Неймегенский гемостазный анализ: одновременное фторогенное измерение тромбина и плазмина в одной яме

Краткое содержание

Этот протокол описывает Неймегенский гемостазный анализ, который позволяет одновременно измерять генерацию тромбина и плазминов с разрешением, обеспечивая комплексную оценку свертывания и фибринолиза. Цель анализа — улучшить характеристику гемостатического баланса в исследовательских и клинических условиях за пределами обычных гемостатических тестов.

Аннотация

Тромбин и плазмин играют центральную роль в гемостазе, регулируя коагуляцию и фибринолиз соответственно. Обычные гемостатические анализы часто сосредоточены на изолированных компонентах или ограниченных фазах гемостаза; Например, активированное частичное время тромбопластина и протромбина оценивают только начало образования фибрина, тогда как факторная активность оценивает функцию отдельных факторов свертывания. Хотя эти анализы ценны, они не дают всестороннего представления о всестороннем процессе вторичного гемостаза и фибринолиза, который развивается динамически со временем. Неймегенский гемостазный анализ (NHA) решает это ограничение, позволяя одновременно измерять генерацию тромбина и плазмина в одной микропластинной яме. Используя два синтетических фторогенных субстрата с разными спектрами возбуждения и излучения и без перекрёстной реактивности, анализ позволяет точно количественно оценивать оба фермента параллельно. Гемостаз инициируется в плазме с низким содержанием тромбоцитов с помощью тканевого фактора, кальция и тканевого типа плазминогена, а флуоресценция регистрируется каждые 30 секунд в течение 70 минут при 37 °C. Кривые активности ферментов генерируются с использованием калибровочных стандартов, из которых выводятся такие параметры, как время задержки, потенциал тромбина, время лизиса фибрина и пиковая высота плазмина. Анализ надёжно фиксирует одновременную генерацию тромбина и плазмина с хорошей точностью внутри- и между анализами, а также обнаруживает модуляцию свертывания и фибринолиза эффекторами, такими как гепарин, активированный белок C и эпсилон-аминокапроновая кислота. В клинических образцах наблюдалось значительно снижение генерации тромбина у пациентов с дефицитом фактора свертывания, тогда как у пациентов с фибринолитическими нарушениями был повышен уровень генерации плазмина. Объединяя измерения генерации тромбина и плазмина, NHA предоставляет всестороннее понимание гемостатического баланса, выходящего за рамки традиционных анализов. Этот интегрированный подход перспективен для исследований и клинических применений, таких как характеристика гемостатических фенотипов, оценка риска кровотечений и тромботических заболеваний, а также мониторинг целенаправленных терапевтических вмешательств. Этот протокол описывает процедуру NHA, направленную на улучшение понимания и оценки гемостатического баланса.

Введение

Гемостаз является результатом динамического баланса между свертываемостью и фибринолизом. Тромбин и плазмин являются ключевыми ферментами, управляющими этими процессами: тромбин превращает фибриноген в фибрин, а плазмин разлагает фибрин, растворяя тромбы. Нарушение этого баланса может привести к кровотечению или тромботическим^{событиям 1,2}. Однако лабораторные тесты, используемые для оценки гемостаза в клинической практике, обычно сосредоточены на отдельных этапах свертывания или фибринолиза, что даёт ограниченное представление о целом гемостатическом балансе. У пациентов с подозрением на кровотечение обычно применяются рутинные скрининговые тесты, такие как протромбиновое время (PT) и активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT), для выявления дефицита фактора свертывания. Однако эти анализы измеряют время до начального образования фибрина и не фиксируют генерацию тромбина после начала свертывания, где наблюдается наиболее физиологически значимая активность^{тромбина 1,2,3}. В результате они могут давать нормальные результаты у пациентов с лёгкими дефицитами факторов свертывания 3,4,5,6,7,8. Для выявления этих специфических дефицитов применяются тесты активности фактора свертывания. Хотя эти анализы информативны для диагностики, они оценивают отдельные белки изолированно и не отражают общий гемостатический баланс. В результате у пациентов с лёгкими дефицитами факторные уровни часто плохо коррелируют с кровотечением фенотипа ^9,10. Это усложняет клиническую оценку риска и оптимизацию управления пациентом, включая время и дозировку терапии, а также вмешательства в ответ на тромботические или тяжёлые геморрагические события. Эти ограничения подчёркивают необходимость проведения анализов, которые дают более полное представление о гемостатическом процессе со временем и могут помочь сократить разрыв между лабораторными результатами и клиническими показаниями.

