Надёжна ли устойчивость к тейкопланину автоматизированной системой в штаммах Staphylococcus spp?

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для оценки надёжности автоматизированной системы (VITEK 2) для определения восприимчивости тейкопланина в изолятах Staphylococcus путем сравнения с микроразбавлением бульона (BMD), с применением для подтверждения резистентности и направления соответствующей антимикробной терапии.

Аннотация

В это исследование было включено всего 467 изолятов Staphylococcus aureus (S. aureus) и 66 коагулазово-отрицательных изолятов Staphylococcus (CoNS), собранных с июня 2022 по декабрь 2024 года. Тестирование на чувствительность к тейкопланину проводилось с использованием автоматизированной системы тестирования антимикробной чувствительности, микроразбавления бульона (BMD) и метода градиентного тестирования. Резистентность к метициллину была обнаружена в 71,7% изолятов S. aureus и во всех изолятах CoNS. В этом исследовании было выявлено 13 изолятов S. aureus и 4 изолята CoNS как устойчивые к тейкопланину с помощью автоматизированной системы тестирования восприимчивости. Все 13 изолятов S. aureus были признаны восприимчивыми к тейкопланину как с помощью градиентного теста, так и BMD. Все четыре изолята CoNS были выявлены как восприимчивые с помощью градиентного теста, тогда как BMD классифицировал два изолята как восприимчивые, а два — как устойчивые. Устойчивость к тейкопланину была обнаружена в четырёх штаммах [S. capitis (n = 1) и S. haemolyticus (n = 3)] среди изолятов CoNS с помощью BMD. Четыре тейкопланин-резистентных штамма CoNS, выявленные при БМД, были выделены из кровяных культур; три из них были получены у педиатрических пациентов и одно — от взрослого пациента. В целом, уровень метициллин-резистентности S. aureus (MRSA) был относительно высоким в исследовании, и все изоляты CoNS были устойчивы к метициллину. Кроме того, автоматизированные системы оказались ненадёжными для определения устойчивости к тейкопланину, и изоляты, выявленные как устойчивые, должны подтверждаться с помощью BMD. Учитывая, что тейкопланин является антибиотиком последней инстанции, используемым для лечения таких патогенов, как MRSA и метициллин-резистентный CoNS, его восприимчивость следует тщательно контролировать.

Введение

Staphylococcus aureus (S. aureus) — один из самых клинически значимых видов рода Staphylococcus благодаря широкому спектру факторов вирулентности и способности вызывать тяжёлые инфекции в различных тканях и органах. Он отвечает за кожные и мягкотканные инфекции, глубокие ткани, дыхательные пути, инфекции мочевыводящих и кровяных инфекций и остаётся одним из важнейших патогенов в^{больничных условиях 1,2}. В частности, метициллин-резистентный S. aureus (MRSA) является основной причиной медицинских инфекций во всем мире и продолжает оставаться одной из ведущих причин послеоперационных ран ^2,3. Коагулаза-отрицательные стафилококки (CoNS), хотя и являются частью нормальной кожной флоры, в последние годы всё чаще участвуют как в локальных, так и в системных инфекциях. Это увеличение привело к более частому тестированию на чувствительность к антимикробным препаратам и, соответственно, к увеличению устойчивости к гликопептидным антибиотикам, таким как^{тейкопланин 4}.

Поскольку штаммы S. aureus и CoNS часто проявляют устойчивость к β-лактамным антибиотикам, гликопептидные антибиотики, преимущественно ванкомицин и тейкопланин, широко используются для лечения этих инфекций5. Рост распространённости резистентных грамположительных нозокомиальных патогенов привёл к расширению использования гликопептидов, что способствовало снижению восприимчивости бактерий к этим^{агентам 5,6}. Ванкомицин и тейкопланин обладают сопоставимой антимикробной эффективностью; Однако несколько исследований показали, что тейкопланин связан с меньшим количеством побочных эффектов, особенно с уменьшением нефротоксичности ^7,8. Поэтому тейкопланин часто считается подходящей альтернативой ванкомицину в определённых группах пациентов, включая тех, у кого нейтропения, бактериемия или нарушение функции^{почек 9,10}.

