Методическая статья

Выделение перицитов из корковой ткани мыши с помощью FACS для секвенирования отдельных клеток

DOI:

10.3791/69749

⸱

30 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microcirculation, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2International Center of Microvascular Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 3College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы обеспечить удовлетворение потребностей scRNA-seq кортикальных перицитов мозга мыши, мы представляем критически оптимизированный протокол FACS на основе отбора CD13⁺/CD31⁻. Наши ключевые усовершенствования значительно повышают жизнеспособность клеток и целостность РНК, обеспечивая надёжное транскриптомическое профилирование.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перициты, как ключевой компонент нейроваскулярного блока, играют важную роль в поддержании целостности гематоэнцефалического барьера и регулировании гемодинамического гомеостаза мозга посредством модуляции тонуса микрососудистой системы. Дисфункция перицитов связана с различными неврологическими расстройствами. Для изучения гетерогенности перицитов и выяснения их механизмов при нейроваскулярных заболеваниях с одноклеточным разрешением мы разработали оптимизированный и воспроизводимый протокол для выделения перицитов мозга мышей, подходящий для секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq). Этот метод основан на устоявшейся стратегии сортировки CD13+/CD31, но включает ключевые улучшения, специально адаптированные для приложений scRNA-seq. Кратко, мозг был взят из трёх взрослых мышей C57BL/6. Ткани мозга механически диссоциировались и подвергались ферментативному пищеварению для получения суспензий в виде одной клетки. После последовательного центрифугирования финальная клеточная гранула была суспендирована в растворе 20% бычьей сыворотки из альбумина (BSA), что стало ключевым шагом для минимизации стресса и агрегации, тем самым максимизируя жизнеспособность и качество РНК для секвенирования. Оптимизированный подход на основе FACS позволяет надёжно изолировать жизнеспособные перициты мозга мышей, соответствующие строгим требованиям к scRNA-seq, предоставляя мощный инструмент для анализа гетерогенности перицитов и их патологической роли в нейроваскулярных заболеваниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перициты — это важный тип клеток, расположенных вдоль микрососудов, обычно встроенных в капиллярную базальную мембрану и охватывающих эндотелиальныеклетки 1. В мозге перициты вместе с эндотелиальными клетками, астроцитами и другими типами клеток образуют нейроваскулярную единицу и являются неотъемлемой частью структуры и функции гематоэнцефалического барьера (БББ). Перициты играют важную роль в регуляции кровотока в мозге, ремоделировании сосудов и поддержании сосудистого гомеостаза. Они сохраняют целостность BBB через тесные физические взаимодействия и паракринную сигнализацию с соседнимиклетками 2; динамически регулирует трансэндотелиальный транспорт через эндоцитоз и экспрессию специфических транспортерных белков; и способствуют гемодинамической стабильности мозга через сокращающуюся и расслабляющуюактивность 3. Дисфункция перицитов, а также изменения их покрытия или плотности могут привести к дисрегуляции сосудов и неврологическим дефицитам, в конечном итоге к патологическим изменениям, связанным с различными неврологическимизаболеваниями 4. Однако врождённая гетерогенность перицитов создаёт значительные трудности для дальнейших механистических исследований.