Неймегенский гемостазный анализ (NHA) был разработан для устранения этих ограничений, позволяя одновременно измерять тромбина и генерацию тромбина и плазминов в плазме с ограниченными тромбоцитами ^8,9. Используется два синтетических фторогенных субстрата с разными спектрами возбуждения и излучения для количественного определения обоих ферментов в одной и той же микропластинной яме без перекрёстной реактивности. Кривые генерации ферментов позволяют вывести количественные параметры, отражающие динамику вторичного свертывания и фибринолиза, включая время задержки, высоту пика тромбина, время лизиса фибрина и пиковую высоту плазмина. NHA обладает рядом преимуществ по сравнению с существующими анализами на генерацию тромбина, такими как калиброванная автоматизированная тромбограмма (CAT), Ceveron s100 и ST Genesia, которые предоставляют ценную информацию о динамике тромбина, но не оценивают фибринолитическую^{активность} 10,11,12,13. В свою очередь, анализы на лизис сгустка, в свою очередь, охватывают аспекты фибринолиза, но не имеют информации о тромбине^14-го поколения. Это ограничивает их полезность при оценке сложных взаимодействий, определяющих общий гемостатический баланс. Хотя некоторые лабораторно разработанные методы объединяют измерения генерации тромбина и плазмина, они обычно требуют отдельных скважин или параллельных анализов, что ограничивает временное выравнивание и пропускную способность¹⁵. Глобальные анализы, такие как тромбоэластография (TEG) и ротационная тромбоэластометрия (ROTEM), предоставляют дополнительную информацию, фиксируя первичный гемостаз, вторичную коагуляцию и фибринолиз^. Системы камер потока представляют собой ещё один новый, но экспериментальный подход для оценки полного гемостаза при условиях^{потока 18}. Хотя эти глобальные анализы предлагают более широкий физиологический контекст, они, как правило, менее чувствительны к лёгким нарушениям кровотечения 19,20,21. Одновременно измеряя генерацию тромбина и плазмина в одной реакционной яме, NHA сочетает чувствительность традиционных TGA с интегрированным подходом к глобальным анализам, что позволяет напрямую оценивать вторичный гемостаз, фибринолиз и их взаимодействия.

Анализы на генерацию тромбина уже показали значительные перспективы для трансляционных применений, таких как индивидуализированное кровотечение и профилирование риска тромботического риска, а также мониторинг терапии 22,23,24,25. В клинических исследованиях NHA продемонстрировала снижение генерации тромбина у пациентов с гемофилией A, гемофилией B и дефицитом редких факторов свертывания, а также повышенную генерацию плазмина при гиперфибринолитических состояниях, таких как дефицит α2-антиплазмина 26,27,28,29. Различия в обоих путях также наблюдаются у пациентов с гипофифриногенемией — расстройством, связанным как с кровотечением, так и с повышенным риском тромбоза. В этой популяции низкий уровень фибриногена коррелировал со снижением генерации плазмина, вероятно, из-за отсутствия сайтов связывания плазминогена, тогда как у пациентов с анамнезом тромбоза наблюдалось увеличение тромбина^30-го поколения. Кроме того, анализ выявляет действие терапевтических препаратов, включая антикоагулянты, прокоагулянты и антифибринолитики⁸. В одном из предыдущих исследований мы предложили подход стандартизации и нормализации для повышения воспроизводимости и сравнения результатов между забегами и лабораториями, что является важным шагом для клинического^{внедрения 28}. Этот протокол описывает полную процедуру и аналитический подход NHA для внедрения в клинических исследованиях или трансляционных условиях.

Протокол

Все процедуры, связанные с человеческими образцами плазмы, проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и утверждались комитетом по медицинской этике Арнем-Неймегена. Письменное информированное согласие было получено от всех доноров перед сбором образцов.

