Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Ось NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 регулирует поляризацию и воспаление макрофагов в моделях сепсиса

278 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69802

⸱

16 января 2026 г.

 ,  , 
1Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Hebei University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол интегрирует клинические образцы, культивированные макрофаги и модель мышей с лигированием и пункцией цекалий (CLP) для изучения того, как ось NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 регулирует поляризацию и воспаление макрофагов при сепсисе, предоставляя пошаговые рекомендации, которые можно адаптировать к другим иммунным путям, опосредованным lncRNA.

Аннотация

Сепсис характеризуется нарушением иммунного ответа хозяина и остаётся ведущей причиной смертности во всём мире. Длинная некодирующая РНК NEAT1 была связана с воспалительными заболеваниями, но её конкретная роль в поляризации макрофагов во время сепсиса до конца не определена. Здесь мы систематически изучаем ось NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 по клиническим образцам, культивируемым макрофагам и модели мышей CLP. Для подтверждения конкурентного взаимодействия эндогенной РНК (ceRNA) используются количественные эксперименты с использованием ПЦР, вестерн-блоттинг, двойные репортёрные анализы люциферазы и РНК-удлинение (РНК) для подтверждения конкурентного взаимодействия эндогенной РНК (ceRNA) между NEAT1, miR-181a-5p и HMGB1. Функциональные анализы, включая иммунофлуоресценцию, миграцию через трансвелл и терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу dUTP nick end labeling (TUNEL), применяются для оценки поляризации, миграции и апоптоза макрофагов. In vivo модель CLP в сочетании с ELISA и гистопатологией подтверждает влияние knockdown NEAT1 на профили цитокинов и повреждения органов. NEAT1 и HMGB1 повышаются, тогда как miR-181a-5p понижается, у пациентов с сепсисом и у макрофагов, стимулируемых липополисахаридом. Заглушание NEAT1 способствует поляризации макрофагов M2, снижает провоспалительные цитокины, затрудняет миграцию макрофагов и облегчает повреждение тканей у септических мышей по оси miR-181a-5p/HMGB1. Насколько нам известно, это первый интегрированный протокол, характеризующий регуляторную цепь lncRNA-microRNA-HMGB1 при сепсисе с использованием гармонизированных клинических, in vitro и in vivo подходов. Он предоставляет методологическую основу для таргетирования сетей цеРНК, связанных с NEAT1, как потенциальных терапевтических стратегий.

Введение

Сепсис определяется как угрожающая жизни дисфункция органов, вызванная нарушением реакции хозяина наинфекцию 1. Несмотря на достижения в клиническом лечении, смертность от него остаётся высокой, а молекулярные механизмы, лежащие в основе иммунного дисбаланса, до конца неизучены 2,3. Среди иммунных регуляторов длинные некодирующие РНК (lncRNA) стали важными модуляторами воспалительных сигналов и функциимакрофагов 4,5. NEAT1, обогащённый ядерным обильным транскриптом, является структурным компонентом параспеклов и ассоциируется с иммунными и тканевыми ответами 6,7. Предыдущие исследования связывали NEAT1 с воспалениями кишечника, ишемией/реперфузионным повреждением и острым респираторным дистресс-синдромом 8,9,10.

В контексте сепсиса накопленные данные указывают на то, что lncRNA регулируют поляризацию макрофагов и воспалительную сигнализацию, тем самым влияя на прогрессирование заболевания и исход 11,12. Например, сообщалось, что lncRNA KCNQ1OT1 и SNHG1 модулируют повреждение миокарда, вызванное сепсисом, через пути, опосредованныемикроРНК 13,14. Однако систематически не определено, регулирует ли NEAT1 поляризацию макрофагов по оси miR-181a-5p/HMGB1 при сепсисе. Для устранения этого пробела мы разработали протокол, объединяющий образцы крови пациента, макрофаги RAW264.7, стимулированные липополисахаридом, а также модель мыши с перевязкой и пункцией для изучения оси NEAT1/miR-181a-5p/HMGB115,16. Используя количественное ПЦР, вестерн-блоттинг, анализы на двойные люциферазы, РНК-вытягивание и функциональные показания поляризации, миграции и апоптоза макрофагов M1/M2, этот протокол предоставляет воспроизводимую экспериментальную основу для определения NEAT1 как регулятора функции макрофагов при сепсисе и поддержки разработки таргетированных на lncRNAстратегий 17,18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с участием людей-участников были одобрены Советом по этическому рассмотрению аффилированной больницы Университета Хэбэй (Одобрение No HDFY-LL-2021-232). Письменное информированное согласие получалось от всех участников или, при необходимости, от их юридических представителей. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и национальными нормативами и были одобрены тем же этическим комитетом. Утверждённый протокол определял детали процедуры перевязки и пункции (CLP), аденовирусного введения, схемы анестезии и гуманных конечных точек.

