Методическая статья

Улучшенное пространственное картирование слоёв желудочных мышц мышей с использованием модифицированной техники Swiss Roll

DOI:

10.3791/69673

⸱

25 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод иммунокрашивки целого желудка, модифицированный из техники «Swiss roll», изначально разработанной для мышиного кишечника.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пространственные «омиксные» технологии предоставляют беспрецедентные возможности для изучения биологии и взаимодействия отдельных клеток желудочно-нервно-мышечного аппарата в их естественной тканевой среде. Однако успешное применение этих подходов и оценка структурных и молекулярных различий в дне, корпусе и антруме требуют последовательного отбора проб и ориентации тканей. Здесь мы сообщаем о модифицированной технике «Swiss roll», адаптированной к желудку мыши, которая позволяет встраивать и визуализировать все основные анатомические области в одной криосекции. Этот подход делает акцент на плоской фиксации и аккуратном позиционировании для получения сечений с воспроизводимой ориентацией и качеством. В этом исследовании также были оптимизированы условия иммунофлуоресцентного окрашивания для обеспечения высококачественной визуализации клеточных маркеров. Этот протокол позволяет проводить комплексные параллельные сравнения областей желудка, минимизируя потерю тканей и экспериментальную вариабельность. Улучшая сохранение тканей и пространственную ориентацию, этот метод предоставляет практический и масштабируемый инструмент для исследователей, изучающих желудочную биологию как в физиологическом, так и в патологическом контекстах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Желудок — это сложный орган формы буквы J, который соединяет пищевод с двенадцатиперстной кишкой1. Он делится на три основные анатомические области: дно, тело иантрум 1. Каждая область мышечной туники желудка играет особую физиологическую роль, участвуя в ключевых желудочных функциях, таких как аккомодация, подчинение, тритурация пищи иопорожнение 1,2. Изучение изменений в физиологии и патологии желудка требует детального анализа этих областей и их клеточной архитектуры.

Для визуализации больших площадей ткани исследователи часто адаптируют технику «швейцарского ролла», изначально разработанную для мышиного кишечника 3,4,5,6. В этом исследовании модифицирована швейцарская методика переворота для использования с мышиным желудком, чтобы разработать новый протокол. Желудок сначала разделяется на анатомические области и фиксируется в горизонтальном положении. Ткань затем аккуратно скатывается и обрабатывается для криосецации. Неправильное швейцарское прокатывание может повредить хрупкие эпителиальные структуры, особенно в кишечнике, что приводит к ухудшению качества тканей для иммунного окрашивания. Сохранение хорошо фиксированных, правильно ориентированных тканей с целостными клеточными структурами крайне важно для высокоразрешающей визуализации. В данной работе представлен новый метод создания швейцарских рулонов, включающих все желудочные области в один криоблок. Кроме того, описан оптимизированный протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для мышечной туники желудка, что позволяет подробно оценить функцию желудка. Этот протокол предоставляет комплексное руководство по получению высококачественных иммунофлуоресцентных изображений с помощью тщательной подготовки желудочной ткани, обработки швейцарского рулона и окрашивания. Сохраняя сложную морфологию мускульной туники желудка, этот метод способствует более глубокому пониманию её структуры и функции как в состоянии здоровья, так и в болезни.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных проводились с использованием рекомендаций, изложенных в Руководстве Национального института здоровья по уходу и использованию лабораторных животных. Протоколы были утверждены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных клиники Майо (A48315-15). Программы ухода и использования животных клиники Майо были пересмотрены и полностью аккредитованы Ассоциацией по оценке и аккредитации Международной ухода за лабораторными животными (AAALAC). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Техника швейцарского ролла для криосекций с фиксированным желудком с параформальдегидом (PFA)