1. Подготовка буферов, реагентов и образцов плазмы

1. Подготовьте буферные решения
   1. Весить 1,2 г триоксида (в год) и растворить в 180 мл с 0,9% NaCl.
   2. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl.
   3. Увеличите итоговый объём до 200 мл с 0,9% NaCl, чтобы получить 50 мМ Tris-150 mM NaCl буфера (TBS).
   4. Aliquot TBS в две трубки по 50 мл.
   5. Оставшиеся 100 мл TBS используйте для подготовки буфера, содержащего кальций. Растворить 7,34 г CaCl₂·_{2H 2}O в 100 мл TBS для получения буфера Tris-NaCl-CaCl₂ (TBS-Ca, pH 7,4).
   6. Aliquot TBS-Ca в две трубки по 50 мл.
   7. Храните оба буфера при 4 °C и используйте в течение недели.
2. Подготовка фторогенных субстратов
   1. Растворить 53,2 мг тромбинового субстрата (Bz-бета-Ala-Gly-Arg-AMC) в 4 мл буфера Tris-NaCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В коробке находится листовка с сертификатом анализа. Объём буфера для добавления зависит от заданной концентрации и должен быть скорректирован так, чтобы 1 мкл добавленного человеческого тромбина в реагенте 120 мкл давало итоговую концентрацию 76 нмоль/л.
   2. Аликвот 100 мкл в трубках Эппендорфа и хранение при −80 °C.
   3. Разморозьте аликвот тромбин-специфического флюорогенного субстрата на 10 минут при комнатной температуре перед использованием. Вихрь и держите на льду во время эксперимента.
   4. Растворить содержимое одного флакона субстрата плазмина (CBZ-L-Phe-Arg-родамин) в 1 955 мкл ДМЗО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В коробке находится листовка с сертификатом анализа. Объём буфера для добавления зависит от заданной концентрации и должен быть скорректирован так, чтобы 1 мкл добавленного человеческого плазмина в реактиве 120 мкл давало итоговую концентрацию 200 нмоль/л.
   5. Аликвот 60 мкл в трубках Эппендорфа и хранение при −80 °C.
   6. Разморозьте аликвот плазмин-специфического фторогенного субстрата на 10 минут при комнатной температуре перед использованием. Вихрь и поддержание при комнатной температуре во время эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ Этот субстрат растворён в диметилсульфоксиде (DMSO) и не должен охлаждаться для предотвращения осадков.
3. Подготовьте триггерные реагенты
   1. Восстановить лиофилизированный цефалин путём добавления 1 мл дистиллированной воды. Вихрь тщательно до полного растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цефалин реконструируется для получения фосфолипид, которые необходимы для катализа множественных коагуляционных реакций, обеспечивающих физиологически значимую коагуляцию в анализе.
   2. Аликвот 60 мкл в трубках Эппендорфа (достаточно для 20 скважин) и храните при −20 °C.
   3. Разморозьте аликвот перед использованием и держите на льду. Ненадолго вторгайтесь перед пипетом.
   4. Восстановить содержимое одного флакона рекомбинантного фактора человеческой ткани (ТФ) в 4 мл дистиллированной воды.
   5. Аликвот 60 мкл в трубках Эппендорфа и хранение при −80 °C.
   6. Разморозьте аликвот TF и ненадолго вихрь.
   7. Приготовьте разбавление TF в соотношении 1:500 последовательно:
      1. Добавьте 6 мкл TF к 54 мкл буфера TBS. Вихрь.
      2. Возьмите 6 мкл этого разбавления и добавьте к 54 мкл TBS. Vortex.
      3. Возьмите 20 мкл второго разбавления и добавьте до 80 мкл ТБС, чтобы достичь конечной концентрации 0,28 пм. Вихрь.
   8. Восстановить содержимое одного флакона (20 мг) активатора плазминогена тканевого типа (tPA) в 20 мл дистиллированной воды для получения конечной концентрации 580 000 МЕ/мл (проверьте концентрацию, специфическую для партии).
   9. Аликвот 50 мкл в трубках Эппендорфа и хранение при −80 °C.
   10. Разморозьте аликвот tPA и вихрь на короткое время.
   11. Приготовьте разбавление tPA в соотношении 1:50, добавив 20 мкл tPA к 980 мкл буфера Tris-NaCl, достигнув конечной концентрации 11 600 МЕ/мл. Вихрь.
4. Подготовка образцов плазмы
   1. Соберите венозную кровь в 3 мл цитратных пробирок с содержанием 3,2% цитрат, обеспечив сбор не менее 2,7 мл (90% наполнения).
   2. Не используйте первую трубку после венипункции; Отбросьте его, чтобы избежать активации тканевым фактором.
   3. Инвертируйте трубку не менее 10 раз сразу после сбора.
   4. Центрифуга в течение 2 часов при комнатной температуре — сначала 2 500 × г в течение 5 минут, затем 10 000 × г в течение 10 минут.
   5. Используйте одноразовую пипетку, чтобы собрать плазму чуть выше клеточного слоя.
   6. Аликвот плазму размечать в маркированные криовиалы, быстро заморозить в жидком азоте и хранить при −80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образец не содержит тромбов. Используйте только свежую или однократно размораженную плазму. Для анализа дублирования достаточно одной трубки CTAD.