Сбор образцов пациентов

Пациенты с сепсисом проспективно набирались в Аффилированную больницу Хэбэйского университета с февраля 2022 по июль 2024 года. Всего 50 пациентов соответствовали критериям включения, включая 26 мужчин и 24 женщины в возрасте от 24 до 69 лет (в среднем 52,4 ± 10,2 года). Сепсис был диагностирован по критериям сепсиса-3, что требовало предполагаемой или подтверждённой инфекции плюс повышением балла по последовательной оценке отказа органов (SOFA) на ≥ 2 пункта. Для каждого пациента регистрировались первичный источник инфекции (например, инфекции лёгких, внутрибрюшной системы, мочевыводящих путей или кровотока) и тяжесть заболевания (сепсис или септический шок), а распределение баллов SOFA суммировалось для характеристики бремени заболевания. В контрольной группе было включено 39 здоровых лиц без клинических признаков инфекции или системного воспалительного заболевания (20 мужчин и 19 женщин в возрасте 26-70 лет в среднем 50,7 ± 11,0 лет), при этом существенных различий в возрасте или полу между группами не выявлено.

Периферическая венозная кровь собиралась у пациентов с сепсисом перед началом специализированного лечения, когда это было возможно. Кровь (обычно 5-10 мл) забиралась в трубки, покрытые этилеродиаминететрауксусной кислотой (ЭДТА), и несколько раз аккуратно переворачивалась для смешивания антикоагулянта. Образцы были обработаны примерно в течение 1 часа после сбора. Плазму получали центрифугированием при 1 500 × г в течение 10 минут при комнатной температуре, алицитировали в маркированные микропробирки и хранили при -80 °C для последующих измерений цитокином. Для экстракции РНК и белка периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) были выделены из части тех же образцов с использованием среды для разделения плотности и градиента согласно инструкциям производителя. Затем клетки дважды промывались в PBS, пересчитывали и хранили в виде клеточных гранул при -80 °C.

Культивирование и трансфекция клеток

Клетки макрофагов мышей RAW264.7 содержались в среде RPMI-1640 с добавлением 10% тепловой инактивированной сыворотки плода крупного рогатого скота, 100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажнённом инкубаторе при 37 °C с 5%CO2. Клетки проходили с помощью скребка, прежде чем достичь пересечения, чтобы сохранить стабильный фенотип.

Для трансфекции клетки RAW264.7 были засеяны по 5 × 105 клеток на каждую скважину в пластинах с 6 лунками в 2 мл полной среды примерно за 24 часа до воздействия реагента. Когда культуры достигали слияния 70-90%, нуклеиновые кислоты (такие как плазмиды экспрессии NEAT1 или HMGB1, конструкции с короткими шпильками, мимикаторы или ингибиторы miR-181a-5p и соответствующие им контрольные компоненты) комплексировались с липидным трансфекционным реагентом в безсывороточной среде согласно инструкции производителя. Обычно 2-3 мкг плазмидной ДНК или 50-100 пмоль малой РНК смешивались с рекомендуемым объёмом реагента, давались образовывать комплексы при комнатной температуре в течение 10-15 минут, а затем капля добавлялись в клетки в среде без антибиотиков. Через 4-6 часов среду заменяли на свежую полную среду, и клетки инкубировали ещё 24-48 часов перед следующим анализом.

Индукция поляризации макрофагов

Для индуцирования поляризации воспалительных макрофагов клетки RAW264.7 оставались в пластинах с 6 лунками не менее 4 часа в полной среде. Затем среду заменили на DMEM с содержанием 100 нг/мл липополисахарида (LPS), а клетки инкубировали 6 часов при 37 °C с 5%CO2. После стимуляции клетки немедленно обрабатывались для экстракции РНК и белка, иммунофлуоресцентного окрашивания, миграционных тестов или анализа апоптоза, в зависимости от дизайна эксперимента.

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR)

Общая РНК извлекалась из культивированных клеток, PBMC или мышиных тканей с помощью монофазного реагента на основе фенол-гуанидиния согласно стандартным процедурам. Кратко: образцы лизировали в 1 мл реагента на 106 клеток или 50–100 мг ткани, инкубировали 5 минут при комнатной температуре, а затем интенсивно смешивали с хлороформом (0,2 мл на 1 мл реагента). После инкубации в течение 2–3 минут лизаты центрифугировали при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C для разделения фаз. Водная фаза была перенесена в новую трубку, и РНК осаждалась с равным объёмом изопропанола. Затем смесь инкубировала примерно 10 минут и снова центрифугировала при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Полученная гранула была промыта 75% этанолом, центрифугирована при 7 500 × г в течение 5 минут при 4 °C, кратковременно высушена на воздухе и растворена в воде без РНаз. Концентрация и чистота РНК оценивались с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии, а для дальнейших анализов использовались образцы с соотношением A260/A 280 примерно 1,8-2,0. При необходимости целостность проверялась агарозным гелевым электрофорезом.