Быстрое и точное определение восприимчивости к гликопептидам важно из-за широкого применения этих препаратов при метициллин-резистентных инфекциях стафилококка и росту сообщений о штаммах, устойчивых к^{гликопептидам 11}. Существует несколько лабораторных методов оценки восприимчивости к гликопептидам у видов рода Staphylococcus, включая разбавление агара, градиентные тесты, микродилиментирование бульона (BMD) и автоматизированные системы тестирования чувствительности к^{антимикробным препаратам 5}. Предыдущие исследования отмечали расхождения между автоматизированными системами и эталонными методами при выявлении сниженной восприимчивости или устойчивости к гликопептидам, особенно к тейкопланину, у видов Staphylococcus ^4,11.

Данное исследование было направлено на оценку надежности автоматизированной системы тестирования чувствительности к антимикробным препаратам для определения чувствительности к тейкопланину в изолятах Staphylococcus по сравнению с методом микроразведения бульона, который является эталонным стандартом. Оценка характеристик работы автоматизированной системы может помочь клиническим лабораториям оценить её пригодность для рутинного выявления восприимчивости к гликопептидам в клинической практике.

Протокол

Исследование было одобрено местным этическим комитетом 27 января 2025 года (номер протокола: HRU/25.02.03). Исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

1. Дизайн исследования

В этом ретроспективном исследовании оценивалась работа автоматизированной системы тестирования чувствительности к антимикробным препаратам для определения чувствительности к тейкопланину у видов Staphylococcus , сравнивая результаты с эталонным методом микроразбавления бульона (BMD) и методом градиентного тестирования.

2. Изолированный отбор

1. Коллекция клинических изолятов
   1. Включите в общей сложности 467 изолятов S. aureus и 66 коагулаза-отрицательных изолятов Staphylococcus (CoNS), полученных из различных клинических образцов в период с июня 2022 по декабрь 2024 года.
   2. Обрабатывайте все клинические образцы в соответствии с рутинными микробиологическими процедурами в диагностической лаборатории.
   3. Включайте в анализ только один изолят на каждого пациента. Исключить повторяющиеся изоляты, полученные из разных образцов одного и того же пациента.
2. Первичная идентификация и проверка
   1. Идентифицировать все изоляты на уровне видов с помощью масс-спектрометрии лазерной десорбции с помощью масс-спектрометрии времени полёта (MALDI-TOF MS).
   2. Проверьте изолировать S. aureus и CoNS на устойчивость к метициллину и чувствительность к тейкопланину с помощью карт VITEK 2 AST-P664 с автоматизированной системой тестирования восприимчивости.
   3. Запишите значения минимальной ингибиторной концентрации (MIC), создаваемые автоматизированной системой тестирования восприимчивости, для последующего сравнения.
3. Изолятивное хранение и субкультура
   1. Изоляты храните при −80 °C в триптическом соевом бульоне с добавлением 20% глицерола согласно автоматизированной системе тестирования восприимчивости.
   2. Перед эталонным тестированием оттаивание изолируют при комнатной температуре и дважды субкультурируют их на 5% агаре овечьей крови.
   3. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 24 часов после каждого прохода, чтобы обеспечить чистоту и жизнеспособность.

3. Тестирование на антимикробную чувствительность

1. Микроразбавление бульона (BMD)
   1. Подготовка растворов тейкопланина
      1. Приготовьте стандартный раствор порошка тейкопланина в концентрации 2560 мг/л в катионно-скорректированном бульоне Мюллера-Хинтона (CAMHB).
   2. Процедура микроразбавления бульона
      1. Проведите микроразбавление бульона с использованием стерильных микропластин с 96 лунками U-дна.
      2. В каждую скважину вливайте по 100 мкл CAMHB. Разведите раствор тейкопланина в десять раз и добавьте 100 мкл в первую скважину.
      3. Подготовьте двойное серийное разбавление в скважинах 1–10 для получения окончательных концентраций антибиотиков от 64 до 0,125 мкг/мл.
      4. Используйте колодец 11 как средство контроля роста, содержащее CAMHB и бактериальный инокулум. Используйте скважину 12 как отрицательный контроль, содержащий только^{CAMHB 12}.
   3. Подготовка и инкубация инокулума
      1. Подвесить чистые бактериальные колонии в стерильном физиологическом растворе и скорректировать суспензию до мутности, эквивалентной стандарту Макфарланда 0,5.
      2. Приготовьте разбавление в CAMHB в соотношении 1:100 и добавьте 100 мкл бактериальной суспензии в колодцы 1–11, чтобы получить итоговую концентрацию инокуля примерно 5 × 10⁵ CFU/mL.
      3. Инкубировать микропластины при 37 °C в течение 24 часов в атмосферных^{условиях 12}.
   4. Определение и интерпретация MIC
      1. Определите минимальную тормозную концентрацию (MIC) как наименьшую концентрацию тейкопланина, которая полностью подавляет видимый рост бактерий после инкубации.
      2. Интерпретировать значения MIC в соответствии с руководящими принципами Европейского комитета по тестированию на антимикробную восприимчивость (EUCAST) версии^{14.0 13}.

