Методическая статья

Разработка новой модели внутренней фиксации радиальных переломов крыс: оценка заживления переломов и изоляция ганглия дорсального корня

724 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69707

⸱

13 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Nantong Tongzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Institute of Modern Biology, Nanjing University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В исследовании инновационно сочетаются швы и титановые иглы для стабильной внутренней фиксации в модели лучевого перелома крысы. Заживление переломов оценивалось с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ), а нейроны первичного дорсального корневой ганглии (DRG) были выделены и культивированы для дальнейших исследований.

Аннотация

Модель лучевого перелома крыс имеет большое значение в ортопедических исследованиях, особенно для изучения механизмов заживления переломов, скрининга лекарств и оценки биологических материалов. Несмотря на определённые ограничения, её роль в научных исследованиях остаётся незаменимой. Поскольку радиус крыс относительно узкий, стальные пластины и винты, используемые в настоящее время в клинической практике, не подходят для лечения лучевых переломов крыс. Для устранения этого ограничения в этом исследовании инновационно применяется фиксация швами и титановой иглой — внутренняя модель фиксации радиальных переломов, обеспечивающая относительно стабильную фиксацию и создающую надёжную модель для изучения внутренней фиксации таких переломов. In vivo визуализация проводилась с использованием микро-КТ системы живых животных для обнаружения заживления лучевых переломов у крыс Sprague-Dawley (SD). Извлечение и применение DRG крыс — важные этапы в нейронаучных исследованиях, широко используемых в таких областях, как нейронаука, патология и клеточная биология. Этот протокол подходит для первичной культуры ганглиозных нейронов дорсального корня у крыс с лучевыми переломами и может использоваться для изучения механизмов повреждения нервов и восстановления после переломов, таких как апоптоз нейронов и высвобождение нейромедиаторов.

Введение

Лучевые переломы являются одними из самых распространённых клинических переломов с высокой глобальной частотой и являются одной из ведущих причин переломов длинных костейконечностей 1, 2, 3. Популяционные исследования показывают бимодальное возрастное распределение лучевых переломов, обычно достигающее пика как у детей, так и у пожилыхпопуляций 4. Задержка лечения часто приводит к дисфункции ротации предплечья, что серьёзно нарушает повседневную жизнь (АДЛ)5,6. Споры в области лечения радиальных переломов сохраняются, главным образом сосредоточенные на системах классификации переломов и выборе методовлечения 7,8. Клинические данные свидетельствуют о том, что внутренняя фиксация открытой редукции (ORIF) значительно улучшает амплитуду движений локтя или запястья (ROM) и восстановлениесилы 9; однако этот подход связан с более высокими показателями послеоперационных инфекций и осложнений, связанных с внутреннейфиксацией 10,11.

DRG служит важным анатомическим и функциональным мостом для передачи сенсорной информации между периферической и центральной нервной системами (ЦНС). Помимо своей основной роли в сборе и передаче периферических сенсорных сигналов (например, осязания, температуры), DRG активно регулирует аномальные ощущения, такие как боль, что делает его ключевой структурой, лежащей в основе как нормальной сенсорной функции, так и клинического управленияболью 12,13,14. Патологические изменения, такие как травма, воспаление или нейродегенерация в DRG, могут вызывать сенсорные аномалии (например, онемение, покалывание) или хроническую боль, что делает его центром исследований в области нейронауки и медицины боли.

Здесь были отобраны 8-недельные самцы SD весом примерно 200 г для построения (1) модели внутренней фиксации для радиальных поперечных переломов у крыс и последующего обследования после заживления, а также (2) выделения и экстракорпорально культивирования DRG у крыс с использованием модели внутренней фиксации для лучевых переломов. Этот протокол разработан для облегчения воспроизводимых экспериментов в исследованиях, изучающих механизмы заживления переломов, сенсорные изменения, опосредованные DRG, и потенциальные терапевтические цели для боли или дисфункции после перелома.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Нанкинского университета китайской медицины (No 202508A046). Все крысы, использованные в следующих анализах, содержались в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF). Схема, представляющая протокол, показана на рисунке 1.

1. Создание внутренней модели фиксации радиальных переломов у крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы привыкли к тихой среде с мягким, рассеянным освещением до операции, защищая их от шума и резкого освещения. Во время обращения с крысами живот и грудь поддерживались мягким ручным удержанием, избегая хвата за хвост — практики, известной тем, что вызывает боль и страдания, а также снижает дискомфорт, связанный с борьбой.