  1. Анестезировать мышь C57BL/6J (8-10 недель) с помощью вдыхания углекислого газа (CO₂) не менее 3 минут, затем вывих шейки матки для эвтаназии (согласно утверждённым институциональным протоколам).
  2. Отрежьте пищевод, двеперстную кишку, а также вентральную и дорсальную мезогастрию, чтобы удалить желудок.
  3. Поместите желудок в чашу с силиконовым покрытием с холодным фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS). Закрепите пищевод, дно, тело и двенадцатиперстную кишку в качестве ориентиров (рисунок 1A). Направление резки обозначено красной пунктирной линией на рисунке 1A.
  4. Аккуратно удаляйте прикреплённый жир с помощью ножниц и щипцов.
  5. Разрежьте вдоль вентральной брыжейки двенадцатиперстной кишки и желудка до штифта в корпусе, затем аккуратно расплющите ткань (рисунок 1B).
  6. Используйте трансферную пипетку, наполненную PBS, чтобы промыть остатки пищи из желудочного просвета.
  7. Аккуратно растяните открытый живот, чтобы получить ровное положение (рисунок 1C).
    ВНИМАНИЕ: Избегайте чрезмерного растяжения (то есть более 110% исходных размеров) для сохранения структуры ткани.
  8. Погрузите желудок в холодный 4% PFA на 2 минуты, чтобы слегка закрепить ткань и облегчить переворачивание.
  9. После короткой фиксации снова прижимите ткань плоско.
  10. Подрежьте живот вдоль пунктирного контура, чтобы создать равномерную форму, подходящую для перекатывания (рисунок 1C).
  11. Поместите обрезанную желудочную ткань на фильтрующую бумагу, увлажненную PBS (рисунок 1D).
  12. Свернуть ткань в швейцарский рулон и закрепить её, вставив зубочистку в центр.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что слизистая сторона направлена вверх во время прокатки. Держите двенадцатиперстный конец с щипцами в одной руке, а другой направляйте зубочистку, следуя небольшим изменениям опубликованных методов.
  13. После свернутого вставьте иглу массой 30 G, чтобы закрепить форму, и согните под углом 90° для стабилизации свернутого желудка (рисунок 1E).
  14. Зафиксируйте свернутую ткань в 4% PFA при 4 °C в течение 6 часов.
  15. Переносите фиксированную ткань на 30% сахарозы в PBS и инкубируют при 4 °C в течение 12–16 часов для криозащиты и предотвращения образования кристаллов льда.
  16. Аккуратно уберите стабилизирующую иглу.
  17. Внедрить ткань в состав оптимальной температуры резки (O.C.T.) с помощью одноразовых форм для основания, затем заморозить на сухом льду (рисунок 1F).
  18. После полной заморозки храните форму при -80 °C.
    ВНИМАНИЕ: Избегайте воздушных пузырьков в O.C.T., особенно вокруг ткани, так как они мешают секционированию. Тканевые блоки можно хранить при -80 °C как минимум один год.
  19. Перед секционированием уравновесьте блок при -20 °C не менее 1 часа.
  20. Разрезать ткань толщиной 5 мкм с помощью криостата.
    ВНИМАНИЕ: Толщина 5-12 мкм обычно подходитдля срезов желудка 7,8 у мыши и может регулироваться в зависимости от экспериментальных потребностей. Секции можно хранить при -20 °C до 3 месяцев.