С развитием технологии секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) всё больше исследований используют scRNA-seq для изучения клеточной гетерогенности и выявления ключевых мишеней в патогенезе и прогрессировании заболеваний. Широко используемые маркеры перицитов включают рецептор-бета-фактор роста, полученный из тромбоцитов, (PDGFR-β)5, нейрон-глиальный антиген 2 (NG2) и актин альфа-гладкой мышцы (α-SMA). Однако эти маркеры имеют относительно низкуюспецифичность 6, так как одновременно маркируют другие сосудистые клетки, такие как гладкомышечные клетки, и нейронные предшественники, такие как прогениторные клетки олигодендроцитов, что затрудняет различение перицитов от других клеток мозга. В поисках более надёжной альтернативы мы обратились к CD13 (аминопептидаза N, APN), маркеру, широко признанному своей сильной и стабильной экспрессией в цереброваскулярных перицитах в предыдущихисследованиях 7,8,9,10. В нашем исследовании мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мозговой ткани, и результаты подтвердили экспрессию CD13 у перицитов, что показало его эффективность в отличии перицитов от эндотелиальных клеток, поскольку сигнал CD13 был исключительно связан с периваскулярными клетками и отсутствовал в эндотелиальных клетках CD31⁺. (Рисунок 1A). Однако важно отметить, что экспрессия CD13 не полностью ограничивается перицитами; обнаруживаемые уровни также наблюдаются в гладкомышечных клетках артериол и венул (рисунок 1B,C).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Иммунофлуоресцентное окрашивание показывает экспрессию CD13 в сосудистых перицитах мозга и гладкомышечных клетках, при этом сигнал не обнаруживается в эндотелиальных клетках. (A) Репрезентативная иммунофлуоресцентная визуализация артериола-капиллярной переходной зоны в микрососудистом мозге. Объединённое изображение показывает перицит CD13⁺ (зелёный), покрывающий эндотелиальные клетки CD31⁺ (красные). α-SMA+ гладкомышечные клетки (циан) локализованы в артериолярной области и отсутствуют в капиллярах. (B) Сечение артериолы. Изображения демонстрируют чёткую совместную локализацию CD13⁺ перицита (зелёный) и α-SMA+ гладкомышечных клеток (циан) в окружающем гладкомышечном слое, что подтверждает экспрессию CD13 в артериолярных гладкомышечных клетках. (C) Поперечное сечение венулы. Аналогично, CD13 (зелёный) обнаруживается в гладкомышечных клетках α-SMA (наконечниках) венулярной стенки. Шкала: 20 мкм (A-C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Для получения сосудистых перицитов коры мышей, соответствующих требованиям scRNA-seq, мы провели флуоресцентно-активируемую сортировку клеток (FACS) с использованием маркировки антител CD13⁺/CD31⁻ для изоляцииперицитов 11. Изначально для исключения гемопоэтических клеток из суспензий мозговой ткани использовались маркеры CD45 и CD4112. Впоследствии перициты обогащались путём отбора клеток CD13+ , а эндотелиальные клетки дополнительно исключались с помощью гейтинга для CD31- популяций, что изолировало целевую популяциюперицитов 13.

Мы признаём, что этап CD13-положительного отбора одновременно захватывает гладкомышечные клетки, экспрессирующие CD13, как из артериол, так и из венул. Для выполнения критических требований по scRNA-seq и максимизации удержания перицитов мы стратегически выбрали эту комбинацию маркеров, чтобы приоритизировать выход перицитов на этапе сортировки. Хотя этот подход приводит к коизоляции небольшой популяции гладкомышечных клеток, он эффективно максимизирует восстановление всех потенциальных перицитов на предварительном этапе обогащения. Эта поэтапная гейтинговая стратегия значительно минимизирует начальную потерю клеток. Кроме того, для максимизации жизнеспособности и выхода перицитов мы также применили 20% BSA-раствор для последиссоциационной ресуспензии и фильтрации клеток, эффективно удаляя мусор при сохранении жизнеспособности и чистоты сортированныхклеток 14.

С помощью этого метода мы успешно отличили сосудистые перициты мозга от других типов клеток, получив препараты с высокой чистотой и высокой жизнеспособностью, соответствующие строгим требованиям к scRNA-seq. Этот метод обеспечивает прочную основу для дальнейших глубоких исследований роли перицитов в различных контекстах заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы использовали три взрослых мыши C57BL/6J (3 месяца, вес 20-25 г). Все мыши содержались в 12-часовом цикле свет/темнота с строго контролируемой температурой и влажностью, с свободным доступом к корму и воде перед экспериментами. Все экспериментальные процедуры с участием лабораторных животных были одобрены Комитетом по уходу за лабораторными животными и этике Института микроциркуляции Китайской академии медицинских наук и Пекинским союзным медицинским колледжем и проводились в строгом соответствии с соответствующими руководящими принципами по благополучию животных.

1. Подготовка реагентов

  1. Раствор глюкозы 30% (масса/объем): растворить 15 г глюкозы в 50 мл UltraPure DNase/RNase-freedH 2O. Для полного растворения сначала добавьте глюкозу в 20 мл UltraPure DNase/RNase без РНазыdH 2O и тщательно перемешайте. Затем добавьте UltraPure DNase/RNase-freedH 2O к итоговому объёму 50 мл. Фильтруйте раствор и храните при 4 °C до 6 месяцев.