  1. Подготовьте хирургические инструменты, как показано на рисунке 2. Хирургические инструменты включают лезвие скальпеля, рукоятку скальпеля, ножницы, держатель для иглы, гемостатические щипцы и зубчатые тканевые щипцы. Самец крысы Sprague-Dawley (SD) был примерно 8 недель в возрасте и весил около 200 г.
  2. Анестезиируйте крысу с помощью аппарата для газовой анестезии с изофлураном. Для индукции используйте 4% изофлуран и поддерживайте вентиляционную анестезию (2% изофлурана) с помощью носового конуса на протяжении всей операции. Поддерживайте температуру в операционной примерно на уровне 28 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите успех анестезии, проверяя жизненно важные показатели (такие как дыхание и частота сердечных сокращений), роговицовый рефлекс (отсутствие ответа указывает на эффективную анестезию), рефлекс моргания (отсутствие) и реакцию на сокращение пальцев ног (без втягивания после стимуляции).
  3. Поставьте крысу в боковое положение, обнажите правую переднюю конечность и сбрийте шерсть с помощью машинки для стрижки. Накройте стерильную простыню и обмотайте жгутом проксимальную правую переднюю конечность, чтобы уменьшить хирургическое кровотечение.
  4. Подготовьте кожу, чередуя спирт и бетадин три раза.
  5. Сделайте продольный разрез диаметром 1,5 см на спинной радиальной стороне правого предплечья, как показано на рисунке 3. Разделите мышечные пространства и полностью обнажите радиус правой передней конечности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Радиус обнажается тупым разделением мышц вдоль межмышечного пространства. Обнажаются только спинные мышцы лучевой кости, не полностью стирая окружающие мышцы.
  6. Используйте рабочие ножницы, чтобы разрезать радиус и создать поперечный перелом. Ножницы ориентированы под углом 90 градусов к радиусу (см. рисунок 4).
  7. Возьмите титановую иглу диаметром 0,8 мм и длиной 10 мм и введите её в лучевую трещину вдоль продольной оси (рисунок 5). Фиксируйте радиус и титановую иглу швом (4-0 [1,5 метрический] шёлковый плетёный, невпитывающийся), как показано на рисунке 6.
  8. Завяжите шов тремя последовательными узлами и закрепите титановую иглу к радиусу четырьмя прерванными швами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проксимальный и дистальный концы перелома фиксируются дважды соответственно.
  9. Зашивайте кожу (4-0 [1,5 метрически], шёлковые плетёные, не впитывающиеся) кожу, срежьте лишний шов и закройте рану. Дезинфицируйте кожу скрабами с бетадином.
  10. Закройте рану стерильной марлей и закрепите бинтами. Поместите крысу в клетку, чтобы она пришла в сознание до восстановления.
  11. Послеоперационное управление болью:
    1. Если животное проявляет признаки боли, не ест и/или колеблется ходить на задних конечностях, проконсультируйтесь с ветеринаром и введите дополнительные обезболивающие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цефуроксим натрия используется для лечения бактериальных инфекций. Для введения обезболивающих используется трамадолгидрохлорид.

2. Микрокомпьютерная томография

  1. Анестезируйте крысу с помощью аппарата для анестезии с газом изофлуран (индукционная доза 4%).
  2. Поместите крысу в положение лежа в камере сканирования, отрегулируйте положение конечностей и головы, чтобы центрировать область сканирования цели в поле зрения, и поддерживайте непрерывную вентиляцию и анестезию (2% изофлуран) на протяжении всей процедуры.
  3. Засунь неподвижную кровать для животных в камеру сканирования и закрой дверь камеры.
  4. Установите параметры микро-КТ сканирования следующим образом. Режим сканирования: стандартный; Время экспозиции: 2 мин; поле зрения: 72 мм; размер вокселя: 144 мкм; напряжение: 90 кВ; ток: 88 мкА; фильтр: 3D-мягкий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные сканирования автоматически передаются программному обеспечению, и формируется трёхмерное КТ-изображение.
  5. Разделите целевые ткани.
    1. Проанализировать выбранную область костной ткани по исходным микро-КТ-изображениям. Сдвигайте линию переносной функции, чтобы отделить кость от мышцы, избегая слишком большого количества мышечной ткани. Выполните высокоразрешающую реконструкцию сегментированной области костной ткани для создания 3D-модели.
  6. Экспортировать обработанные изображения.
    1. После обработки изображений найдите и нажмите кнопку завершения , чтобы завершить текущий рабочий процесс.
    2. Появится всплывающее окно, сначала выберите неподвижное , чтобы убедиться, что хотите экспортировать статическое изображение (не динамическую последовательность).
    3. Выберите jpeg в качестве формата выхода из доступных опций.
    4. Выберите большой размер , чтобы экспортированное изображение сохраняло высокое разрешение, подходящее для анализа или документации.
    5. Нажмите OK , чтобы завершить процесс экспорта.