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание мышечной ткани желудка

  1. Используя гидрофобную барьерную ручку, нарисуйте водоотталкивающий барьер вокруг каждого среза ткани на стекле микроскопа.
  2. Промыйте секции холодным PBS в течение 5 минут, чтобы растворить остаточное соединение OCT.
  3. Блокировать неспецифическое связывание, инкубировав срезы с 1% бычьей сывороткой альбумина (BSA) в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре (RT; 21-23 °C).
  4. Удалите 1% BSA с помощью всасывания, затем три раза промой участки холодным PBS по 10 минут при RT (21-23 °C).
  5. Кроме того, блокируйте неспецифическое связывание, инкубируя срезы с раствором блокирующего IgG мыши на мыши в PBS в течение 1 часа при RT (21-23 °C), что снижает связывание эндогенного IgG и повышает специфичность при использовании мышиных антител IgG.
  6. Удалите блокирующий раствор с помощью всасывания, затем три раза промыйте участки холодным PBS по 10 минут при RT (21-23 °C).
  7. Повторяйте блокировку BSA в течение 1 часа при RT (21-23 °C).
  8. Инкубировать срезы первичными антителами. Аноктамин-1 (ANO1), KIT, бета-тубулин класса III (TUBB3), разбавленный в холодном 1% BSA с 0,3% тритона X-100. В отдельном эксперименте используйте цепь с тяжелым содержанием миозина 11 (MYH11), E-cadherin и KIT. Инкубировать ночью (12-16 часов) при 4 °C.
  9. Удалите первичный раствор антител с помощью мягкого всасывания. Промывайте секции холодным PBS три раза по 10 минут при RT (21-23 °C).
  10. Инкубировать срезы вторичными антителами. Alexa Fluor (AF) 488 против кроликов IgG, AF555 против мышей IgG и AF647 против козла IgG (все при 5 мкг/мл; 1:400) в 1% BSA в течение 1 часа при RT (21-23 °C).
  11. Удалять вторичный раствор антител с помощью всасывания, затем три раза промыть участки холодным PBS по 10 минут при RT (21-23 °C).
  12. Покрасить срезы 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, при разбавлении 1:300) в течение 1 часа при RT (21°-23 °C).
    ВНИМАНИЕ: Ядра нейронов обычно демонстрируют более слабые сигналы DAPI, чем другие типы ЖКТ-клеток; Для оптимальной визуализации рекомендуется минимум 1 час инкубации.
  13. Промыйте участки один раз ультрачистой водой, чтобы удалить остатки соли.
  14. Крепите затворы с помощью Antifade Mountant.
  15. Запечатайте углы покрытия лаком для ногтей без флуоресцентного лака. Удалите лишний крепящий материал с помощью мягкого всасывания. Затем запечатайте весь периметр укрытия.