4. Контроль качества

1. Используйте Staphylococcus aureus ATCC 29213 с референсным диапазоном тейкопланина MIC 0,25–1 мг/л в качестве контроля качества.

5. Статистический анализ

1. Сравнение методов
   1. Сравните результаты MIC по тейкопланину, полученные с помощью автоматизированной системы тестирования восприимчивости, с результатами, полученными с помощью эталонного метода BMD.
   2. Определите категориальное согласие (CA) как согласованные, восприимчивые или устойчивые результаты между двумя методами.
2. Классификация ошибок
   1. Определите очень серьёзные ошибки (VME) как изоляты, классифицированные как восприимчивые автоматизированной системой тестирования на восприимчивость, но устойчивые к BMD.
   2. Определите основные ошибки (ME) как изоляты, классифицируемые как устойчивые в автоматизированной системе тестирования на восприимчивость, но восприимчивые к BMD.
3. Критерии исполнения
   1. Считайте, что эффективность метода приемлема, если категориальное согласование составляет ≥90%, а показатели VME и ME — ≤3%, в соответствии с опубликованными критериями оценки^14,15.

Результаты

В анализ было включено 533 изолята, полученных из клинических образцов за 2,5 года. Все изоляты, устойчивые к метициллину CoNS (MR-CoNS), а также 71,7% изолятов S. aureus были признаны устойчивыми к метициллину. Образцы мазка из раны были наиболее распространёнными клиническими образцами с изолятами S. aureus , тогда как изоляты MR-CoNS чаще всего извлекались из кровяных культур (см. рисунок 1).

Обсуждение

Антимикробная устойчивость является одной из самых серьёзных угроз для глобального общественного здоровья, способствующей росту затрат на здравоохранение, неудачам лечения и^{смертности 3}. Частота случаев как в сообществе, так и в больнице, вызванных Staphylococcus aureus , продолжает расти как на национальном, так и на глобальном уровне. Особенно резистентность к метициллину связана с повышенной заболеваемостью и смертностью; Поэтому профили резистентности...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бульон Мюллера-Хинтона, скорректированный на катионы	Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия	CM0405B	Для бактериального роста в методе микроразбавления бульона
MALDI-TOF MS	VITEK MS, биомедицина и острые предметы; Рьё, Франция	410893	Для бактериальной идентификации
Стандарт Макфарланда	bioMé Рьё, Франция	95060-958	Стандартизация бактериального инокулума
Чашки Петри	RTA, Tü rkiye	2102	Для средней подготовки и бактериального выращивания
Кончик пиппетты 20 - 200 &m; L	Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия	Z740105	Для распределения катионно-скорректированного Мюллера и Мюллера; Бульон Хинтона (CAMHB) в U-образные микропластины и подготовка последовательных разбавлений
Агар из овечьей крови	RTA, Tü rkiye	2001	Выделение и культивирование микроорганизмов
Золотистый стафилококк	Коллекция американской типографической культуры	29213	Эталонный штамм, использованный в этом исследовании
Порошок тейкопланина	Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия	T0578	Антибиотики
Триптический соевый бульон	Merck, Германия	1,054,590,500	Выделение и культивирование микроорганизмов
U-нижняя пластина скважины	Термо Фишер Сайентифик	163320	Для тестирования антимикробной чувствительности методом микроразбавления бульона
VITEK 2 AST-P664 и nbsp;	bioMé Рьё, Франция	414197	Для тестирования на чувствительность к антимикробным препаратам
VITEK2 Compact	bioMé Рьё, Франция	4700030	Для тестирования на чувствительность к антимикробным препаратам