3. Изоляция и культивирование DRG у крыс с лучевыми переломами

ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия проводится с помощью 4% изофлурановой анестезии, после чего происходит быстрое вывих шейки матки для эвтаназии животных. DRG извлекаются через 20 дней после установления модели лучевого перелома.

  1. Перерезать позвоночник, удалить позвоночники C1-C7. Разрежьте шейный позвоночник вдоль передней и задней средней линии и разделите его на левую и правую половины. При необходимости отрежьте шиповые отростки для облегчения работы.
  2. Аккуратно очистите ткани спинного мозга и нервные волокна внутри межпозвоночного отверстия. Промывайте межпозвоночный отверстие шприцом, наполненным PBS, чтобы удалить кровь и обнажить боковые углубления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DRG расположен внутри боковых углублений, выглядя как светло-жёлтый узел, с нервными волокнами, соединёнными с обоих концов.
  3. Используйте зубчатые тканевые щипцы, чтобы поднять DRG, аккуратно поднимать его, а затем с помощью ножниц для перерезки нервных волокон с обоих концов.
  4. Переместить извлеченные DRG в центрифугную трубку объёмом 1,5 мл с экстракционной формой; Поставить на лёд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте среду для экстракции, добавив 2% сыворотки плода (FBS) к α-Минимально необходимой среде (α-MEM). DRG инкубируются в экстракционной среде около 30 минут, после чего переходят к следующему этапу.
  5. Медленно аспирируйте и избавляйтесь от экстракционной среды. Добавьте 1 мл смешанного раствора пищеварительных ферментов. Переваривайте в водяной бане при температуре 37 °C в течение 60-70 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить рабочий раствор смешанного пищеварительного фермента, растворите 100 мг коллагеназы первого типа и 100 мг диспазы в 1 мл фосфатно-буферного физраствора (PBS). При использовании разбавьте до рабочего раствора 5 мг/мл и храните на льду.
  6. Покрытие чашки Петри пипетированием соответствующего объёма рабочего раствора фибронектина, затем инкубировать при 37 °C в течение 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор фибронектина в плазме человека (рабочий раствор фибронектина) готовится путём разбавления 1 мг/мл раствора фибронектина с ddH₂O до рабочего раствора фибронектина с концентрацией 0,02 мг/мл.
  7. После пищеварения, аспирируйте и выбросьте смесь фермента, действующего фермента пищеварителя. Добавьте 1 мл полной среды и аккуратно пипетируйте ткань DRG несколько раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки полного среднего вещества смешайте 45 мл среды MEM-α, 4,5 мл FBS и 0,5 мл раствора пенициллина-стрептомицина (PS), а затем стерилизуйте фильтрацией через микропористую мембрану диаметром 0,22 мкм.
  8. Соберите фильтрат, центрифугуйте при 75 × г на 8,5 минут при 25 °C.
  9. После центрифугирования аспирируйте и сбрасываете супернатант в центрифугную трубку, добавляя 1 мл полной среды для повторного суспензия осадка.
  10. Достань чашку Петри. Отбросьте рабочий раствор с фибронектином и дважды промой с помощью PBS.
  11. Инокулировать клетки в покрытую чашку Петри, добавить 1 мл полной среды и инкубировать в инкубаторе с постоянной температурой при 37 °C с 5% CO₂ в течение 8-12 часов.
  12. Через 8-12 часов замените полный материал на замену. Затем заменяйте половину объёма на замену среды каждые 2-3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления замены среды смешайте 44,5 мл среды MEM-α, 4,5 мл FBS, 0,5 мл раствора пенициллина-стрептомицина (PS) и 0,5 мл дезоксиуридина. Стерилизовать фильтрацией через микропористую мембрану диаметром 0,22 мкм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Микро-КТ-изображения подтвердили успешное создание моделей крыс с лучевым переломом на рисунке 7 и модели внутренней фиксации лучевых переломов крыс на рисунке 8. Микро-КТ-изображения сравнивались в день построения внутренней фиксационной модели перелома и двадцать дней после формирования модели. Через двадцать дней после моделирования микро-КТ-анализ крыс с SD в группе модели перелома показал благоприятный прогноз. Изображения ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Лучевой перелом — один из самых распространённых переломов длинных костей в клинической практике. Процесс заживления включает сложные взаимодействия между восстановлением костной ткани и нейрорегуляцией (например, регуляцией остеобластов/остеокластов нейропептидами и нейротрофическими факторами, выделяемыми из ганглия дорсального корня)15,16,17,18. Крысы являют...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет потенциальных конфликтов интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами научно-исследовательского проекта общества традиционной китайской медицины Цзянсу (XYLD2024038) и научного исследовательского проекта Комитета по здравоохранению и благополучию Наньтун (QNZ2023115).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-фтор-2' дезоксиуридинSigmaF0503
Цефуроксим натрий Shandong Runze Pharmaceutical Co., Ltd., КитайГояо Чжуньцзы H20205058
Раствор для окрашивания DAPIBiyotimeC1005
ДисперсазаShanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd.S25046
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)Термо16000-044
гемостатические щипцы, nbsp;Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. J31070
Человеческий плазменный фибронектин (человеческий фибронектин) SigmaF0895
ИзофлуранЗадний приводR510-22-10 
Система микро-КТ для живых животныхPerkinElmer в СШАQuantum GX 
Среда культуры MEM-ALPHA  BIC3060
держатель для иглы и bbsp;Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. 200622
Работа с ножницами и nbsp;Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. J21130
пенициллинSolarbio140051251
Раствор пенициллина-стрептомицина NovaCellsN-PSS125
повидон-йодМейлунбиоMB1313800g
Лезвие скальпеляShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.RYY070
Рукоятка скальпеляShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. J11010
швы Johnson & Johnson MEDICAL (CHINA) Ltd. SA84G
Игла для шваШанхай XIAOYU MEDICAL EQUIPMENTS. Δ 3/8 и middot; 3 и раза; 6
Титановая иглаТяньцзинь Ютун Медицинское Устройство  2-0X250 
зубчатые тканевые щипцы Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. J41055
Трамадол-гидрохлоридФармацевтическая компания Jiangsu Jiuxu Ltd., КитайCYHB2201997
Тубулин бета-IIISigmaCBL412X
Тип I коллагеназа Термо17100-017
Инвертированный флуоресцентный микроскоп Zeiss Axio Vert A1ZeissAxio Vert A1