3. Иммунофлуоресцентная визуализация с использованием конфокального микроскопа

  1. Настройте многоканальный Z-стек в программном обеспечении конфокальной визуализации, настраивая лазеры и детекторы для DAPI, AF488, AF555 и AF647, обеспечивая спектральное разделение и избегая насыщения сигнала.
    ВНИМАНИЕ: Регулируйте мощность и время экспозиции лазера индивидуально для каждого флуорофора, чтобы предотвратить перекрёстные помехи и поддерживать сигнал в динамическом диапазоне по всем каналам (рисунок 2A).
  2. Задайте параметры экспозиции в программном обеспечении конфокальной визуализации, чтобы избежать насыщения пикселей и сохранить детализацию сигнала в областях высокой интенсивности (рисунок 2B).
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что сигналы во всех каналах находятся в динамическом диапазоне и не достигают насыщенности.
  3. Чтобы запечатлеть весь гастральный швейцарский рулон, используйте большую настановку для получения изображений (например, 6 × 6 полей) (рисунок 2C); однако эту настройку следует корректировать в зависимости от общего размера и плотности свернутой ткани.
  4. Получайте 3D-изображения с помощью Z-серии захвата в программном обеспечении конфокальной визуализации. Подробный рабочий процесс для N-мерного (ND) приобретения иллюстрирован на рисунке 2D.
  5. Выберите опцию Z-stack для включения изображения серии Z.
  6. Определите Z-диапазон, установив верхнюю и нижнюю фокальные позиции, охватывающие всю толщину всего желудка.
  7. Приведите верхнюю часть желудка в фокус и нажмите на кнопку «Верх », чтобы установить верхний Z-предел.
  8. Настройте фокус на нижнюю часть желудочной мышцы и нажмите кнопку «Вниз », чтобы установить нижний Z-предел.
  9. Установите количество шагов Z-стека на 8, чтобы охватить всю глубину желудочной мышцы.
  10. Нажмите «Запустить сейчас», чтобы запустить получение изображений Z-стека.
  11. Генерируйте проекции максимальной интенсивности для отдельных и объединённых флуоресцентных каналов для визуализации трёхмерных данных в двумерном изображении.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя новый метод, мышиные гастральные швейцарские роллы включали все три основных области желудка: дно, тело и антрум, а также небольшую часть пищевода и двенадцатиперстную кишку в одном участке. Включение всего желудка в одну секцию позволяет провести комплексный региональный анализ (рисунок 1). Окрашивание целых изображений швейцарских роллов с помощью гематоксилина и эозина (H&E) продемонстрировало хорошо сохранившуюся желудочную архитектуру во всех регионах, что позволило чётко визуализировать слизистые, подслизистые и мышечные слои (рисунок 3). На рисунке 4 показано представительное иммунофлуоресцентное окрашивание интерстициальных клеток Кахала (ICC; клетки кардиостимулятора, генерирующие ритмичные медленные волны, лежащие в основе фазовой моторики кишечника; идентифицированы с помощью KIT и ANO1), кишечных нейронов (нейронов кишечной нервной системы, координирующих моторику желудочно-кишечного тракта; идентифицированы по иммунокрашиванию TUBB3) и ядер (DAPI). В слизистой желудочной слизистой КИТ также экспрессируется в клетках Панета и кубка, как ранеесообщалось 9,10,11. ANO1 также высоко экспрессируется в желудочном эпителии, особенно в столбчатых эпителиальных клетках дна, что соответствует его роли в транспортировке хлоридов и секреции слизистойслизистой 11. Кроме того, TUBB3 экспрессируется в некоторых желудочных эндокринных клетках и клетках, выделяющих слизь, согласно данным Атласа белковчеловека 12,13. На рисунке 5 показано представительное иммунофлуоресцентное окрашивание гладкомышечных клеток, помеченных MYH11, эпителиальных клеток желудка, маркированных E-cadherin, и ICC, маркированных KIT. MYH11 также экспрессируется в миофибробластах слизистой желудочной слизистой ткани, как сообщалось ранее14. Вместе эти результаты иммунофлуоресценции подтверждают, что наш протокол сохраняет архитектуру тканей.