2. Подготовка приборов и настройка программного обеспечения

1. Подготовьте считыватель флуоресцентных пластин
   1. Включите считыватель пластин и дайте ему выровняться до 37 °C.
   2. Установите следующие базовые параметры:
      1. Greiner 96-well с плоским дном, чёрный.
      2. Общие настройки: задержка позиционирования: 0,1 с; Количество кинетических окон: 1.
      3. Кинетическое окно: количество циклов: 140; Время начала измерения: 0,0 с; Количество вспышек на скважину за цикл: 10; Время цикла: 30 с.
      4. Оптика: Верхняя оптика
      5. Настройки фильтра: количество монохроматических фильтров: 2. Фильтр возбуждения: 355 нм для тромбина; 485 нм для плазмина. Эмиссионный фильтр: 460 нм для тромбина, 520 нм для плазмина. Прирост: 600.
   3. Определите планировку с максимальным количеством 20 скважин на пластину.
   4. Перейдите в раздел Концентрации/Объемы/Встряхивание и подтвердите следующие настройки. Насос 1 = 20 мкл; Насос 2 = 0 мкл; Скорость = 420 мкл/с.
2. Подготовьте систему впрыска
   1. Снимите и прополосните иглы для инъекций в контейнере с буфером.
   2. Установите объём полоскания на 2 500 мкл и промывайте насосы буфером 37 °C Tris/NaCl.
   3. Сбросьте объём промывания до 500 мкл.

3. Настройка анализа в формате микропластин

1. Установка вшейкеров с микропластинами
   1. Установите шейкер микропластин на 37 °C и проверьте температуру перед использованием.
   2. Установите интенсивность тряски на 1100 об/мин.
   3. Используйте этот шейкер для всех этапов смешивания анализа, чтобы обеспечить однородное распределение реагентов и постоянную ферментационную активность.
2. Добавьте реагенты в скважины
   1. Разморозить плазму пациента и нормальную сгруппированную плазму (NPP) в водяной бане при температуре 37 °C до 10 минут.
   2. Тщательно перемешайте и убедитесь, что размораживание полностью (без криопреципитата).
   3. Добавьте 80 мкл плазмы пациента или NPP в заранее выбранные скважины. Используйте свежий наконечник пипетки для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включайте выборку NPP в каждый пробег анализа, чтобы учесть изменчивость между пробегами (см. далее в шаге 5.6).
   4. Добавьте 2 мкл цефалина.
   5. Добавьте 2 мкл тканевого фактора (разбавление 1:500). Немного перемешайте с помощью шейкера.
   6. Добавьте 10 мкл буфера Tris-NaCl. Немного перемешайте с помощью шейкера.
   7. Добавьте 4 мкл тромбинового субстрата.
   8. Добавьте 2 мкл плазминового субстрата. Немного перемешайте с помощью шейкера.
3. Прединкубация
   1. Вставьте микропластину в считыватель пластин.
   2. Дайте пластине уравновеситься при 37 °C в течение нескольких минут.

4. Подготовка и введение стартового реагента

1. Подготовьте реагент для насоса 1
   1. Объедините 672 мкл буфера Tris/NaCl, 192 мкл буфера Tris/NaCl/CaCl₂ и 96 мкл tPA (начиная с шага 1.2.5). Вихрь тщательно.
   2. Проткните два отверстия в крышке реактивной трубки.
   3. Вставьте трубку насоса через одно отверстие к дну трубки.
2. Запускайте и запускайте анализ
   1. Используйте программное обеспечение, чтобы подготовить насос 500 мкл реагента.
   2. Вставьте иглы для инъекций обратно в назначенные им положения.
   3. Немедленно начинайте измерение флуоресценции.
3. Ручное запуск анализа
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ручная процедура инициации предоставляет альтернативу автоматизированному процессу инъекций, описанному в шагах 2.2, 4.1 и 4.2.
   1. Подготовьте стартовый реагент, как описано в 4.1.1, непосредственно перед использованием.
   2. Вынимите микропластину из считывателя пластин и быстро вручную добавьте 20 мкл стартового реагента в каждую яму, используя калиброванную или многоканальную пипетку для более быстрой обработки.
   3. Немедленно верните пластину в считыватель и немедленно начинайте измерение флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать время между добавлением реагента и началом измерения (<10 с на ряд) для снижения вариативности.
4. Кинетический показатель
   1. Записывайте флуоресценцию каждые 30 секунд в течение 70 минут.
   2. Поддерживайте температуру пластины при 37 °C во время измерения.

