Методическая статья

Мультиплексированный иммунофлуоресцентный анализ для пространственной оценки маркеров старения in vivo

532 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69742

⸱

24 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Blizard Institute, Faculty of Medicine and Dentistry, Queen Mary University of London

В этой статье

Краткое содержание

Мультиплексированная иммунофлуоресценция позволяет последовательно маркировать несколько маркеров антител в одном срезе ткани для пространственного анализа архитектуры тканей и популяций клеток. Здесь представлен рабочий процесс для мультиплексного обнаружения маркеров, связанных со старением, структурных и иммунных маркеров, включая ручную и автоматическую подготовку слайдов, итеративную визуализацию и анализ отдельных клеток с использованием программного обеспечения для цифровой патологии.

Аннотация

Мультиплексированное иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание представляет собой поэтапное изменение сложности по сравнению с традиционной ПФ-визуализацией, позволяющее последовательно обнаруживать несколько маркеров антител в одном срезе ткани. Это облегчает профилирование более широкого спектра типов клеток и структур тканей, а также позволяет оценить пространственные взаимосвязи между ними таким образом, что невозможно с последовательными срезами. Не существует единого универсального маркера старения, и сейчас широко признано, что сигнатуры старения варьируются в зависимости от типа клетки, триггера старения и времени с момента индукции. Таким образом, комбинаторные подходы, предлагаемые мультиплексной IF, предоставляют мощный инструмент для беспристрастного обнаружения стареющих клеток в одном срезе ткани.

Здесь использовались тканевые микрочипы с сердечниками 34 типов человеческих тканей. Они были окрашены комбинацией структурных, иммунных и стареющих биомаркеров в 10-плексном анализе, при этом изображения получены с помощью мультиплексного слайд-сканера. Этот метод позволяет оценить численность и пространственное распределение стареющих клеток в тканях. Для создания мультиплексных наборов данных использовались последовательные циклы окрашивания, визуализации и инактивации красителя, при этом изображения получались с помощью мультиплексной системы сканирования слайдов с флуоресценцией. Описаны протоколы как ручной подготовки слайдов, так и автоматизированной обработки с помощью стеклянного окрасителя, а также сегментация отдельных клеток и пространственный анализ с использованием программного обеспечения для цифровой патологии. В целом эти методы предоставляют комплексное руководство по окрашиванию, визуализации и пространственному анализу биомаркеров, связанных с старением, в образцах тканей, а также более общее руководство по мультиплексированной визуализации.

Введение

Старение — это сложная судьба терминальных клеток, которая доказано способствует широкому спектру процессов, включая старение, рак и иммунную функцию, а также нормальный гомеостазтканей 1. Однако универсальный биомаркер старения не был описан, и идентификация основана на оценке ряда так называемыхпризнаков 2. ИФ-визуализация тканей ограничивалась оценкой одного или двух биомаркеров в одном срезе, что делает оценку комбинаций маркеров в одном образцесложной для 3. Эту проблему усугубляет возникающая картина гетерогенности стареющих клетокна уровне 4 для одной клетки и нехватка признаков старения in vivo 2, что затрудняет выбор узких панелей обнаружения в новых контекстах или с ценнымиобразцами 5,6.

Мультиплексированная ИФ-визуализация направлена на преодоление этого ограничения, облегчая последовательное обнаружение нескольких биомаркеров в одном секцииткани 3. Это возможно либо с помощью флуоресцентно маркированных олигонуклеотидных репортеров, либо с использованием первичных антител, чей флуоресцентный сигнал подавляется в результате инактивациикрасителями 7. В обоих случаях последовательная визуализация используется для формирования пространственно разрешённой панели биомаркеров, что даёт преимущества по сравнению с традиционным ИФ для последовательного окрашивания тканей. Создавая эти сложные профили в одном образце ткани, можно обнаружить большее количество стареющих фенотипов, типов клеток и структур тканей, что позволяет тщательно оценить их пространственные связии распределение 7.

Однако, хотя сложность мультиплексированных профилей IF-визуализации значительно превосходит традиционные IF, маркерные панели обычно ограничены <100 биомаркерами из-за практическихограничений 3. К ним относятся как потенциальная потеря антигенности эпитопов, интенсивности сигнала или целостности тканей с каждым следующим раундом, так и задача оптимизации больших комбинаций антител, которые обязательно не должны содержать перекрёстнойреактивности 8,9. Таким образом, определение оптимального состава каждого раунда антител является важным фактором при проектировании мультиплексных панелей. Следовательно, общий «плекс» меньше, чем тот, что достигается такими методами, как пространственная транскриптомика. Однако, учитывая, что мультиплексный IF количественно определяет белки, а не уровни транскриптов, эти два метода можно считать комплементарными и комбинированными в крупномасштабных «мульти-омических»конвейерах 10.

Здесь были изображены микрочипы человеческих тканей, содержащие сердца 34 типов тканей. Они были окрашены комбинацией структурных, иммунных и стареющих биомаркеров в 10-плексном анализе: панцитокератин (PANCK), CD31, альфа-гладкий актин (aSMA), кератин 15 (K15), виментин, FOXP3, CD8, Ki67, p16 и ламин B1. Представлены подробные пошаговые протоколы как для ручной подготовки слайдов, так и для автоматизации с помощью автоматического стеклянного окрашивателя. Репрезентативные экспериментальные сравнения показывают, что последнее улучшает как целостность тканей, так и, для большинства маркеров, флуоресцентныйсигнал 11. Наконец, предоставляется пошаговое руководство по анализу мультиплексированных тканевых микрочипов с помощью цифрового программного обеспечения HALO, включая сегментацию отдельных клеток и пространственный анализ экспрессии биомаркеров. Репрезентативные результаты демонстрируют техническую осуществимость обнаружения и количественной оценки стареющих клеток на основе панели биомаркеров (в отличие от комплексной биологической валидации классификации старения).