Рисунок 1
Рисунок 1: Подготовка «швейцарского рулета» желудка мыши для криосекции. (A) Весь желудок сразу после удаления помещается в чёрную кремезу с силиконовым покрытием и наполненную холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для сохранения целостности тканей. (B) Желудок открыт по середине двенадцатиперстной кишки. (C) Желудок аккуратно растягивается и закрепляется в блюде, чтобы он лежал ровно без чрезмерного напряжения. Вдоль ткани проводится красная пунктирная линия, указывающая на то, где её следует обрезать для облегчения скатания. (D) Открытый и фиксированный желудок помещается на фильтрующую бумагу, увлажненную PBS, в подготовке к скатке в компактную форму. Красная стрелка показывает направление переворачивания желудка. (E) Кусочки ткани помещаются в соединение с оптимальной температурой резки (O.C.T.) и замораживаются на сухом льду в подготовке к криосекции. (F) Замороженные блоки хранятся при −80 °C и криосекцируются с толщиной 5 мкм для дальнейшего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Настройка ND Acquisition и визуализация насыщения во время Z-стековой визуализации. (A) Настройки лазера и детектора, настроенные в программном обеспечении конфокальной визуализации для многоканального спектрального съёмки. Используются четыре флуорофора: 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), Alexa Fluor 488 (AF488), Alexa Fluor 555 (AF555) и Alexa Fluor 647 (AF647), каждый из которых сочетается с соответствующими возбуждающими лазерами и детекторами излучения. Спектральный график отображает кривые возбуждения и излучения, позволяя корректировать для минимизации перекрёстных помех и оптимизации обнаружения сигналов. (B) Настройки экспозиции регулируются индивидуально для каждого флуорофора, чтобы избежать насыщения пикселей и сохранить детали в областях высокой интенсивности. (C) Настройка большого изображения (например, 6 × 6 полей) позволяет визуализировать весь гастральный швейцарский рулон; Размер поля изображения должен регулироваться в зависимости от размера и компактности скрученной ткани. (D) Окно получения ND с настройками параметров Z-стека. Диапазон Z определяется выбором верхнего и нижнего положений желудочной мышцы, с восьмью шагами, которые охватывают всю глубину ткани для трёхмерного (3D) анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Изображение швейцарского рулета мышиного желудка с окрашенным гематоксилином и эозином. Сканирование плитки демонстрирует возможность визуализировать весь гастральный швейцарский рулон у 8-недельной самки мыши C57BL/6J. Указываются основные анатомические области, включая пищевод (красная пунктирная линия), нижний пищеводный сфинктер (фиолетовая пунктирная линия), дно (чёрная пунктирная линия), корпус (синяя пунктирная линия), антрум (зелёная пунктирная линия) и двенадцатиперстную (оранжевая пунктирная линия). Шкала масштаба: 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Конфокальные изображения швейцарского рулона целого мышиного желудка: ANO1, KIT, TUBB3. Верхние панели: Репрезентативные сшитые конфокальные изображения гастрального швейцарского рулона от 8-недельной самки мыши C57BL/6J, показывающие иммунное окрашивание для ANO1 (зелёный), KIT (циан), TUBB3 (жёлтый) и ядра (синий). Визуализируется весь свернутый желудок, включая дно, тело и антрум. Полосы масштаба: 1000 мкм. Нижние панели: увеличенные виды области, обведённые белой пунктирной рамкой в верхних панелях, подчёркивающей клеточные детали межклеточных клеток Кахаль (ANO1+ и KIT+; жёлтые стрелки) и энтерических нейронов (TUBB3⁺; красные стрелки). Масштабные полосы: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Конфокальные изображения швейцарского рулона целого мышиного желудка: MYH11, KIT, E-cadherin. Верхние панели: Репрезентативные сшитые конфокальные изображения гастрального швейцарского рулона от 8-недельной самки мыши C57BL/6J, показывающие иммунокрашивание для MYH11 (зелёный), KIT (циан), E-cadherin (жёлтый) и ядра (синий). Визуализируется весь свернутый желудок, включая дно, тело и антрум. Шкалы: 1000 мкм. Нижние панели: увеличенные виды области, обведённые белым пунктирным блоком в верхних панелях. Белые пунктирные линии очерчивают слизистый эпителий (E-кадгерин) и мышечный слой (MYH11). Белые стрелки обозначают KIT+ интерстициальные клетки Кахала (ICC). Масштабные полосы: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя недавно оптимизированный метод желудочного швейцарского ролла, все три сегмента желудка (дно, тело и антрум), а также пищевод и двенадцатиперстную кишку включаются на одном слайде. Такое комплексное внедрение позволяет исследователям анализировать структурные и молекулярные изменения по всему желудку и снижает стоимость сечений и окрашивающих реагентов (рисунок 1).

Одновременное воздействие одинаковых растворов для окрашивания всех желудочных областей обеспечивает стабильность и повышает точность. Иммунокрашивка гастральных швейцарских роллов ясно выявляет отдельные слои стенки желудка. Как показано на рисунках 4 и 5, этот метод позволяет визуализировать морфологические различия между сегментами желудка и обнаруживать ICC (KIT и ANO1)10, нейроны (TUBB3)15, гладкомышечные клетки (MYH11), слизистые эпителиальные клетки (E-cadherin) и ядер.

В зависимости от состояния тканей и целей исследования могут быть внесены незначительные изменения. Например, удаление лишнего жира помогает сохранить форму рулона во время фиксации. Регулировка толщины сечения также может помочь сохранить структуру тканей или улучшить адгезию к затвору. Ещё одним возможным способом усовершенствования является использование металлической формы для более равномерного резка, как это делается с кишечными швейцарскимирулонами 16. Хотя этот протокол сосредоточен на криосецениях, он может быть адаптирован для тканей, вложенных в парафин. Хотя вложение парафина сохраняет структурную целостность ткани, криосецирование позволяет быстрее обработать и лучше сохранять антиген, что делает его более подходящим для иммунофлуоресценции.