  2. ДНКаза I (10 мг/мл): Растворить 50 мг ДНКазы I в 5 мл стерильногоddH 20. Бульонный раствор можно хранить при -20 °C до 2 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует строго избегать повторяющихся циклов заморозки и оттаивания, чтобы предотвратить потерю ферментативной активности. Для минимизации эффектов заморозки и оттаивания аликвот 150 мкл раствора в стерильные микроцентрифугальные трубки перед первичным замораживанием и размораживайте отдельные аликвоты по мере необходимости для экспериментов.
  3. 2% (vol/vol) сыворотки плода (FBS) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS): приготовьте 1× PBS, смешав 5 мл из 10× PBS с 45 мл UltraPure DNase/RNase-freedH 2O. Добавьте 1 мл FBS к 49 мл 1× PBS и тщательно перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте это решение свежим образом на этапе 2.1.2. Выделяйте 15 мл на образец ткани.
  4. Раствор ферментов коллагеназы и диспазы (CD): растворить 100 мг Dispase и 100 мг коллагеназы отдельно в 1 мл UltraPure DNase/RNase-freedH по 20каждая. Комбинировать растворы для получения конечного объёма 2 мл (концентрация фермента 100 мг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвот 500 мкл в стерильные микроцентрифугные трубки и хранить при -20 °C. Воронка перед использованием, чтобы избежать потери активности из-за циклов заморозки и оттаивания. Важно отметить, что порошковая форма может вызывать сильное раздражение кожи и глаз, а также дыхательные недостатки. Всегда держите его в капюшоне с химическими парами, надевая нитриловые перчатки и маску N95. В случае заражения немедленно орошайте поражённую территорию обильной водой и обратитесь за медицинской помощью.
  5. Рабочий раствор с ферментом CD: смешайте 1,5 мл раствора CD-фермента с 43,5 мл 2% (объём/об) FBS в PBS (начиная с шага 1.3) путём мягкой инверсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьтесь непосредственно перед диссоциацией тканей (шаг 2.3.4). Этот объём оптимизирован для трёх мышей; Корректируйте пропорционально по мере необходимости.
  6. Раствор Перколла с 22% (объём/объем): Объедините 11 мл Перколла, 5 мл 10× PBS и 34 мл UltraPure DNase/RNase-freedH 2O для получения раствора объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтруйте-стерилизуйте через мембрану PES диаметром 0,22 мкм. Его можно хранить при 4 °C в течение одного месяца без значительной потери стабильности.
  7. Буфер механической диссоциации: Добавьте 1 мл ДНКазы I (10 мг/мл) до 10 мл 2% (вол/об) ФБС в ПБС (начиная с шага 1.3). Смешивайте с помощью пипетки.
  8. Решения BSA: Подготовьте решения BSA с 1%, 20% и 35% (масса/объём) отдельно следующим образом:
    1. 1% (масса/объем) BSA: растворить 0,15 г BSA в 15 мл солевого раствора Dulbecco с фосфатным буфером (DPBS).
    2. 20% (масса/объем) BSA: растворить 3 г BSA в 15 мл DPBS.
    3. 35% (масса/объем) BSA: растворить 0,7 г BSA в 2 мл DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием фильтруйте все растворы через мембрану PES диаметром 0,22 мкм.
  9. Сбалансированный сольный раствор Хэнкса (HBSS)/BSA/Буфер глюкозы: добавьте 167 мкл 30% (масса/об) глюкозы (с шага 1.1) и 1.4 мл 35% (масса/объём) BSA (с шага 1.8) до 50 мл HBSS, аккуратно перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте этот раствор свежим в стерильных условиях на этапе 2.1.2. Храните при 4 °C до использования.
  10. Буфер для сбора тканей: Дополнение 12 мл буфера HBSS/BSA/глюкозы (начиная с шага 1.9) с 800 мкл ДНКазы I (10 мг/мл). Используйте для временного хранения тканей и ополаскивания пипеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте этот раствор свежим в стерильных условиях на этапе 2.1.2.
  11. Раствор триброметанола 1,25% (w/v): растворить 1,25 г 2,2,2-триброметанола в 2,5 мл 2-метил-2-бутанола, затем добавить эту смесь в 97,5 мл стерильногоddH 2O или физиологического физиологического раствора для получения прозрачного раствора трибромеэтанола 1,25%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым использованием готовьте раствор свежим. Храните его защищённым от света при комнатной температуре и используйте быстро.

2. Экспериментальная процедура (с использованием трёх мышей в качестве примера)

  1. Подготовка к эксперименту (Время: 30 мин)
    1. Автоклав требовал расходных материалов и дезинфицировал хирургические инструменты этанолом 75%.
    2. Подготовьте рабочие растворы: 1× PBS (от Step 1.3), 2% (vol/vol) FBS в PBS (с Step 1.3), HBSS/BSA/раствор глюкозы (с Step 1.9) и буфер для сбора тканей (от Step 1.10).
    3. Налейте 10 мл 1× PBS в 10-сантиметровую клеточную чашу и держите на льду.
    4. Подготовьте три ампулы, добавьте 3 мл буфера для сбора тканей в каждую и храните их на льду.
    5. Подготовьте три центрифугных трубки по 15 мл, добавьте 10 мл 2% (объём/объём) FBS в PBS в каждую и храните их на льду.
  2. Сбор мозга мыши (Тайминг: 30 мин)
    1. Мыши подвергались глубокой анестезии с помощью внутрибрюшинной инъекции трибромеэтанола (начиная с шага 1.11) при дозе 0,2 мл на 10 г массы тела. После потери педальных рефлексов эвтаназия проводилась путем вывиха шейного отдела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь не достигла хирургического уровня анестезии (оцениваемой по отсутствию педального отменного рефлекса) в течение 5-10 минут после инъекции, вводилась дополнительная внутрибрюшинная доза триброметанола, равная одной трети начальной дозы.
    2. Опрыскивайте область головы и шеи 75% этанола. Сделайте разрез на коже головы по средней линии от затылочной до лобной области, чтобы обнажить череп. Выполните поперечный разрез перед двусторонними орбитами, затем боковые разрезы вдоль нижних краёв мозжечка для отделения основания черепа. Наконец, разрез кальвариума продольно вдоль сагиттального шва от задней части к передней части. Поднимите черепный лоскут, чтобы обнажить мозг, окружённый твердой мозгом. Аккуратно поднимите мозг, перерезая зрительные нервы и связь продолговатого мозга с помощью хирургическихножниц 15. Поместите целый мозг в 10-сантиметровую тарелку с 10 мл ледяной жидкости 1× PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с тканями аккуратно, чтобы избежать повреждений.
    3. Перенесите мозг на алюминиевую фольгу. С помощью щипцов поднимите твердую мозговую опухлину с краёв и вырежьте её вдоль средней линии сульс. После полного удаления твердой мозговой орудости обнажают субарахноидальное пространство. Прополосните субарахноидальное пространство раствором HBSS, затем расчлените сосуды тупой иглой и аккуратно удалите Pia mater16. Разрежьте мозг коронально на срезы толщиной 2-3 мм с помощью лезвия бритвы. Отбросьте обонятельную луковицу и самые хвостовые участки. Изолировать кору мозга вдоль мозолистого тела и перенести кортикальную ткань в ампулы, содержащие 3 мл ледяного буфера для сборатканей 11.
    4. Изоляция перицитов в этом протоколе нацелена на кору головного мозга. Для других интересующих областей: Разместите корональные срезы в слайде с двумя колодцями с одним падением 2% (объём/объем) FBS в PBS. Определить целевые области с помощью диссекционной микроскопии, изолировать их вручную и выполнить идентичные последующие этапы обработки.
  3. Диссоциация тканей (Время: 3-3,5 часа)
    1. Ткани в ампулах с помощью хирургических скальпелей измельчают в фрагменты примерно 1 мм × 1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Завершите фарш в течение 5 минут для сохранения свежести тканей.
    2. Наконечники пипеток перед промывкой с буфером для сбора тканей. Медленно аспирируйте измельчённые фрагменты к вершине кончика, сохраняя вертикальную ориентацию (кончик вниз). Аккуратно удалять фрагменты в предварительно охлаждённые 15-мл центрифугные трубки (подготовленные на шаге 2.1.5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте всадки осколков в верхнюю часть ствола, чтобы предотвратить прилипывание к стенке пипетки.
    3. Промыть ампулы с фрагментами (из шага 2.3.1) с 2% (объём/объём) FBS в PBS и перенести промывку в центрифугные трубки. Центрифугировать при 300 г при 4 °C в течение 5 минут.
    4. Отбрасывайте супернатанты после центрифугирования. Суспензируйте гранулы в 3 мл рабочего раствора CD-фермента (начиная с шага 1.5) на каждую трубку. Размените каждую суспензию поровну в три трубки (всего 9 трубок, 1 мл/трубку), затем дополните 4 мл рабочего раствора CD-фермента (конечный объём: 5 мл/трубка).