Ссылки

  1. GBD 2019 Fracture Collaborators. Global, regional, and national burden of bone fractures in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis from the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet Healthy Longev. 2 (9), e580-e592 (2021).
  2. Zeng, Y., et al. The incidence, prevalence, and health burden of forearm fractures in China from 1992 to 2021 and forecasts for 2036. Front Public Health. 13, 1566421(2025).
  3. Miskiewicz, M., Hakimi, A., Ling, K., Tesoriero, J., Komatsu, D., Wang, E. Epidemiology, risk factor, and economic analysis of peripheral nerve injury following distal radius fractures. Eur J Orthop Surg Traumatol. 35 (1), 292(2025).
  4. Olech, J., Ciszewski, M., Morasiewicz, P. Epidemiology of distal radius fractures in children and adults during the COVID-19 pandemic - a two-center study. BMC Musculoskelet Disord. 22 (1), 306(2021).
  5. Liu, K., Grigor, E. J. M., Antflek, D., Ho, G., Baltzer, H. L., Paul, R. Time to surgical management of distal radius fractures: effects on health care utilization and functional outcomes. Can J Surg. 67 (4), E286-E294 (2024).
  6. Khan, S., Persitz, J., Shrouder-Henry, J., Khan, M., Chan, A., Paul, R. Effect of time-to-surgery on distal radius fracture outcomes: A systematic review. J Hand Surg Am. 48 (5), 435-443 (2023).
  7. Hunt, J. J., Lumsdaine, W., Attia, J., Balogh, Z. J. AO type-C distal radius fractures: the influence of computed tomography on surgeon's decision-making. ANZ J Surg. 83 (9), 676-678 (2013).
  8. Gutiérrez-Espinoza, H., et al. Effectiveness and safety of different treatment modalities for patients older than 60 years with distal radius fracture: A network meta-analysis of clinical trials. Int J Environ Res Public Health. 20 (4), 3697(2023).
  9. Rozental, T. D., Blazar, P. E., Franko, O. I., Chacko, A. T., Earp, B. E., Day, C. S. Functional outcomes for unstable distal radial fractures treated with open reduction and internal fixation or closed reduction and percutaneous fixation: A prospective randomized trial. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1837-1846 (2009).
  10. Bentohami, A., De Burlet, K., De Korte, N., Selles, R. W., Goslings, J. C., Schep, N. W. Complications following volar locking plate fixation for distal radial fractures: a systematic review. J Hand Surg Eur. 39 (7), 745-754 (2014).
  11. Jiang, J. J., Phillips, C. S., Levitz, S. P., Benson, L. S. Risk factors for complications following open reduction internal fixation of distal radius fractures. J Hand Surg Am. 39 (12), 2365-2372 (2014).
  12. Qiu, X., et al. Satellite glial cells in sensory ganglia play a wider role in chronic pain via multiple mechanisms. Neural Regen Res. 19 (5), 1056-1063 (2024).
  13. Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Med. 15 (10), 1669-1685 (2014).
  14. Sapunar, D., Kostic, S., Banozic, A., Puljak, L. Dorsal root ganglion-a potential new therapeutic target for neuropathic pain. J Pain Res. 5, 31-38 (2012).