У этого метода есть ограничения. Увеличенный, фиброзный или кальцифицированный желудок, часто встречающийся при таких состояниях, как воспаление, ожирение, диабет или старение, может быть сложнее свернуть и создавать трудности для оптимальногоокрашивания 17,18,19,20. Несмотря на это ограничение, эта техника обладает значительными преимуществами по сравнению с традиционными региональными вложениями. Обработка всех желудочных областей при одинаковых условиях улучшает согласованность, снижает вариабельность и экономит как время, так и реагенты.

Этот подход особенно полезен для изучения региональных изменений. Он также поддерживает пространственный анализ нескольких типов ячеек и может сочетаться с количественной оценкой на основе изображений. В целом, этот недавно оптимизированный метод гастрального швейцарского ролла предоставляет практичную и масштабируемую платформу для комплексного анализа желудочных тканей в области здоровья и заболеваний.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здоровья R01 DK057061 (T.O.), R01 DK121766 (Y.H.), R01 DK126827 (T.O.), R01 DK131455 (T.O.) и P30 DK084567 (Эпигеномика и пространственная биология, Центр клеточной сигнализации в гастроэнтерологии клиники Майо). Финансирующие агентства не участвовали в разработке исследований, анализе данных или подготовке рукописей. Содержание полностью лежит на авторах. Мы благодарим доктора Даррена Дж. Бейкера и сотрудников лаборатории доктора Бейкера (кафедра биохимии и молекулярной биологии, клиника Майо, Рочестер, Миннесота) за обмен лабораторными ресурсами и техническую поддержку для окрашивания методом H&E.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#5SF ЩипцыТОНКИЕ НАУЧНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ11252-00
Бычий сывороточный альбумин СИГМА-ОЛДРИЧA7906
Светодиодный источник света ColdVision MC-LSШОТТMC-LS
Конфокальное программное обеспечение NikonПрограммное обеспечение для визуализации Nikon NIS-Elements
Криоseal XYLЭпредида9312-4
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дилактат)Термо Фишер СайентификD3571
Тарелки для вскрытия, большиеЖивые системы  ИнструментовкаАРТИКУЛ: DD-90
Ослиный противокозий AF647 pAbЖизненные технологииA21447Lot: 1739289 RRID:AB_2535864
Противомышиная система AF555 pAbЖизненные технологииA31570Lot: 1774719 RRID:AB_2536180
Противокроликовый AF488 pAbЖизненные технологииA21206Lot: 2668665 RRID:AB_2535792
E-кадхарин (разбавление 1:400)Бионаука по бакалаврству610181лот: 25510 RRID:AB_397580
ЭозинELITechGroup$SS-071C
Щипцы с эпоксидным покрытиемТОНКИЕ НАУЧНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ11210-10
ЭтанолСИГМА-ОЛДРИЧ459828-4L
ГИБКАЯ ТРУБКА 1,5 млЭппендорф22364111
Марлевые губкиFisherscientific22-362-178
Закалённые тонкие ножницыТОНКИЕ НАУЧНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ14090-09
ГематоксилинЭпредия7211
КИТ (0.2 и микро; g/mL; разбавление 1:1000)R& D SystemsAF1356Lot: IEO0217101 RRID: AB_354750
РАСТВОР ДЛЯ ЧИСТКИ ЛИНЗ 1 УНЦИЯ ПУЛЬВЕРИЗАТОРNikon77013066
Стекло крышки микроскопаFisher Scientific12541016
Микроскопические слайдыCardinalHealthM6133A
Значки MiniutienТОНКИЕ НАУЧНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ26002-20
MYH11 (разбавление 1:400)Биомедицинские технологииBT-562RRID:AB_10013421
Лак для ногтейГРЕХОВНЫЕ ЦВЕТА7.33855E+11
Игла 30 G x 1/2 дюйма;Бионаука по бакалаврству305106
ПараформальдегидСИГМА-ОЛДРИЧ158127-500G
Однолезовые лезвия PersonnaКомпания Razor Blade Co.76247-652
Решение IgG для блокировки мыши на мыши ReadyProbes (30x)Термо Фишер СайентификR37621Лот: 3226230
Слоуфэйд Diamond Antifade Mountant (монтажные носители)Термо Фишер СайентификS36972
Система окрашивания StainTray 10Simport ScientificM918-2
Стереомикроскоп 0,8x-5xNikonSMZ645
Сахароза СИГМА-ОЛДРИЧS9378-1KG
Поверхностные усилители X-100 (Triton X)Термо Фишер Сайентифик28314
TMEM16A (ANO1: разбавление 1:400)Abcamab53212 Lot: GP3295656-1 RRID: AB_883075
Трансферная пипетаFalcon357575
TUBB3 (разбавление 1:400)Технология клеточной сигнализации4466Lot: 5 RRID: AB_1904176
Xylenes Fisher ScientificX3P-1GALМНОГО 206238

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chaudhry, S. R., Liman, M. N. P., Omole, A. E., Peterson, D. C. Anatomy, abdomen and pelvis: Stomach. , StatPearls. (2025).
  2. Sanders, K. M., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Baker, S. A. Ca(2+) dynamics in interstitial cells: Foundational mechanisms for the motor patterns in the gastrointestinal tract. Physiol Rev. 104 (1), 329-398 (2024).
  3. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  4. Li, S., You, S., Mao, K. Protocol for multiplex immunofluorescence imaging of mouse intestinal tumors. STAR Protoc. 6 (2), 103776(2025).
  5. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  6. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal Swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin-embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  7. Hayashi, Y., et al. Platelet-derived growth factor receptor-alpha regulates proliferation of gastrointestinal stromal tumor cells with mutations in KIT by stabilizing ETV1. Gastroenterology. 149 (2), 420-432.e16 (2015).
  8. Hayashi, Y., et al. TRP53-mediated cell cycle arrest of precursors underlies interstitial cell of Cajal depletion during aging. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 117-145 (2021).
  9. Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
  10. Gomez-Pinilla, P. J., et al. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1370-G1381 (2009).
  11. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl(-) secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  12. Uhlen, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  13. Uhlen, M., et al. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1920-1932 (2005).
  14. San Roman, A. K., Jayewickreme, C. D., Murtaugh, L. C., Shivdasani, R. A. Wnt secretion from epithelial cells and subepithelial myofibroblasts is not required in the mouse intestinal stem cell niche in vivo. Stem Cell Reports. 2 (2), 127-134 (2014).
  15. Drokhlyansky, E., et al. The human and mouse enteric nervous system at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1606-1622.e23 (2020).
  16. Jiang, Y., et al. Mapping and tracing Grem1(+) stromal cells in an Apc (Min/+) mouse utilizing cryopreserved intestinal sections prepared via modified Swiss-roll technique. iScience. 27 (11), 111173(2024).
  17. Izbeki, F., et al. Loss of Kitlow progenitors, reduced stem cell factor and high oxidative stress underlie gastric dysfunction in progeric mice. J Physiol. 588 (Pt 16), 3101-3117 (2010).
  18. Hayashi, Y., et al. Hyperglycemia increases interstitial cells of Cajal via MAPK1 and MAPK3 signaling to ETV1 and KIT, leading to rapid gastric emptying. Gastroenterology. 153 (2), 521-535.e20 (2017).
  19. Gao, F., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization restores epigenetic control of nitric oxide synthase 1 expression and reverses gastroparesis in female diabetic mice. Gastroenterology. 165 (6), 1458-1474 (2023).
  20. Kuro-o, M., et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. 390 (6655), 45-51 (1997).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Swiss Roll TechniqueGastric Muscle LayersSpatial OmicsImmunofluorescence StainingMouse StomachTissue OrientationCryosection EmbeddingGastric RegionsInterstitial CellsSmooth Muscle Cells

Похожие статьи