5. Анализ данных

1. Подготовьте данные к анализу
   1. Экспортировать данные кинетической флуоресценции из считывателя пластин в виде таблицы с временными точками и значениями флуоресценции на каждую скважину.
   2. Преобразуйте сырые флуоресцентные данные в кривые генерации ферментов, вычисляя первую производную с помощью Excel или другой программы.
   3. Постройте график кривых генерации ферментов для каждой ямы, чтобы визуализировать ферментативную реакцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти кривые отражают скорость генерации тромбина или плазмина со временем и соответствуют графическому выходу, показанному на рисунках.
2. Анализ кривых генерации тромбина
   1. Определите следующие параметры по кривой генерации тромбина (см. рисунок 1):
      1. Время задержки: Момент, когда кривая генерации тромбина стабильно растёт и достигает 8% от пика тромбина.
      2. Пиковая высота тромбина: максимальное значение сигнала на оси y (то есть максимальная скорость генерации тромбина).
      3. Время пика тромбина: время от начала анализа до высоты пика тромбина.
      4. Потенциал тромбина (область под кривой генерации тромбина): область под кривой от времени задержки до возвращения сигнала тромбина к базовой линии.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Потенциал тромбина отражает общую способность образца генерировать тромбин при условиях анализа.
3. Анализ кривых генерации плазминов
   1. Определите следующие параметры по кривой генерации плазминов (см. рисунок 2):
      1. Время лизиса фибрина: время от начала генерации плазмина (то есть момента, когда кривая генерации плазмина стабильно поднимается и достигает 8% от пика плазмина) до достижения пика плазмина.
      2. Пиковая высота плазмина: Первый явный максимум в кривой, соответствующий начальному всплеску генерации плазмина, определяется в точке, когда вторая производная кривой генерации плазмина (основанная на трёхминутном скользящем среднем) достигает нуля после начала генерации плазмина.
      3. Потенциал плазмина (площадь под кривой генерации плазмина): область под кривой от начала генерации плазмина до момента пика плазмина.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Флуктуации сигнала происходят после начального пика плазмина и не учитываются при анализе параметров генерации плазмина.
4. Извлекайте параметры вручную или с помощью собственного программного обеспечения
   1. Используйте Microsoft Excel, GraphPad Prism или собственный скрипт (например, на Python или R) для извлечения кинетических параметров.
   2. Сохраняйте исходные данные, нанесённые кривые и рассчитанные параметры в структурированном формате для архивирования и будущей ссылки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используете макросы, перед использованием автоматического вывода проверяйте корректность всех параметров визуально и вручную. Наш макрос для преобразования данных доступен по запросу.
5. Стандартизация и нормализация
   1. Установите физиологический ориентир, измерив 40 отдельных образцов здоровых доноров параллельно с образцом NPP, используемым для нормализации. Выполняйте этот шаг один раз за партию NPP.
   2. Вычислите средние значения параметров генерации тромбина и плазмина здоровых доноров и определите их отношение к соответствующим значениям NPP, полученным в том же пробеге.
   3. Для каждого пациента в данном пробеге сначала нормализуйте параметр генерации тромбина или плазмина до значения NPP, измеренного в том же забеге.
   4. Разделите этот результат на ранее установленное соотношение здорового донора к NPP для той же партии NPP (см. шаг 5.6.2). Это даёт относительное значение, нормированное для среднего здорового индивида, со стандартизацией для межзабеговых вариаций с помощью NPP.
   5. Выражать значения параметров в процентах относительно среднего значения здоровых индивидуумов (определяется как 100%). Предъявьте результаты выборки пациентов соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Относительные значения параметров для каждой отдельной выборки пациента рассчитываются по следующей формуле, где run a относится к измерению образцы пациента, а run b — к эталонному забегу, в котором здоровые образцы доноров измерялись параллельно с той же партией NPP. Наш файл Excel с расчётами нормализации данных доступен по запросу.
      