В целом эта методология представлена как руководство по мультиплексной оценке биомаркеров старения in vivo , а также как более общее руководство по мультиплексированной визуализации (рисунок 1).

Протокол

Этическое заявление

Образцы тканей, включённые в эту работу, были избыточны диагностическим требованиям архива Barts Health NHS, образцы были получены в соответствии со всеми соответствующими институциональными и нормативными нормами и утверждены в соответствии с этическими протоколами 10/H0704/65 и 05/QO605/140.

1. Подготовка слайдов, извлечение и блокировка антигена

Примечание: Если не указано, все этапы выполняются при комнатной температуре (~20–25 °C) в стандартных лабораторных условиях.

  1. Начальное монтажирование образца
    1. Для обеспечения оптимального удержания тканей установите образцы тканей с фиксированным парафином (FFPE) на высококачественные микроскопические стекли (положительно заряженные), подготовленные из нового пакета, чтобы обеспечить минимальные потери заряда.
    2. Убедитесь, что толщина секций не превышает 5 мкм с максимальным размером 4 x 2 см², установленных по центру, чтобы обеспечить видимость в окне обзора держателя затвора без покрытия.
    3. Подготовка образцов выполняется вручную через камеру для делоакирования или автоматически с помощью автоматического окрасителя.
  2. Камера деклоаки
    1. Запекайте до 24 слайдов за ночь при 60 °C, с тканями, направленными вверх.
    2. Девоск и регидратация образцов с помощью последовательных 5-минутных инкубаций в ксилоле (выполнение этапа дважды) и снижения концентрации этанола (100%, 100%, 90%, 70%) путём полного погружения злиний в каждый реагент.
    3. Промывайте слайды, погружаясь в PBS на 5 минут (выполните шаг дважды).
    4. Пропустите слайды, погрузив в 0,3% Triton X 100, разбавленный в PBS на 10 минут.
    5. Промывайте слайды, погружаясь в PBS на 5 минут.
    6. Подготовьте камеру для разблокировки, добавив следующие реагенты в каждый отдельный сектор:
      1. 500 мл ddH20в основную камеру.
      2. 250 мл ddH20в центральное положение резервуара на металлической корзине для стойки.
      3. 250 мл pH 6 Антигенный раствор 1 (ARS1) в левом резервуаре на металлической корзине стойки.
      4. 250 мл pH 9 Антигенный раствор для снятия маскировки 1 (ARS2) в правом резервуаре на металлической корзине (разбавленный вddH 2O из 10x приклада).
    7. Погрузите образцы в раствор ARS1 и проложите паровую полосу на все три резервуара.
    8. Накройте крышку камеры для разблокировки и поверните, чтобы зафиксировать её в закрытом положении, убедитесь, что значение сброса давления лежит ровно на стержне.
    9. Выберите и запустите протокол, который достигает заранее заданной температуры 110 °C и держится 4 минуты.
    10. Во время фазы нагрева, когда индикатор температуры показывает 70 °C, запустите таймер на 20 минут. В это время система достигает температуры, удерживает и начинает снижать давление.
    11. Полностью декомпрессируйте систему, аккуратно наклонив клапан сброса давления с помощью пинцета и открыв крышку. Проверьте полосу ручья, чтобы убедиться, что температура достигнута.
    12. Переместите образцы из раствора ARS1 в раствор ARS2. Поставьте крышку камеры обратно (но не блокируйте и не повторяйте давление) и запустите таймер на 20 минут.
    13. Снимите корзину резервуара, в которой лежали слайды на столе.
    14. Оставьте корзину на столе при комнатной температуре на 10 минут.
    15. Промывайте образцы, погружая в PBS на 5 минут (выполняйте этот шаг четыре раза).
    16. Блокируйте образцы, погружая в PBS, содержащую 10% ослиную сыворотку и 0,3% BSA, в течение 1 часа.
    17. Промывайте образцы, погружаясь в PBS на 5 минут.
    18. Контрокрашивание образцов, погружая их в DAPI (1 мкг·мл-1), разбавленный в PBS на 15 минут.
    19. Промывайте образцы, погружаясь в PBS на 5 минут.
    20. Крепите затворы в держатели для затвора без покрытия.
  3. Автоматический слайд-краилка (например, Bond RXm)
    1. Положите реагенты для мойки, ER1 и ER2 в нижний ящик.
    2. Включите систему для инициализации.
    3. Убедитесь, что контейнеры для отходов пусты, а все остальные реагенты находятся выше минимального уровня.
    4. Подготовьте рычаг реактива, заполнив позиции потенциода следующими реагентами при необходимых объёмах, указанных системой для общего количества затворов:
      1. Вставьте пустой горшок реагента, заполненный PBS, в руку реагента.
      2. Вставьте реагентный контейнер с 0,3% Triton X-100, разбавленный в PBS, в реактивную руку.
      3. Вставьте реагентную горшок с блокирующим буфером — 10% сыворотки осла с 0,3% BSA в PBS в реагентную руку.
      4. Вставить реагентный контейнер с DAPI (1 мкг·мл-1), разбавленный в PBS, в реагентную руку.
    5. Вставьте целый рычаг реактива (с подготовленными контейнерами) в систему.
    6. Следуя инструкциям на экране, создайте автоматический протокол окрашивания, включающий следующие шаги, которые будут выполняться в течение ночи:
      1. Выпекать при 60 °C в течение 10 часов.
      2. Инкубировать с 0,3% Triton X-100, разбавленной в PBS (10 минут).
      3. Стирайте с помощью реагента массовой мойки (заранее запрограммированная рутина).
      4. Инкубировать с объёмным реагентом Epitope Retrieval 1 (ER1) (20 мин, 100 °C).
      5. Стирайте с помощью реагента массовой мойки (заранее запрограммированная рутина).
      6. Инкубировать с помощью объёмного реагента Epitope Retrieval 2 (ER2) (20 мин, 100 °C).
      7. Стирайте три раза реагентом массовой мойки (заранее запрограммированная рутина).
      8. Инкубировать с блокирующим буфером — 10% сывороткой «осёл» и 0,3% BSA в PBS (1 час).
      9. DAPI (1 мкг·мл-1 в PBS) четыре раза по 5 минут каждый раз.
      10. Wash (заранее запрограммированная рутина).
    7. Убедитесь, что все объемы добавления установлены на 150 мкл, а этап подготовки настроен на удаление воска через выпадающее меню.
    8. Добавьте детали до 30 слайдов и распечатайте этикетки штрихкодов.
    9. Снимите лоток и вставьте затворы лицом вверх. Добавьте плитки для укрытия поверх каждого слайда, лицом вверх. Разместите этикетки штрихкодов так, чтобы они читали сверху донизу на слайде.
    10. Поставьте лоток для затвора обратно в автостейнер и заблокируйте с помощью кнопки переднего лотка.
    11. Нажмите кнопку старта для каждого рычага затвора, который сейчас загружен затворами.
      Примечание: полный протокол занимает ~15 часов (включая 10 часов запекания). Время начала можно отложить, чтобы сэкономить регидратационные мытья.
    12. После завершения цикла закрепите затворы в держатели для затвора без покрытия.
  4. Загрузка держателя затвора без крышки
    1. Поместите слайды в держатель затвора без крышки, убедившись, что верхний и правый края соприкасаются с металлическими стопорами.
    2. Зафиксируйте затвор пластиковыми кулачками (используя оба одновременно), повернувшись в закрытое положение навесного замка.
    3. Проверьте, чтобы затвор стоял полностью ровно и не раскачивался внутри держателя.
    4. Разместите камеру вставки Coverslipless Slide Holder поверх затвора, зажав боковые планки обеими руками, чтобы ограничить давление и предотвратить поломки.
    5. Загрузите держатель затвора без крышки через входной порт монтажным материалом объемом 2 мл, состоящим 50% глицерила в PBS.
    6. Добавьте штрих-код на сам затвор слева от затвора в любом направлении.
    7. Переходите к визуализации.