    5. Инкубировать трубки в гибридизационной печи при температуре 37 °C в течение 100 минут при орбитальном встряхивании при 100 x g14.
    6. Приготовьте раствор для диссоциации тканей во время инкубации, добавив 1 мл раствора ДНКазы I к 10 мл 2% (объем/объём) FBS в PBS (начиная с шага 1.10).
    7. Прекратите расщепление центрифугой при 300 г при 4 °C на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените эффективность пищеварения микроскопически, используя аликвот 10-20 мкл. Идеальная конечная точка проявляется в виде сосудистых фрагментов, похожих на бусины; Удлинённые сосудистые сегменты указывают на недоварительность, тогда как преобладающие отдельные клетки — о чрезмерном переваривании.
    8. Ресуспензировать гранулы в 1 мл раствора для диссоциации тканей в каждой пробирке. Механически диссоциируй с помощью пипетирования 100 умножитьна 11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полного объёма пипетки, чтобы минимизировать образование пузырьков и сохранить жизнеспособность клетки.
    9. Объедините все суспензии (из всего 9 пищеварительных трубок, представляющих ткани мозга 3 мышей) в центрифугную трубку объемом 50 мл. Прополосните каждую трубку для пищеварения 2 мл 2% (объём/об) FBS в PBS и комбинируйте промывки. Центрифугировать при 300 г при 4 °C в течение 5 минут.
    10. После центрифугирования видны отдельные слои. Аккуратно удаляйте верхний слой (содержащий примеси и мелкий клеточный мусор), сохраняя промежуточный слой (состоящий из клеток или кластеров клеток с меньшей плотностью) и нижний слой (целые клетки и частично непереварившиеся фрагменты ткани). Добавьте 12,5 мл 20% раствора BSA и аккуратно переверните трубку, чтобы снова взвесить гранулы. Снова центрифугировать при 1000 × г при 4 °C в течение 20 минут.
    11. Соберите нижню гранулу (обогащённую целостными клетками с более высокой чистотой) и перенесите супернатант (в основном содержащий миелиновые остатки, липиды и небольшое количество клеток) в новую центрифугную трубку объемом 50 мл. Повторная подвеска с помощью мягкой инверсии и повторение центрифуги при 1000 x g при 4 °C в течение 20 минут.
    12. Суспензируйте каждую гранулу, полученную на двух этапах центрифугации (шаг 2.3.10 и шаг 2.3.11), в 2 мл FBS по 2% (объём/объём) в PBS каждый (итоговый общий объём: 4 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к стенкам трубы во время подвески, чтобы минимизировать загрязнение мусором.
    13. Объедините две переподвесные подвески с предыдущего этапа в трубку центрифугы объёмом 15 мл. Центрифуга при 300 × г, 4 °C в течение 5 минут. Убрать супернатант (буфер отходов, содержащий BSA, клеточный мусор и, возможно, следовые количества остаточных миелиновых липид). Суспензировать гранулу (окончательные очищенные и промытые, целые целевые клетки высокой чистоты) в 2 мл раствора PBS, содержащего 2% FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для переноса ячеек в чистый, подходящий буфер подвески для последующих применений.
    14. Подготовьте четыре центрифугных трубки по 15 мл, каждая из которых содержит 4 мл раствора Перколла 22%. Аккуратно нанесите 0,5 мл аликвотов ресуспензии на градиент Перколя (всего четыре аликвоты) для максимизации выхода ячеек. Центрифугу при 560 x g при 4 °C в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите центрифугу на «без тормоза», чтобы избежать нарушения градиента плотности, вызванного вихреми, обеспечивая стабилизацию миелиновых обломков в супернатанте.
    15. Аккуратно аспирируйте супернатанты. Ресуспензируйте гранулы в 1 мл буфера HBSS/BSA/глюкозы на пробирку. Подвески бассейна в новую трубку объёмом 15 мл. Промывайте трубки Percoll 2 мл буфера HBSS/BSA/глюкозы и комбинируйте промывки. Центрифуга при 300 г при 4 °C в течение 5 минут).
  4. Подготовка и анализ проточной цитометрии, сортировка и получение (время: 50 мин)
    1. Аккуратно аспирируйте супернатант. Ресуспендировать клеточную гранулу в 1 мл буфера HBSS/BSA/глюкозы.
    2. Добавьте 5 мкл блокирующего реагента Fc-рецептора (FcR) в суспензию клетки и инкубировать при 4 °C в течение 5 минут.
    3. Добавьте следующие флуоресцентно сопряжённые антитела в суспензию клетки при указанных объёмах (достаточно для ткани, полученной от 3 мышей): 5 мкл CD45-PE; 5 мкл CD41-PE; 20 мкл CD31-APC; 15 мкл CD13-FITC.
    4. Инкубировать клетки на льду в течение 20 минут в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте от света. Избегайте перемешивания.
    5. Добавьте 6 мл буфера HBSS/BSA/глюкозы для промывки клеток. Центрифугировать при 300 г при 4 °C в течение 5 минут.
    6. Аспирировать супернатант. Ресуспендировать клеточную гранулу в 1 мл буфера HBSS/BSA/глюкозы. Добавьте 200 мкл раствора 7-аминоактиномицина D (7-AAD) (для исключения мёртвых клеток) и инкубируем на льду в течение 10 минут. Затем отрегулируйте объём до 2 мл с помощью буфера HBSS/BSA/глюкозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте от света.
    7. Добавьте 1% раствор BSA в сортировочные пробирки (15 мл конических трубок), аккуратно прокрутите, чтобы промыть внутренние поверхности. Аспирировать избыточный раствор, оставляя ровно 1 мл раствора BSA 1% в каждой пробирке для получения отсортированных клеток. Храните временно на льду.
    8. Фильтруйте окрашенный элемент суспензия через сито 40 мкм непосредственно перед сортировкой.
    9. Установите начальный элемент на основе параметров прямого рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния (SSC-A), чтобы исключить яченый мусор с низким уровнем сигналов FSC-A/SSC-A.
    10. Истощение клеток гемопоэтической линии осуществлялось с помощью двойного отрицательного гейтинга CD45 и CD41, эффективно исключая загрязнение лейкоцитами, иммунными клетками и тромбоцитами.
    11. Захват предполагаемых перицитов с помощью CD13-положительного отбора из сосудистых стенок.
    12. Оценить целостность мембраны с помощью 7-AAD флуоресцентного зонда; исключить апоптотические клетки с помощью 7-AAD⁻ гейтинга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте перициты высокой чистоты CD31⁻/CD13⁺ с помощью CD31-отрицательного отбора. Соберите отсортированные перициты непосредственно в пробирки с 1% BSA (начиная с шага 2.4.7) и поместите их на лёд. Немедленно подготовьте подвески с одной ячейкой для подсчёта. Затем загружайте образцы напрямую для секвенирования без каких-либо промежуточных этапов культуры.
  5. Секвенция и анализ scRNA (Тминг: 3-4 дня)
    1. Одноклеточные суспензии сортированных перицитов были подготовлены согласно протоколу из 10x Genomics «GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex Reagent Kits User Guide» (CG000731)17,18. Подготовленная для загрузки суспензия ячейки имела жизнеспособность > 90% и была разбавлена до концентрации в рекомендуемом диапазоне 300–2000 клеток/мкл.
    2. Комбинировать одноклеточную суспензию с штрихкодированными гелевыми шариками и ферментами, затем разбить на гель-шарики в эмульсии (GEM ) посредством микрофлюидной капельнойинкапсуляции 19. Проведите in situ лизис клеток, обратную транскрипцию и связывание штрихкод-кДНК.
    3. Ломайте GEM, чтобы восстановить продукты. Амплифицировать кДНК с помощью ПЦР с помощью следующего протокола: начальная денатурация при 9 °C в течение 4 секунд; затем следует циклирование (13 циклов для <500 целевых ячеек, 12 циклов для 501-6000 целевых ячеек), включающее денатурацию при 9 °C в течение 2 секунд, отжиг при 9 °C 3 с и расширение при 7 °C в течение 6 с за цикл; и последнее удлинение при 72 °C на 1 минуту, после чего следует задержка при 4 °C. Проверьте амплифицированные продукты на размер фрагмента (200-300 bp) и выход.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продукты усиления могут храниться при 4 °C до 72 часов или при -2 °C в течение одной недели, либо их можно перерабатывать непосредственно на следующем этапе.
    4. Для квалифицированной кДНК: фрагментируйте — выполните ремонт концов, перевязывайте адаптер P7 и амплифицируйте с помощью индексных праймеров. Фрагменты с выбором размера для создания библиотек секвенирования.
    5. Библиотеки последовательностей на платформе Illumina NovaSeq после проверки качества.
    6. Данные демультиплексного секвенирования для извлечения клеточных штрих-кодов, уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) и последовательностей РНК. Align считывает референсный геном.
    7. Количественно определить количество UMI, оценить допустимое количество клеток и создать матрицу экспрессии генныхштрихкодов 20.
    8. Удалять дублеты с помощью пакета DoubletFinder (v2.0.6) в R. Прогнозировать на основе искусственной идентификации ближайших соседей для обеспечения качества данных.
    9. Проведите анализ главных компонентов (PCA) и редукцию размерности равномерного приближения и проекции многообразия (UMAP) с использованием Seurat (v5.0). Идентифицируйте клеточные кластеры и визуализируйте гены-маркеры, специфичные для перицита, чтобы подтвердить клеточную идентичность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для точной изоляции перицитов мозга клетки, диссоциированные от мозговой ткани, были окрашены с помощью PE Texas Red conjugated anti мышиных CD41/CD45, FITC-конъюгированных антимышиных CD13 и APC-конъюгированного антимышиного CD31, что создало многоступенчатую стратегию сортировки, интегрирующую поверхностные маркеры и определение жизнеспособности (см. рисунок 2). Начальная система гейтинга, основанная на параметрах прямого рассеяния (FSC-A) и бокового рассе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании описывается систематически оптимизированная и валидированная стратегия FACS, основанная на многоцветной маркировке CD13⁺/CD31⁻ для высокоэффективной изоляции сосудистых перицитов мозгамышей 24. Потоковая цитометрия и последующие анализы scRNA-seq подтвердили, что метод точно различает перициты от эндотелиальных клеток и даёт клетки, которые стабильно соответствуют всем критическим показателям контроля качества для scRNA-seq, включая жизнеспос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Пекинским фондом естественных наук (грант No 7242222), Провинциальным проектом плана науки и технологий провинции Хэбэй (грант No 203777110D) и Институтом микроциркуляции Пекинского союзного медицинского колледжа Китайской академии медицинских наук (грант No CAMS-IM-2023-02).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Fetal Bovine Serum (FBS)GibicolA5669701Разделить на порции и хранить при -20°С; может храниться при 4°С до 1 недели после разморозки
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7,4)Life Technologies70011-044Разбавить перед использованием для промывания клеток
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KGДля приготовления клеточного энергетического буфера
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA1933-25gЗащищает клетки и предотвращает адгезию
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)Gibco14190-144
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS,1×)Life Technologies14175-095Для промывания клеток и взвешивания
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977-015Для приготовления нуклеаз-свободных реакционных систем
Collagenase/DispaseSigma-Aldrich11097113001-100mgДля переработки тканей и диссоциации клеток; разделить на порции и хранить при -20°С
DNaseI(RNase-Free)TIANGENRT411-1500UПредотвращает агрегацию ДНК; разделить на порции и хранить при -20°С
PercollSigma-AldrichP1644-100MLДля разделения клеток; хранить при 4°С
FITC Rat Anti-Mouse CD13BD Biosciences558744Флуоресцентный конъюгат; хранить защищенным от света при 4°С до 1 месяца
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262Хранить защищенным от света при 4°С в течение нескольких месяцев
PE Rat Anti-Mouse CD41BD Biosciences558040Хранить защищенным от света при 4°С в течение нескольких месяцев
PE Rat Anti-Mouse CD45BD Biosciences553081Хранить защищенным от света при 4°С в течение нескольких месяцев
FITC Rat IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences552916Флуоресцентный контроль; хранить защищенным от света при 4°С
APC Rat IgG2a, κ Isotype ControlBD Biosciences553932Хранить защищенным от света при 4°С в течение нескольких месяцев
PE Rat IgG2b, κ Isotype ControlBD Biosciences553989Хранить защищенным от света при 4°С в течение нескольких месяцев
RNase AWAY Decontamination ReagentAmbion10328011Для устранения загрязнений RNase
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141Предотвращение неспецифической связи антител
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)BD Pharmingen559925Для исключения мертвых клеток
2,2,2-ТриброметанолаSigma-AldrichT48402-25gДля приготовления 1,25% (w/v) раствора триброметанола
2-Метил-2-бутанолPsaitongM20008-500mLДля приготовления 1,25% (w/v) раствора триброметанола
Мышь C57BL/6Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.SYXK (Su) 2020-0041
50 мл центрифужная пробиркаCorning430291
15 мл центрифужная пробиркаCorning430791
Культуральная чаша на 100мм×20ммCorning430167
Cell Ranger3.1.0/4.0.0Программное обеспечение для анализа данных секвенирования одиночных клеток
Loupe Cell Browser4.1Просмотрщик клеток
STAR2.5.1bСовмещение РНК
irlbpy-Анализ главных компонент
tsne0.15Barnes-Hut t-SNE (t-Распределенное соседнее встраивание) Анализ
k-means0.17K-средних кластеризация
graph-based clustering0.17Граф-основанная кластеризация
FastQCv0.11.2Контроль качества данных (QC)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Payne, L. B., et al. The pericyte microenvironment during vascular development. Microcirculation. 26 (8), e12554(2019).
  2. Ma, Q., et al. Blood-brain barrier-associated pericytes internalize and clear aggregated amyloid-β42 by LRP1-dependent apolipoprotein E isoform-specific mechanism. Mol Neurodegener. 13 (1), 57(2018).
  3. Mäe, M. A., et al. Single-cell analysis of blood-brain barrier response to pericyte loss. Circ Res. 128 (4), e46-e62 (2021).
  4. Li, P., Fan, H. Pericyte loss in diseases. Cells. 12 (15), 1931(2023).
  5. Oliveira, F., et al. Cultured brain pericytes adopt an immature phenotype and require endothelial cells for expression of canonical markers and ECM genes. Front Cell Neurosci. 17, 1165887(2023).
  6. Yao, Y. Challenges in pericyte research:pericyte-specific and subtype-specific markers. Transl Stroke Res. 13 (6), 863-865 (2022).
  7. Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
  8. Alliot, F., et al. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. J Neurosci Res. 58 (3), 367-378 (1999).
  9. Huang, Y., et al. Isolation, culture, and characterization of primary endothelial cells and pericytes from mouse sciatic nerve. J Neurosci Methods. 416, 110366(2025).
  10. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  11. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nat Protoc. 13 (4), 738-751 (2018).
  12. Eichhorn, T., et al. Expression of tissue factor and platelet/leukocyte markers on extracellular vesicles reflect platelet-leukocyte interaction in severe COVID-19. Int J Mol Sci. 24 (23), 16886(2023).
  13. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. J Chem Neuroanat. 92, 48-60 (2018).
  14. Wu, Q., et al. Epitranscriptomic mechanisms of N6-methyladenosine methylation regulating mammalian hypertension development by determined spontaneously hypertensive rats pericytes. Epigenomics. 11 (12), 1359-1370 (2019).
  15. Mirzadeh, Z., et al. The subventricular zone en-face:wholemount staining and ependymal flow. J. Vis. Exp. (39), e1938(2010).
  16. Zappaterra, M. W., et al. Isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants. J. Vis. Exp. (73), e50333(2013).
  17. Zou, Z., et al. A single-cell transcriptomic atlas of human skin aging. Dev Cell. 56 (3), 383-397.e8 (2021).
  18. Bahl, E., et al. Using deep learning to quantify neuronal activation from single-cell and spatial transcriptomic data. Nat Commun. 15 (1), 779(2024).
  19. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  20. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8 (1), 14049(2017).
  21. Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Sci Rep. 10 (1), 12358(2020).
  22. He, L., et al. Analysis of the brain mural cell transcriptome. Sci Rep. 6, 35108(2016).
  23. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  24. Crouch, E. E., et al. Regional and stage-specific effects of prospectively purified vascular cells on the adult V-SVZ neural stem cell lineage. J Neurosci. 35 (11), 4528-4539 (2015).
  25. Ruan, J., et al. Screening and identification of muscle pericyte selective markers. Sci Rep. 15 (1), 28874(2025).
  26. Dias, D. O., et al. Pericyte-derived fibrotic scarring is conserved across diverse central nervous system lesions. Nat Commun. 12 (1), 5501(2021).
  27. Thalgott, J. H., et al. Non-invasive characterization of pericyte dysfunction in mouse brain using functional ultrasound localization microscopy. Nat Biomed Eng. , (2025).
  28. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 411-425 (2019).
  29. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FACSCD13CD31

Похожие статьи