6. Генерация калибровочных кривых

1. Подготовьте кривую калибровки тромбина
   1. Восстановить лиофилизированный человеческий α-тромбин в соответствии с инструкциями в техническом штите производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если в техническом листе указано восстановление в воде 100 мкл с результатом 3,34 мг/мл, это соответствует 0,334 мг в 100 мкл.
   2. Разведите восстановленный тромбин 1:10 в буфере Tris/NaCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это даёт концентрацию запасов примерно 9,1 нмоль/мл (0,0091 нмоль/мл), исходя из молекулярной массы 36 700 г/моль.
   3. Подготовьте серию разбавления в буфере Tris/NaCl для достижения конечной концентрации тромбина в анализе от 0 до 152 нмоль/л.
   4. Пипетный тромбин в выбранные скважины, уже содержащие буфер, чтобы достичь общего объёма 100 мкл на скважину.
   5. Подготовьте раствор субстрата для насоса 1, смешивая 300 мкл буфера Tris/NaCl с 200 мкл тромбинового субстрата на этапе 1.2.2.
   6. Дополнительно разведите этот раствор, объединив 400 мкл смеси с 360 мкл буфера Tris/NaCl.
   7. Добавляйте 20 мкл этой смеси подложки в каждую калибровочную яму, увеличивая общий объём анализа до 120 мкл.
   8. Аккуратно перемешайте пластину и вставьте её в считыватель пластин. Запустите кинетический анализ в течение 25 циклов, используя те же настройки флуоресценции, описанные в разделе 2.
   9. Экспортируйте исходные флуоресцентные данные и определите начальный наклон (скорость увеличения флуоресценции за цикл) для каждой концентрации тромбина с помощью GraphPad Prism или аналогичного программного обеспечения.
   10. Сгенерируйте стандартную кривую, построив график начального наклона относительно концентрации тромбина.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все буферы предварительно нагреты до 37 °C и работайте с ферментами на льду. Всегда готовьте свежие растворы и тщательно перемешивайте. Полученная стандартная кривая используется для расчёта относительной активности тромбина в неизвестных образцах с помощью макроса, описанного в разделе 5.
2. Подготовка кривой калибровки плазмина
   1. Восстанавливать лиофилизированный плазмин в дистиллированной воде (например, 0,543 мл) согласно инструкциям производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмин имеет молекулярную массу 75 400 г/моль. Полученная концентрация запаса составляет примерно 24,3 нмоль/мл (0,024 нмоль/мкл), при условии 1 мг на 0,543 мл.
   2. Подготовьте серию разбавления в буфере Tris/NaCl для достижения конечной концентрации плазмина в анализе от 66 до 532 нмоль/л.
   3. Пипетный плазмин в колодцы с буфером Tris/NaCl, чтобы достичь итогового объёма 100 мкл на скважину.
   4. Подготовьте раствор подложки для насоса 1, смешав 680 мкл буфера Tris/NaCl с 80 мкл субстрата плазмина/родамина (предварительно разбавленной 1:1 при необходимости) начиная с шага 1.2.5.
   5. Добавьте 20 мкл этого раствора подложки в каждую калибровочную яму, увеличивая общий объём до 120 мкл.
   6. Аккуратно перемешайте пластину и вставьте её в считыватель пластин. Проведите кинетический анализ в течение 25 циклов с теми же настройками флуоресценции, что описаны в разделе 2.
   7. Экспортировать исходные данные флуоресценции и определить начальный наклон увеличения флуоресценции для каждой концентрации плазмина, применяя линейную регрессию к линейной фазе кинетической кривой с помощью GraphPad Prism или аналогичного программного обеспечения.
   8. Сгенерируйте стандартную кривую, построив график начального наклона относительно концентрации плазмина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за вариаций активности плазмина от партии к партии калибровку следует повторять с каждым новым партием. Если наблюдается неожиданно высокая активность, рекомендуется разбавлять запас в соотношении 1:2 перед подготовкой калибровочной серии.
3. Используйте кривую калибровки для количественной оценки
   1. Используйте калибровочные кривые, полученные в разделе 6, чтобы преобразовать значения наклона флуоресценции в относительную активность ферментов.
   2. Используйте только линейную часть кривой калибровки для интерполяции неизвестных образцов.