2. Мультиплексная визуализация

  1. Выбор регионов и автофлуоресцентная визуализация
    1. Откройте мультиплексное программное обеспечение для получения изображений (например, Mx workflow (4.2.0.4)) и создайте протокол с необходимыми патронами/биомаркерами и временем экспозиции с помощью мастера издателя протокола.
      Примечание: заранее определите назначение каждого антитела доступным каналам. Ограничьте слабые маркеры (то есть те, что требуют большего времени экспозиции) каналами Cy5 и Cy7 с наименьшей автофлуоресценцией. В мультиплексной флуоресцентной визуализации может использоваться максимум 4 антитела за раунд.
    2. Если требуются виртуальные изображения H&E, убедитесь, что канал Cy3 получен.
    3. Добавьте слайды в протокол (используя номер штрихкода) с помощью инструмента создания пакетов, чтобы создать рабочий процесс мультиплексного эксперимента.
    4. Загрузите слайд в микроскоп через программное обеспечение для получения (4.2.0.4) и следите за рабочим процессом, рисуя интересующие области с помощью 2x и 10x шагов визуализации для каждого слайда. При выборе регионов убедитесь, что у каждого поля зрения есть как минимум два соседа, чтобы избежать проблем с сшиванием.
    5. Минимизируйте количество пустого стекла, чтобы избежать проблем с сшивкой, и сократите время выполнения, не выбирая пустые поля.
    6. Выполните 20-кратную автофлуоресцентную визуализацию, используя время экспозиции, установленные в шаге 2.1.1, и следуйте мастеру контроля качества (QC). Визуально подтвердите, что нет размытых областей или артефактов. Если они выявлены, то провалите контроль качества и переобраз.
      Примечание: Не существует единого показателя допустимой строгости контроля качества, и успех зависит от необходимых экспериментальных показаний и ценности образца. В фокусе ткань с достаточной интенсивностью окрашивания должна выглядеть четко и прозрачно визуально. Часто наблюдаются небольшие участки отслоения/деградации тканей, которые не улучшаются при дополнительной визуализации и могут быть переносимы, если остальная часть образца хорошо сфотографирована. Если наблюдаются крупные яркие артефакты (например, пыль), то лучше всего их удалить, очистив стекло и повторив изображение.
    7. Генерируйте фоновые изображения, которые будут вычитаться из конечного сигнала биомаркера, в процессе, который повторяется для каждого мультиплексного раунда.
      Примечание: Все раунды мультиплекса будут автоматически выравниваться через программное обеспечение для приобретения.
  2. Использование роботизированного обработчика пластин
    1. Убедитесь, что программное обеспечение для приобретения закрыто.
    2. Откройте программное обеспечение интеграции Robotic и нажмите старт.
    3. Поместите стоп-держатель затвора Coverslipless в входную стопку.
    4. Убедитесь, что выходной стек пуст.
    5. Откройте программное обеспечение Robotic Plate Handler Control (например, Harmony robotics software (3.2.0)) и следуйте мастеру, убедившись, что выбран правильный тип и номер пластины.
    6. Нажмите старт, и обработчик пластины загрузит микроскоп, который автоматически определит правильный этап работы благодаря штрихкоду затвора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете роботизированный загрузчик для приведённых ниже этапов изображения биомаркеров, важно снять опцию «динамически задавать время экспозиции» в программном обеспечении и использовать заранее установленные времена экспозиции.
  3. Последовательное окрашивание биомаркеров, инактивация красителя и мультиплексная визуализация
    1. Центрифуга антитела в концентрации 13 000 г в течение 1 минуты при комнатной температуре для ограничения количества артефактов.
    2. Приготовьте раствор антител в PBS, содержащий 0,3% BSA.
      Примечание: конечные концентрации антител будут варьироваться, но разбавление 1:200 — хорошая отправная точка для оптимизации нового антитела.
    3. Удалите монтажный материал, вытягивая пипетом из порта держателя затвора без покрытия, и промывайте, добавив 2 мл PBS с 0,01% Tween в течение 5 минут (повторите этот шаг три раза).
    4. Удалите PBS и проведите окрашивание антител, пипетируя в порт раствор антител 350 мкл, разбавленный в PBS. Этот объём оптимизирован для обеспечения полного покрытия образца внутри камеры окрашивания.
    5. Инкубировать 1 час при комнатной температуре на столе.
    6. Удалите раствор антител, вытягивая пипетом из порта держателя Coverslipless Slide Holder, и промывайте, добавив 2 мл PBS с 0,01% Tween в течение 5 минут (повторите этот шаг три раза).
    7. Удалите PBS и добавьте монтажный материал на 2 мл.
    8. Вставьте держатель затвора без крышки в микроскоп, чтобы инициировать автоматический этап индивидуального изображения по кругу.
    9. После завершения процесса выполняйте процесс, выполняя шаги контроля качества, указанные на экране.
    10. Удалите монтажный материал, вытягивая пипетом из порта держателя затвора без покрытия, и промывайте, добавив 2 мл PBS с 0,01% Tween в течение 5 минут (повторите этот шаг три раза).
    11. Свежеприготовьте раствор для инактивации красителя, содержащий 7 млddH 2O, 2 мл 0,5MNaHCO 3 и 1 мл 30% H2O2. Приготовьте этот раствор непосредственно перед использованием и немедленно наносите на слайды.
      Внимание: перекись водорода следует обрабатывать с помощью соответствующих лабораторных средств индивидуальной защиты.
    12. Удалите PBS и добавьте 2 мл инактивации красителя на каждый стекло сразу после добавленияH 2O2 в рабочий раствор.
    13. Инкубировать 15 минут на столе в держателе для затвора.
    14. Удалите раствор для инактивации красителя, вытащив пипетом из порта держателя затвора без покрытия, и промывайте 5 минут в 2 мл PBS с 0,01% Tween.
    15. Удалите PBS и добавьте монтажный материал на 2 мл.
    16. Вставьте держатель затвора без покрытия в микроскоп для запуска автоматической специализированной 20-кратной автофлуоресцентной визуализации.
    17. После завершения процесса выполняйте процесс, выполняя шаги контроля качества, указанные на экране.
    18. Повторяйте шаги с 2.3.1 по 2.3.17, чтобы получить столько патронов/маркеров, сколько нужно. (Процедура была подтверждена производителем до 10 раундов, хотя основным фактором ограничения будет целостность тканей).

3. Автоматизированный анализ HighPlex: с помощью цифрового программного обеспечения по патологии

  1. Загрузка данных и сегментирование TMA
    1. Перетаскивайте мультиплексированные IF-изображения во вкладку «исследования» в программном обеспечении Digital Pathology.
      1. Виртуальные изображения H&E должны импортироваться отдельно.
    2. Для образцов тканевого микрочипа (TMA) используйте модуль «TMA». Это позволяет маркировать по основным параметрам, делая отслеживание данных гораздо более простым, чем обработка слайда в целом.
    3. Чтобы создать блок TMA, сначала перейдите к действиям блокировки и создайте новую карту TMA.
      1. Это можно ввести вручную или с помощью таблицы Excel через мастер импорта.
    4. Сегментируйте TMA, кликнув правой кнопкой мыши по образцу во вкладке исследований и выбрав «Сегмент TMA».
    5. Выберите размер ядер и выровняйте их по карте, перемещая красные блоки. Нажмите сохранить после завершения.
    6. Анализ и экспорт данных теперь могут выполняться по ядрам.
      Примечание: Следующий конвейер также может запускаться на полных срезах ткани без использования модуля ТМА.
  2. Сегментация одной цели
    1. Перейдите на вкладку анализа.
    2. В выпадающем меню «настройки действий» нажмите загрузку и выберите модуль анализа флуоресценции HighPlex.
      1. Для этих результатов использовалась версия v5.2.2.
      2. При выборе красителя заполните маркеры в разделе оценки вручную или через функцию «автозаполнение красителей».
      3. В ядерном обнаружении выберите тип сегментации, соответствующий версии HALO (здесь описывается традиционная, не связанная с ИИ версия).
      4. Установите порог ядерного контраста для захвата ядер (обычно в диапазоне 0,4–0,6).
        1. Установите минимальную ядерную интенсивность для захвата ядер (обычно не ниже 0,05).
        2. Уменьшите максимальную яркость изображения примерно до 0,4 в зависимости от интенсивности сигнала DAPI (уменьшено с 1 из-за динамического диапазона 16-битных изображений).
        3. Корректируйте дополнительные параметры, такие как агрессивность сегментации, отверстия для заполнения и размерные фильтры, в зависимости от типа ткани.
      5. Повторите этот процесс для обнаружения мембран и цитоплазмы.
        1. Для традиционного обнаружения цитоплазмы радиус воротника от 2 до 5 часто является хорошей отправной точкой.
  3. Положительный порог выбора биомаркеров
    1. Каждый биомаркер, выбранный на этапе отбора красителя, будет измеряться по исходным значениям интенсивности.
    2. Установите либо бинарную (положительную против отрицательную), либо несколько (высокие, средние, низкие, отрицательные) пороги для каждого маркера, корректируйте значения с помощью слайдеров в ядерном, цитоплазматическом или мембранном отсеке в зависимости от паттерна окрашивания.
      1. Чтобы установить двоичный порог, настройте только нижний ползунок для определения срега значения.
      2. Оценивайте производительность с помощью окна настройки в реальном времени в меню «Анализ» и включая/выключая маску анализа, чтобы сравнить с уровнем чистого окрашивания.
    3. Создайте комбинации маркеров, используя функцию «фенотипы».
      1. Логическое гейтинг включает И/ИЛИ положительно/отрицательное для всех маркеров, что позволяет построить неограниченную матрицу для всех окрасок.
    4. Установите данные о сохранении объектов в true, если требуется одна цель (требуется для пространственного анализа).
    5. Сохраните протокол и во вкладке «исследования» выделите все слайды для анализа, правой кнопки мыши и анализа с нужным протоколом.

4. Обзор результатов

  1. Пространственная оценка в программном обеспечении для цифровой патологии
    1. Просмотрите все результаты во вкладке «результаты» цифрового программного обеспечения для патологии.
    2. Сводная таблица вверху будет показана средними значениями всех признаков на текущем изображении.
      1. Это будет касаться одного ядра, если открыть отдельно.
    3. Нижняя таблица отображает данные по одной целевой цели для каждой особенности.
      1. Анализируйте отдельные точки данных, выбирая из таблицы или кликая по изображению.
    4. Фильтруйте фенотипы, пороги позитивности маркеров или интенсивности в соответствующих столбцах. Затем их можно отнести, перейдя в: «действие объекта» > «плот» > «пространственный график».
    5. После того как это проведено для нескольких различных групп, можно провести пространственный анализ.
    6. Выбор кнопки «пространственный анализ» и выбор опций по мере необходимости:
      1. Ближайший сосед: определит расстояние до ближайшего наблюдения заданного типа ячейки от другой.
      2. Анализ близости: измеряет в диапазонах вокруг выбранного типа ячеек и количественно определяет как количество, так и расстояние любого другого типа клеток.
      3. Анализ инфильтрации: Измеряет в полосах расстояние до заданного слоя аннотации (отмеченное на изображении через инструмент аннотаций), при котором найден определённый тип ячейки.
      4. Heatmap плотности: Создаёт визуализацию распределения типа ячейки по всему изображению.
    7. Пространственный анализ можно запускать на всех ядрах TMA через кнопку «spots result» в режиме слайдов и выпадающее меню «действия результатов».
  2. Результаты экспорта из Программное обеспечение для цифровой патологии
    1. Результаты можно экспортировать из вкладки TMA, перейдя в раздел «действия слайда» > «экспорт».
    2. Можно экспортировать только сводные данные или полный анализ отдельных целей через расширенную вкладку.
    3. Генерировать данные в виде .csv файлов, которые затем можно анализировать в программном обеспечении, таком как R, для анализа интенсивности биомаркеров на уровне популяции во всех клетках. К характеристикам отдельных объектов относятся: идентификатор образца, уникальный идентификатор объекта (на ячейку), значения интенсивности для каждого маркера, классификации фенотипов и пространственные координаты.

Результаты

10-плексный IF и парный виртуальный H& Изображения E были получены для 136 сердечных микрочипов тканей, охватывающих 34 типа человеческих тканей, на двух слайдах, подготовленных с использованием различных методологий (см. рисунок 2). Эти репрезентативные изображения демонстрируют успешное мультиплексное окрашивание с сохраненной морфологией тканей и чёткое обнаружение множества биомаркеров в ядрах тканевых микрочипов. Один слайд использовал автоматический стеклянный стекловик, а другой — ручной процесс подготовки слайдов. Более частое количество тканевых артефактов наблюдалось при мануальном методе деблокирования камеры, включая отслоение тканей, а также потеря или смещение ядер (рисунок 3). Эти артефакты уменьшают анализируемую область ткани на образец или ядро, тем самым влияя на анализ мультиплексных изображений в дальнейшем процессе. Эти наблюдения подтверждают, что протокол обеспечивает надёжное мультиплексное окрашивание и визуализацию различных типов тканей.

Успешная мультиплексная визуализация характеризуется сохраненной морфологией тканей, согласованным выравниванием по кругам окрашивания и чётким, специфическим биомаркерным обнаружением сигналов. В отличие от этого, неоптимальные результаты характеризуются отслоением тканей, потерей сигнала или артефактами визуализации, которые уменьшают анализируемые области и затрудняют дальнейший анализ.

Далее был сравнин профиль окрашивания маркеров, включая PANCK (эпителиальная ткань), CD31 (эндотелиальная ткань), aSMA (стромальная ткань), кератин 15 (K15; базальный эпителий), виментин (мезенхимальные клетки), Ki67 (маркер пролиферации), CD8 (цитотоксические Т-клетки) и FOXP3 (TREGs), при этом в обеих методах подготовки стекла наблюдалось небольшое снижение сигнала качественно (визуально) при ручном методе (см. рисунок 4A).). Используя пороги классификации биомаркеров в программном обеспечении цифровой патологии, образцы были стратифицированы на положительные и отрицательные популяции для каждой из ~630K клеток в наборе данных (рисунок 4B). Количественная оценка сигнала маркеров проводилась с использованием измерений интенсивности, полученных в результате цифрового патологического анализа. Оценки плотности популяции (где площадь под кривой составляет 100% населения) и медианные значения интенсивности показали умеренное увеличение 5/8 биомаркеров в положительных популяциях при использовании автоматического слайд-красителя по сравнению с ручным процессом (см. рисунок 4C).

Завершая панель, описанные выше маркеры были связаны с дополнительными биомаркерами для ламин B1 (ядерная мембрана) и p16 (ингибитор киназы-зависимого циклина), что позволило визуализировать относительное количество тканей и распределение всех 10 маркеров по одному образцу (см. рисунок 5). Возможность профилировать большое количество биомаркеров особенно полезна в области старения, которая опирается на оценку множества ортогональных маркеров для обеспечения достовернойклассификации 2. Здесь нам удалось пропрофилировать изменения интенсивности ламина B1 внутри популяций p16 с высоким и низким уровнем. Важно, что поскольку это был мультиплексный образец, эти клетки могли быть размещены в пространственном контексте, сравнивая с распределением других типов клеток внутри одной ткани (рисунок 6A). С помощью порога классификации Digital Pathology Software это окрашивание было количественно измерено, чтобы показать, что положительные клетки p16 ассоциируются с более низкими уровнями ламина B1, чем их отрицательные аналоги (рисунок 6B), что соответствует ранее описанным паттернам маркеров, связанных с старением12. Мы также наблюдали, что отрицательные клетки ламина B1 имели более высокие уровни p16 (рисунок 6C). Используя функцию фенотипов в программном обеспечении Digital Pathology (которое классифицирует клетки по сегментации одной клетки и пороговому определению множества маркеров), комбинация этих маркеров затем использовалась для определения популяции клеток как стареющих, то есть тех, что являются p16-положительными и ламин-B1-отрицательными. Затем пропорция этих клеток во всех ядрах по типу тканей была количественно измерена, а также каждый из 10 маркеров по отдельности (рисунок 6D). Этот результат позволяет количественно сравнивать популяции клеток, определённых биомаркерами, между несколькими типами тканей в мультиплексном наборе данных. Хотя аналитический конвейер работает на уровне одной ячейки, текущий набор данных в основном представлен с использованием распределений на уровне популяции. Относительно низкое содержание p16-положительных клеток в этом наборе данных может ограничить статистическую мощь для надёжного анализа корреляции по клеткам между p16 и ламином B1, поэтому такие связи следует интерпретировать с осторожностью.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема, показывающая полный рабочий процесс мультиплексной иммунофлуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Обзор мультиплексной визуализации: (A-B): Виртуальный H& Изображения E, полученные с помощью окрашивания DAPI и автофлуоресценции Cy3 первого раунда, чтобы визуализировать целостность тканей препаратов, подготовленных с помощью автоматического стеклянного окрашивателя или ручной подготовки стекла. (C-D): Мультиплексное IF окрашивание всех биомаркеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Примеры типов артефактов: Репрезентативные примеры различных типов артефактов, которые могут быть созданы преимущественно при подготовке слайдов. Частичное отслоение ткани может наблюдаться как выровненные области и вызывать проблемы с выравниванием тканей в последующих циклах. Отсутствие ядер снижает экспериментальную мощность и часто происходит непропорционально в нежных типах тканей. Сдвиг или перекрывающиеся сердечники происходят, когда ядро отсоединяется от своего положения на TMA, но цепляется за другую область, что усугубляет потерю образца, затрудняя анализ скрытого керна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Сравнение флуоресцентного сигнала автостейнера BOND и ручного приготовления стекла: (A): Репрезентативное IF окрашивание для структурных маркеров панцитокератина (PANCK), CD31 и альфа-гладкомышечного актина (aSMA). Слияние этих трёх изображений показано в первом столбце. (B): Маски для анализа бинарной классификации Digital Pathology Software, показывающие положительное обнаружение маркеров по разным типам клеток: CD31 (красный), FOXP3 (бирюзовый), Ki67 (жёлтый), CD8 (белый), PANCK (зелёный). Белое поле указывает область цифрового масштабирования в нижних панелях. (C): Количественная оценка интенсивности биомаркеров в популяциях клеток, сгруппированных по методу подготовки ткани (автоматический стеклянный окрашиватель = красный, мануал = синий) и положительной эффективности маркеров (тёмный = отрицательный, светлый = положительный). Площадь под каждым плотным графиком составляет 100% анализируемой популяции клеток. AF = автофлуоресценция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Полная мультиплексная панель: Репрезентативные изображения из ткани аппендикса, показывающие A-B: полная 10-плексная IF-панель C: PANCK (зелёный), D: CD31 (красный), E:aSMA (жёлтый), F: K15 (розовый), G: Виментин (белый), H: Lamin B1 (бирюза), I:p16 (золотой), J: Ki67 (ярко-жёлтый), K: CD8 (ярко-зелёный) и L: FOXP3 (фиолетовый). White box = цифровой зум (Merge, CD31, aSMA, K15, Vim, LB1, p16), пунктирный блок = цифровой зум (Ki67, CD8, FOXP3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Обнаружение маркеров старения: (A): Репрезентативный IF с изображений тканей поджелудочной железы, показывающий контрастные узоры окрашиваний ламина B1 (бирюза) и p16 (золотой), а также пространственную связь с другими маркерами PANCK (зелёный), CD31 (красный) и виментин (белый). (B): Количественная оценка интенсивности ядра ламина B1 (LB1) в положительных и отрицательных популяциях клеток p16. (C): Количественная оценка интенсивности клеток p16 в положительных и отрицательных популяциях клеток с ламином B1 (LB1). Площадь плотного участка под кривой составляет 100% населения. (D): Нормализованная тепловая карта по Z-баллу среднего процента положительности ядра для каждого биомаркера или фенотипа старения (p16+/LB1-ve) по типам тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Мультиплексированная ИФ-визуализация с помощью автоматизированных платформ способствует формированию тонких профилей большой панели биомаркеров в отдельных секцияхткани 13. В сочетании с программным обеспечением для цифровой патологии, таким как HALO, это позволяет анализировать как численность, так и пространственные взаимоотношения типов клеток друг с другом, а также их распределение по различным структурамтканей 3. Это может принести значительную ценность области старения, которая основана на профилировании комбинаций отличительных признаков для надёжной классификации стареющих клеток, которые, в свою очередь, обладают значительной гетерогенностью и, следовательно, требуют профилирования отдельных целевых клеток, что невозможно для последовательных сеченийткани 14. Кроме того, нагрузка стареющих клеток варьируется в разных тканях, может накапливаться с разной скоростью в процессе старения, и существует установленный дефицит надёжных in vivo маркеров старения, что делает возможность использовать более широкий набор биомаркеров желательной в новых контекстах, где требуется большаягибкость 5,15,16. Важно, что предыдущие исследования показали, что накопление и временная динамика стареющих клеток сильно зависят от тканей, с существенными вариациями как в численности, так и в начале между органными системами, что подчёркивает, что старение не происходит синхронно между тканями. Альтернативные методы пространственного профилирования, такие как пространственная транскриптомика или массовая цитометрия визуализации, могут предоставлять дополнительную молекулярную информацию; Однако мультиплексная иммунофлуоресценция напрямую измеряет экспрессию белков и позволяет высокоразрешающий пространственный анализ фенотипов клеток в целостных срезах ткани. Последовательный характер мультиплексного IF также способствует итеративному конвейеру обнаружения.

Мультиплексная IF-визуализация может выполняться в высокопроизводительных рабочих процессах путем интеграции с автоматическим слайд-окрашивателем. Помимо значительных преимуществ в плане стандартизации, автоматизированная подготовка стекла, по-видимому, приводит к меньшему числу артефактов, чем использование ручного метода с камерой для снятия камеры, поскольку наблюдалось меньшее отслоение тканей и потеря сердечников. Однако эти наблюдения основаны на качественном сравнении, и для официального установления различий в повреждениях тканей, вызванных процессом, потребуется дальнейшая количественная оценка. Это особенно важно для жировых тканей, таких как кожа и грудь. Кроме того, система Coverslipless Slide Holder позволяет интегрировать работу с роботизированными обрабатывающими пластинами, что обеспечивает большую пропускную способность и сокращает время работы оператора, способствуя улучшению рабочих процессов, таким как ночные запуски изображения. Хотя ожидается, что автоматизация улучшит пропускную способность и стандартизацию, количественное сравнение этих улучшений в данном исследовании формально не оценивалось и должно интерпретироваться как практическое наблюдение, а не как измеренный результат. С образцами, подготовленными в виде тканевых микрочипов, становится возможно сгенерировать такие комплексные анализы для сотен образцов пациентов на относительно небольшом числе слайдов, что может способствовать будущим исследованиям стареющих клеток в клинических образцахтканей 5,11.

Хотя наблюдалось небольшое увеличение интенсивности маркеров с использованием автоматического стеклянного красителя по сравнению с ручной подготовкой стекла, на практике это преимущество незначительно, так как низкий сигнал обычно можно преодолеть либо за счёт увеличения времени экспозиции, либо корректировки порогов анализа. Несколько ключевых этапов критически влияют на успех анализа, включая оптимизацию антител, проектирование мультиплексной панели и выбор параметров визуализации. Тщательная проверка совместимости антител, интенсивности сигнала и устойчивости к повторяющимся циклам окрашивания необходима для обеспечения воспроизводимых и качественных мультиплексных данных. Гораздо важнее оптимизация раундов и выбор каналов биомаркеров. Они оцениваются на тестовых образцах индивидуально и в комбинации, чтобы убедиться в отсутствии перекрёстной реакции между антителами, а также для демонстрации возможности инактивации красителя и обнаружения эпитопов в нужных раундах. Рекомендуется использовать слабые или менее распространённые маркеры в каналах Cy5 и Cy7, которые обычно демонстрируют более низкую автофлуоресценцию. Финальная панель тестируется в рассматриваемом типе ткани, поскольку некоторые широко используемые оптимизационные ткани (например, миндалины) часто требуют более низких концентраций и времени экспозиции, чем экспериментальные условия, которые также могут отличаться по свойствам, например, автофлуоресценции. Однако такие положительные контрольные ткани могут быть полезны, когда наличие типа клеток в экспериментальных тканях неясно, поскольку отсутствие сигнала невозможно легко отличить от отсутствия целевых клеток. Тщательность в оптимизации панелей внутри целевого типа ткани является самым важным экспериментальным шагом для обеспечения успешного анализа, чтобы минимизировать потерю биомаркеров при финальных экспериментах. Большинство проблем возникает из-за перекрёстной реакции антител, недостаточного сигнала из-за низкой концентрации антител или низкого сигнала к шуму в каналах FITC/Cy3. Кроме того, сохранение антигена при повторяющихся этапах инактивации красителя зависит как от антител, так и от тканей, что дополнительно требует комплексных шагов оптимизации для обеспечения выбора подходящих панельных и круглых составов для экспериментальных образцов. Ключевым ограничением мультиплексных иммунофлуоресцентных процессов является зависимость от высококачественных антител, а также стабильность эпитопов при повторном окрашивании и циклах инактивации красителя.

В целом, мультиплексированная визуализация, в сочетании с автоматизированными платформами, представляет собой шаговое изменение сложности для оценки образцов тканей in vivo с помощью IF, что позволяет проводить комплексный пространственный анализ сложных панелей биомаркеров на уровне одной клетки. Будущие применения этого рабочего процесса включают масштабное профилирование биомаркеров, связанных с старением, в различных типах тканей, и интеграцию с новыми подходами пространственной омики для дальнейшего выявления клеточной гетерогенности в сложных тканевых средах.

Раскрытие информации

CLB выступала консультантом для Senisca, StarkAge и AKLRD. Лаборатория CLB получила финансирование от ValiRx.

Вклад автора:

RW LG и CLB разработали первоначальную концепцию. RW, FM, MGC, LG и CLB завершили концепцию, разработав и разработав эксперименты. RW, FM, MGC и LG провели все эксперименты. RW и CLB написали первоначальный черновик рукописи, при этом все авторы внесли вклад в доработку рукописи перед подачей рукописи. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Благодарности

CLB подтверждает финансирование FM и MGC от BBSRC (BB/T008709/1 и BB/W510427/1 соответственно), а также за покупку Cell DIVE у Wellcome Trust (223803/Z/21/Z).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
30% Hydrogen Peroxide (H2O2)MerckH1009
Antigen unmasking solution 1 (H3300) (ARS1)Vector Labs.H-3300Приготовьте с помощью 12,5 мл раствора для демаскировки антигена + 237,5 мл ddH2O
Antigen unmasking solution 2 (ARS2)SigmaT6066 / E5134Приготовьте 10x запас (12,9 г Trizma base, 3,7 г EDTA, 5 мл Tween 20, 995 мл ddH20). 
Bovine Serum Albumin (BSA)MerckA2153
Bulk Dewaxing SolutionLeicaAR9222
Bulk Epitope Retrieval 1 (ER1)LeicaAR9961
Bulk  Epitope Retrieval (ER2)LeicaAR9640
Bulk Wash SolutionLeicaAR9590
DAPIMerckD3571
Doubled distilled water (ddH20)N/AN/A
DMSOMerck472301
Donkey SerumMerckD9663
EDTAMerckE5134
GlycerolMerckG5516
NaHCO3MerckS5761
Phosphate Buffered Saline (PBS)MerckBP399
Propyl GallateMerckP3130
Sodium BicarbonateMerckS5761
Triton X 100MerckH5141
Trizma BaseMerckT6066
Tween20MerckP1379
Другие расходные материалы или оборудование
Decloaking chamberBioCareDC2012
Steam stripsBioCare613QC
Bond RXm Auto Slide StainerLeicaHIS2330Относится как автоматический аппарат для окрашивания слайдов 
Cell DIVELeica29429159Относится как система многомерного флуоресцентного исследования 
Click Well slide holdersLeica29463259Относится как Well Coverslipless Slide Holder 
Список антител
CD31 (Pecam-1)Cell Signalling61255Клон: 89C2
Флуоресцентный метатель: AF555
Разведение: 1 на 50
CD8aBioLegend372906Клон: C8/144B
Флуоресцентный метатель: Alexa 647
Разведение: 1 на 100
CDKN2A/p16Santa Cruzsc-56330 AF647Клон: jc8
Флуоресцентный метатель: Alexa 647
Разведение: 1 на 200
FOXP3BioLegend320114Клон: 206D
Флуоресцентный метатель: Alexa 647
Разведение: 1 на 50
Keratin 15Abcamab194065Клон: EPR1614Y
Флуоресцентный метатель: AF_488
Разведение: 1 на 200
Ki67Abcamab215226Клон: EPR3610
Флуоресцентный метатель: AF555
Разведение: 1 на 50
Lamin B1Abcamab194106Клон: EPR8985(B)
Флуоресцентный метатель: AF_488
Разведение: 1 на 100
PanCK_AE1/AE3Thermofisher53-9003-82Клон: AE1/AE3
Флуоресцентный метатель: AF_488
Разведение: 1 на 100
SMAR&D systemsIC1420SКлон: 1A4
Флуоресцентный метатель: Alexa 750
Разведение: 1 на 100
VimentinCell Signalling69227Клон: D21H3
Флуоресцентный метатель: Alexa 750
Разведение: 1 на 100

Ссылки

  1. Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a Path Forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
  2. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends Cell Biol. 28 (6), 436-453 (2018).
  3. De Souza, N., Zhao, S., Bodenmiller, B. Multiplex protein imaging in tumour biology. Nat Rev Cancer. 24 (3), 171-191 (2024).
  4. Teo, Y. V., et al. Notch signaling mediates secondary senescence. Cell Rep. 27 (3), 997-1007 (2019).
  5. Ogrodnik, M., et al. Guidelines for minimal information on cellular senescence experimentation in vivo. Cell. 187 (16), 4150-4175 (2024).
  6. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  7. Schürch, C. M., et al. Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell. 182 (5), 1341-1359.e19 (2020).
  8. Lin, J. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, e31657(2018).
  9. Tomimatsu, K., et al. Precise immunofluorescence cancelling for highly multiplexed imaging to capture specific cell states. Nat Commun. 15, 3657(2024).
  10. Kiessling, P., Kuppe, C. Spatial multi-omics: novel tools to study the complexity of cardiovascular diseases. Genome Med. 16 (1), 14(2024).
  11. Chaib, S., Tchkonia, T., Kirkland, J. L. Cellular senescence and senolytics: the path to the clinic. Nat Med. 28, 1556(2022).
  12. Freund, A., Laberge, R. M., Demaria, M., Campisi, J. Lamin B1 loss is a senescence-associated biomarker. Mol Biol Cell. 23 (11), 2066-2075 (2012).
  13. Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
  14. Wallis, R., et al. Senescence-associated morphological profiles (SAMPs): an image-based phenotypic profiling method for evaluating inter- and intra-model heterogeneity of senescence. Aging (Albany NY). 14, 1-27 (2022).
  15. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. FEBS J. 288 (1), 56-80 (2021).
  16. O’Sullivan, E. A., Wallis, R., Mossa, F., Bishop, C. L. The paradox of senescent-marker positive cancer cells: challenges and opportunities. NPJ Aging. 10 (1), 1-11 (2024).

Перепечатки и разрешения

Теги

БиологияВыпуск 233Выпуск 233Пустое значениеВыпускМультиплексная визуализацияЦиклическая иммунофлуоресценцияИтеративное иммуномаркирование и химическое обесцвечиваниеСканирование целого препаратаПространственная биологияЦифровая патологияАвтоматический окрашивательРоботизированная интеграцияCell DIVEHALOBOND RXm
Мультиплексированный иммунофлуоресцентный анализ для пространственной оценки маркеров старения in vivo
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.