  15. Liang, T. Z., et al. Targeting the central and peripheral nervous system to regulate bone homeostasis: mechanisms and potential therapies. Mil Med Res. 12 (1), 13(2025).
  16. Tuzmen, C., Campbell, P. G. Crosstalk between neuropeptides SP and CGRP in regulation of BMP2-induced bone differentiation. Connect Tissue Res. 59 (sup1), 81-90 (2018).
  17. He, H., et al. CGRP may regulate bone metabolism through stimulating osteoblast differentiation and inhibiting osteoclast formation. Mol Med Rep. 13 (5), 3977-3984 (2016).
  18. Wang, L., et al. Calcitonin-gene-related peptide stimulates stromal cell osteogenic differentiation and inhibits RANKL induced NF-kappaB activation, osteoclastogenesis and bone resorption. Bone. 46 (5), 1369-1379 (2010).
  19. Harris, I., Hatfield, A., Donald, G., Walton, J. Outcome after intramedullary nailing of femoral shaft fractures. ANZ J Surg. 73 (6), 387-389 (2003).
  20. Lin, C., Sun, J. S., Hou, S. M. External fixation with or without supplementary intramedullary Kirschner wires in the treatment of distal radial fractures. Can J Surg. 47 (6), 431-437 (2004).
  21. Board, T. N., Yang, L., Saleh, M. Why fine-wire fixators work: an analysis of pressure distribution at the wire-bone interface. J Biomech. 40 (1), 20-25 (2007).
  22. Bäcker, H. C., Heyland, M., Wu, C. H., Perka, C., Stöckle, U., Braun, K. F. Breakage of intramedullary femoral nailing or femoral plating: how to prevent implant failure. Eur J Med Res. 27 (1), 7(2022).
  23. Lethaby, A., Temple, J., Santy-Tomlinson, J. Pin site care for preventing infections associated with external bone fixators and pins. Cochrane Database Syst Rev. 2013 (12), CD004551(2013).
  24. Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nat Rev Microbiol. 16 (7), 397-409 (2018).
  25. Box, M. W., et al. Intramedullary nail fixation versus open reduction and internal fixation for treatment of adult diaphyseal forearm fractures: a systematic review and meta-analysis. J Orthop Surg Res. 19 (1), 719(2024).
  26. Burnikel, A., Faucher, G. Treatment of metacarpal and phalangeal fractures: Intramedullary screw technique. JBJS Essent Surg Tech. 15 (4), e23.00032(2025).
  27. Aktan, C., Ertan, M. B., Turan, A., Kose, O. Fixation of small osteochondral fragments in a comminuted distal humerus fracture with magnesium bioabsorbable screws: A case report. Cureus. 10 (12), e3752(2018).
  28. Shyamalan, G., Theokli, C., Pearse, Y., Tennent, D. Volar locking plates versus Kirschner wires for distal radial fractures-a cost analysis study. Injury. 40 (12), 1279-1281 (2009).
  29. Wang, D., Huang, X., Lv, W., Zhou, J. The toxicity and antibacterial effects of povidone-iodine irrigation in fracture surgery. Orthop Surg. 14 (9), 2286-2297 (2022).
  30. Shiels, S. M., Muire, P. J., Wenke, J. C. FK506 increases susceptibility to musculoskeletal infection in a rodent model. BMC Musculoskelet Disord. 23 (1), 716(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи