значимым. В надписях рисунков используется следующая обозначение значения: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 против Control; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 против DSS; NS, не значительно.

17. Ожидаемые результаты и контроль качества

Ожидается, что DSS укорачит длину толстой кишки, повысит индекс активности болезни и вызовет гистологические повреждения (искажение архитектуры крипты, истощение клеток кубка, эрозия эпителия). Лечение DBE должно повышать эти показатели в зависимости от дозы и снижать маркеры активации кишечно-глиальной глии. Западные блоты должны показывать зоны при перечисленных выше молекулярных массах, с увеличением сигналов в DSS и ослаблением при DBE или SBI-4211; Экспозиции должны оставаться в линейном динамическом диапазоне. Иммунофлуоресценция для GFAP и S100β должна показывать повышенную среднюю интенсивность DSS и снижение после лечения DBE. Хроматограммы LC-MS/MS должны показывать стабильное время удержания (дрейф ≤ 0,2 мин) и точность массы в пределах ± 5 ppm для эталонных ионов, с характерными ионами фрагментов для ключевых компонентов. Отрицательные контроли (например, отсутствие первичных антител) не должны давать специфического сигнала. Параметры получения изображения (объектив, экспозиция, усиление, гамма) должны оставаться фиксированными в разных группах для достоверных количественных сравнений.

18. Заметки по устранению неполадок

Мутность или частицы в растворах DBE указывают на недостаточную фильтрацию или осадки; повторите фильтрацию 0,22 мкм и подтвердите pH 6,5-7,5. Чрезмерная смертность или сильная потеря веса во время воздействия DSS указывает на чрезмерную индукцию; Снижайте концентрацию DSS, проверяйте молекулярную массу партии и ежедневно заменяйте растворы DSS. Непоследовательная оценка иммунофлуоресценции обычно отражает переменное воздействие; Зафиксируйте время экспозиции и усиление, а также добавьте эталонный слайд для пакетной калибровки. Слабые полосы западного блота могут отражать недонагрузку или неэффективность переноса; Проверьте количество белков, выберите подходящий процент или градиент геля и подтвердите перенос с помощью обратимого мембранного окрашивания. Плохое соответствие ELISA (R² < 0,99 или стандартный вычисление обратного расчёта вне 85-115%) оправдывают повторение стандартной кривой и повторный анализ разбавленных образцов. Для qPCR с эффективностью праймера выше 90-110% переоптимизируйте температуру отжига или концентрацию праймера перед анализом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Идентификация компонентов DBE и сыворотки, содержащей препараты,

LC-MS/MS выявили 105 уникальных химических компонентов в DBE с массовой ошибкой < 10 ppm. Идентификация подтверждалась молекулярной формулой, изотопным узором и сопоставлением фрагментов. Основные классы включали тритерпены, флавоноиды, бифенантрены и органические кислоты. Сыворотка, содержащая лекарство, выявила 59 компонентов, полученных из DB...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Язвенный колит (UC) — это хроническое воспалительное заболевание кишечника с мультифакторным патогенезом. Помимо нарушения иммунных ответов, дисфункция эпителиального барьера кишечника и дисбиоз кишечной микробиоты являются хорошо известными факторами, в то время как аномалии кишечной нервной системы (ЭНС) всё чаще определяются как ключевой фактор прогрессированияУК 23. В частности, как структурная, так и функциональная дисрегуляция ЭНС может усугублять воспаление...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано проектом строительства ключевых медицинских дисциплин высокого уровня Национального управления традиционной китайской медицины (ZYYSZX-2023256).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AutoDock 4.2Программное обеспечение для молекулярного стыковки-Исследовательский институт Скриппса
Декстрансульфат натрия (DSS)Химическое вещество для вызова колита у мышей9011-18-1Сигма-Олдрич
Жидкая клизма Дибай (DBE)Травяная смесь для лечения язвенного колита-Пекинский университет китайской медицины
DMEM (Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco)Среда для культивирования клеток11965-092Термо Фишер
Сыворотка для плода быка (FBS)Добавка для культивирования клеток16000-044Термо Фишер
Флуоресцентный микроскопИнструмент для иммунофлуоресцентной визуализации-Олимп
Система LC-MS/MSМасс-спектрометр для анализа LC-MS-Корпорация Уотерс
Липополисахарид (LPS)Индуктор воспаления в культуре клетокL2630Сигма-Олдрич
Термальный циклер ПЦРОборудование для qPCRT100Био-Рад
Первичное антитело (S100)Антитела к обнаружению белков S100ABC1234Abcam
Набор для анализа белков (BCA)Набор для количественной оценки белков23225Термо Фишер
Рекомбинантный интерферон- (IFN)Цитокин для активации EGC в клеточной культуре-Сигма-Олдрич
Вторичное антитело (конъюгированное с HRP)Вторичные антитела к иммуногистохимииXYZ5678Термо Фишер
Сульфазалазин (SASP)Положительный контроль язвенного колита-Сигма-Олдрич
Оборудование Western BlotСистема электрофореза для анализа белков-Био-Рад

Ссылки

  1. Lin, D., et al. Global, regional, and national burden of inflammatory bowel disease, 1990-2021: Insights from the global burden of disease 2021. Int J Colorectal Dis. 39 (1), 139(2024).
  2. Le Berre, C., Honap, S., Peyrin-Biroulet, L. Ulcerative colitis. Lancet. 402 (10401), 571-584 (2023).
  3. Cui, Y., et al. Integrated network pharmacology, molecular docking and animal experiment to explore the efficacy and potential mechanism of Baiyu decoction against ulcerative colitis by enema. Drug Des Devel Ther. 17, 3453-3472 (2023).
  4. Rosh, J. R., Gross, T., Mamula, P., Griffiths, A., Hyams, J. Hepatosplenic T-cell lymphoma in adolescents and young adults with Crohn's disease: A cautionary tale. Inflamm Bowel Dis. 13 (8), 1024-1030 (2007).
  5. Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: Lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol. 4, 280(2013).
  6. Capoccia, E., et al. Enteric glia: A new player in inflammatory bowel diseases. Int J Immunopathol Pharmacol. 28 (4), 443-451 (2015).
  7. Sharkey, K. A., Mawe, G. M. The enteric nervous system. Physiol Rev. 103 (2), 1487-1564 (2023).
  8. Fung, C., Boesmans, W., Cirillo, C., Foong, J. P. P., Bornstein, J. C., Vanden Berghe, P. VPAC receptor subtypes tune purinergic neuron-to-glia communication in the murine submucosal plexus. Front Cell Neurosci. 11, 118(2017).
  9. Bubeck, M., Becker, C., Patankar, J. V. Guardians of the gut: Influence of the enteric nervous system on the intestinal epithelial barrier. Front Med. 10, 1228938(2023).
  10. Da Silva Sousa, J. J., et al. Colonic mast cells trigger enteric neuronal death through the S100β/RAGE/NFκB pathway on inflammatory bowel diseases. Med Hypotheses. 170, 111004(2023).
  11. Xie, H., et al. Enteric glial cells aggravate the intestinal epithelial barrier damage by secreting S100β under high-altitude conditions. Mol Biomed. 4 (1), 31(2023).
  12. Grubišić, V., et al. Enteric glia modulate macrophage phenotype and visceral sensitivity following inflammation. Cell Rep. 32 (10), 108100(2020).
  13. Kermarrec, L., Durand, T., Neunlist, M., Naveilhan, P., Neveu, I. Enteric glial cells have specific immunosuppressive properties. J Neuroimmunol. 295 - 296, 79-83 (2016).
  14. Liu, D., et al. Flos lonicerae flavonoids attenuate experimental ulcerative colitis in rats via suppression of NF-κB signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (12), 2481-2494 (2020).
  15. Zhao, Y., et al. Gegen Qinlian decoction maintains colonic mucosal homeostasis in acute/chronic ulcerative colitis via bidirectionally modulating dysregulated Notch signaling. Phytomedicine. 68, 153182(2020).
  16. Zhu, L., Gu, P., Shen, H. Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats. Int Immunopharmacol. 68, 242-251 (2019).
  17. Zhang, S., et al. International clinical practice guideline on the use of traditional Chinese medicine for ulcerative colitis by Board of Specialty Committee of Digestive System Disease of World Federation of Chinese Medicine Societies (2023). Phytother Res. 38 (2), 970-999 (2024).
  18. He, X., et al. Bletilla striata: Medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 195, 20-38 (2017).
  19. Kumari, M., et al. Acacia catechu (L.f.) Willd.: A review on bioactive compounds and their health promoting functionalities. Plants. 11 (22), 3091(2022).
  20. Yasueda, A., et al. Sanguisorba officinalis L. derived from herbal medicine prevents intestinal inflammation by inducing autophagy in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 9972(2020).
  21. Garg Jyoti, V. Acacia catechu Willd. and Acacia arabica Willd. decrease the extent of anxiety behavior by reducing oxidative stress and moderating neurochemicals. J Ethnopharmacol. 312, 116496(2023).
  22. Ban, J. Y., et al. 3,4-Dihydroxybenzoic acid from Smilacis chinae rhizome protects amyloid β protein (25-35)-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons. Neurosci Lett. 420 (2), 184-188 (2007).
  23. Olech, M., Ziemichód, W., Nowacka-Jechalke, N. The occurrence and biological activity of tormentic acid: A review. Molecules. 26 (13), 3797(2021).
  24. Wang, Q., et al. Hyperoside: A review on its sources, biological activities, and molecular mechanisms. Phytother Res. 36 (7), 2779-2802 (2022).
  25. Xun, L., et al. Physcion and physcion 8-O-β-glucopyranoside: A review of their pharmacology, toxicities and pharmacokinetics. Chem Biol Interact. 310, 108722(2019).
  26. Cirillo, C., et al. Increased mucosal nitric oxide production in ulcerative colitis is mediated in part by the enteroglial-derived S100B protein. Neurogastroenterol Motil. 21 (11), 1209-e112 (2009).
  27. Li, Y., et al. Inhibiting the activation of enteric glial cells alleviates intestinal inflammation and comorbid anxiety- and depressive-like behaviors in the ulcerative colitis mice. Neurochem Int. 178, 105789(2024).
  28. Cirillo, C., et al. S100B protein in the gut: The evidence for enteroglial-sustained intestinal inflammation. World J Gastroenterol. 17 (10), 1261-1266 (2011).
  29. Esposito, G., et al. Enteric glial-derived S100B protein stimulates nitric oxide production in celiac disease. Gastroenterology. 133 (3), 918-925 (2007).
  30. Yang, Y. H., Qian, W., Hou, X. H., Dai, C. B. Bifidobacterium bifidum and Bacteroides fragilis induced differential immune regulation of enteric glial cells subjected to exogenous inflammatory stimulation. Inflammation. 45 (6), 2388-2405 (2022).
  31. Le Berre, C., Naveilhan, P., Rolli-Derkinderen, M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 809, 137315(2023).
  32. Schroeter, M. L., et al. Mood disorders are glial disorders: Evidence from in vivo studies. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2010, 780645(2010).
  33. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (12), 720-727 (2015).
  34. Fan, M., et al. Electroacupuncture at ST36 relieves visceral hypersensitivity based on the vagus-adrenal axis in the remission stage of ulcerative colitis. Neuromodulation. 28 (5), 812-824 (2025).
  35. Lechner, M., Lirk, P., Rieder, J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: The two sides of the same coin. Semin Cancer Biol. 15 (4), 277-289 (2005).
  36. Nomura, Y. NF-kappaB activation and IkappaB alpha dynamism involved in iNOS and chemokine induction in astroglial cells. Life Sci. 68 (15), 1695-1701 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

S100RAGENF BDSS

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.