Результаты

Репрезентативные кривые генерации тромбина и плазмина, полученные с помощью Неймегенского гемостазного анализа (NHA), показаны на рисунке 3. Интенсивность сигнала каждой кривой выражается в процентах относительно одновременно измеренного образца нормальной пулированной плазмы (NPP). Образец с NPP включается в каждый пробег в качестве внутреннего контроля для проверки валидности анализа и обеспечения сопоставимости между пробегами.

Обсуждение

Неймегенский гемостазный анализ (NHA) — это фторогенный анализ с двойным ферментом, который позволяет одновременно измерять тромбина и плазмин с ограничением тромбоцитов в плазме, бедной тромбоцитами. Захватывая оба процесса в одной яме, метод облегчает высокоразрешающий кинетический анализ вторичного гемостаза и фибринолиза. Это двойное измерение обладает явными методологическими преимуществами по сравнению с традиционными анализами и успешно применяется при изучении дефицитов коагуляци...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<прочные>материалы
Кальций хлориддигидрат (CaCl2.2H2O)	Merck	1.02382
Цефалин (набор реагентов C.K. Prest 5 APTT)	Стаго	00847	Стабильный 6 месяцев при -20 &°C.
Дистиллированная вода			Запишите дату открытия. Используйте в течение дня после первого открытия.
Диметилсульфоксид (DMSO)	Merck	1.02950.0500
Человеческий альфа-тромбин	Лаборатории исследований ферментов	HT 1002a	В коробке находится листовка с сертификатом об анализе. Объём буфера для добавления зависит от заданной концентрации и должен быть скорректирован так, чтобы 1 & micro; L добавленного человеческого тромбина в 120 и микрограмм; L-реагент даёт итоговую концентрацию 76 нмоль/л.
Человеческий плазмин	Лаборатории исследований ферментов	HPlas	В коробке находится листовка с сертификатом об анализе. Объём буфера для добавления зависит от заданной концентрации и должен быть скорректирован так, чтобы 1 & micro; L добавленного человеческого плазмина в 120 и микромикрочастицах; L-реагент приводит к конечной концентрации 200 нмоль/л.
Нормальная плазма в бассейне	Внутренняя подготовка	Не применимо	Стабильно 3 часа после размораивания, если держать на льду.
Плазма пациентов	Не применимо	Не применимо
Субстрат плазмина (CBZ-L-фенилаланил-L-аргининамид) — родамин-морфолино-мочевина	Симерес		Стабильная 6 месяцев при -80 и °C.
Рекомбинантный фактор человеческой ткани (ТФ): Innovin	Дейд Беринг	B4212	Стабильная 6 месяцев при -80 и °C.
Рекомбинантный тканевый активатор плазминогена (tPA): Альтеплаза/Актилиза	Бёрингер Ингельхайм		Стабильный 12 месяцев при -80 и °C.
Трис(гидроксилметил)аминометан (H2NC(CH2OH)3)	Merck	1.08382.2500
Буфер Tris-NaCl, pH 7,4 (TBS)	Внутренняя подготовка	Не применимо
Буфер Tris-NaCl-CaCl2, pH 7,4 (TBS-Ca)	Внутренняя подготовка	Не применимо
Тромбинский субстрат Bz-бета-ала-гли-арг-7-амино-4-метилкумарин	Симерес		Стабильная 6 месяцев при -80 и °C.
<Сильно>Снаряжение
Fluostar Optima флюориметр / считыватель микропластин с реактивными инжекторами и реагентами	BMG Labtech
Микротитровая пластина с 96 лунками, полистирол, плоскодонная, чёрная, средняя связующая поверхность (эквивалент Microlon)	Greiner BIO-ONE	655076
Аналитический баланс (баланс верхнего нагрузки)
Синие наконечники пипеток (для 100-1000 и микро; L)
Цитратные пробирки крови 3 мл (3,2% цитрат)	BD Vacutainer
Ведро для льда
Ледяная машина
Инкубатор / шейкер микропластин
Магнитный мешаль
Стойка с микроцентрифугами
Микроцентрифугные трубки, которые можно закрыть
pH-метр
Кончики пипетт 0.1-10 и микро; L, нестерильный
Пипетки (2, 10, 20, 100 и 1000 & micro; L)
Отвертка (используется как зонд)
Ламповый миксер
Водяная баня
Жёлтые наконечники пипеток (для 20-200 и микро; L)