Комплементарная ДНК (кДНК) была синтезирована из полной РНК с помощью коммерчески доступного комплекта обратной транскрипции, следуя инструкциям производителя. Для miR-181a-5p использовались геноспецифические или петлёвые праймеры, как было рекомендовано. Количественная ПЦР в реальном времени проводилась с использованием системы ПЦР в реальном времени и подходящей мастер-смеси (например, SYBR Green- или зондовой химии) при общем объёме реакции 20 мкл, содержащем шаблон кДНК и 0,2-0,4 мкм каждого праймера. Типичные условия циклирования включали начальную денатурацию при 95 °C в течение 3 минут, затем 40 циклов при температуре 95 °C в течение 10 с и при 60 °C в течение 30 секунд, с анализом кривой расплава для подтверждения специфичности ампликона. Уровни экспрессии NEAT1 и HMGB1 были нормализованы до GAPDH, а экспрессия miR-181a-5p — до малой ядерной РНК U6. Относительная экспрессия была рассчитана с помощью метода 2-ΔΔCt и выражена как изменение сгибания по сравнению с контрольными группами. Последовательности праймеров и размеры ампликонов были собраны в отдельной таблице для подачи в виде дополнительной таблицы 1.

Вестерн блоттинг

При западном блотинге клетки дважды промывали ледяным PBS и лизировали в соответствующем буфере радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) с добавлением ингибиторов протеаз. Лизаты инкубировали на льду в течение 15–30 минут с редкими аккуратными смешиваниями и центрифугировали при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C для удаления клеточного мусора. Были собраны супернатанты, а концентрации белка определены с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA).

Равные количества белка (обычно 40 мкг на полосу) смешивались с буфером для нагрузки, варили при 95 °C в течение 5-10 минут для денатурации белков и разделяли на гелях натрия додецилсульфата (SDS)-полиакриламида соответствующей концентрации акриламида (например, 10-12% для HMGB1). Белки переносились на мембраны поливинилиденфторида (PVDF) с помощью влажной или полусухой системы переноса при условиях, рекомендованных для интересующего молекулярного диапазона. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком или бычьей сывороткой альбумином (BSA) в трисбуферном физиологическом растворе с 0,1% Tween-20 (TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами к HMGB1 (например, разбавление 1:500) и GAPDH (например, разбавление 1:1 000), разбавленных в блокирующем буфере. После трёх промыв в TBST мембраны инкубировали подходящими вторичными антителами, конъюгированными пероксидазой хрена, в течение 1 часа при комнатной температуре. После дополнительных промывок белковые полосы визуализировались с помощью улучшенного хемилюминесцентного субстрата и зафиксированы с помощью цифровой системы визуализации. Интенсивность полос количественно оценивалась с помощью программного обеспечения для анализа изображений, сигналы HMGB1 нормализовались до GAPDH, а относительная экспрессия сравнивалась между группами.

Анализ двойной люциферазы репортеров

Дикие и мутантные фрагменты NEAT1 и 3′-нетранслированной области HMGB1 (3′-UTR), содержащие предсказанные сайты связывания miR-181a-5p, были клонированы в репортерный вектор люциферазы19. Все конструкции были подтверждены секвенированием Сэнгера для подтверждения вставки и участковмутации 20. Ячейки RAW264.7 были засеяны в пластины с 24 скважинами и остались прилипать на ночь. Клетки затем котрансфицировались с репортерными плазмидами и либо ингибиторами miR-181a-5p, либо мимиками, либо соответствующими отрицательными контролями с использованием липидного трансфекционного реагента, как описано для общей процедуры трансфекции.

Примерно через 24–48 часов инкубации клетки промывали с помощью PBS, лизировали в соответствующем пассивном лизисном буфере (например, 20 мкл на одну скважину) и аккуратно перемешивали для полного лизиса. Активность люциферазы измерялась с помощью комплекта для анализа с двойным люциферазой и люминометра, следуя инструкциям производителя. Активность люциферазы светлячков была нормализована до активности люциферазы Renilla для контроля эффективности трансфекции, а относительная активность люциферазы каждой группы сравнивалась с соответствующим контрольным показателем.

Миграционный анализ Трансвелла

Миграция макрофагов оценивалась с использованием трансвелловых камер, предварительно покрытых внеклеточным матриксным гелем, подходящим для анализов вторжения клеток. Гель разбавлялся в соотношении 1:6 в безсывороточной среде на льду, а на верхнюю поверхность каждой вставки добавляли 50 мкл разбавленного раствора. Пластину инкубировали при 37 °C примерно 4 часа, чтобы гель мог затвердеть. Трансфектированные или обработанные клетки RAW264.7 были взяты, вновь суспендированы в безсывороточной среде при 1 ×10 6 клеток/мл, а 100 мкл суспензии клетки (1 ×10 5 клеток) добавляли в верхнюю камеру. Нижняя камера была заполнена 600 мкл полной среды, содержащей 10% плодовой бычий сыворотки в качестве химиоаттрактанта.

Клетки инкубировали при 37 °C с 5%СО2 в течение 24 часов. В конце инкубации немигрировавшие клетки, оставшиеся на верхней поверхности мембраны, аккуратно удалялись ватной палочкой. Мигрировавшие клетки, прилипшие к нижней поверхности мембраны, фиксировались 95% этанолом примерно 20 минут при комнатной температуре, а затем окрашивались раствором 0,5% кристаллического фиолетового в течение 10–15 минут. Лишний краситель удалялся промывкой с помощью PBS, а мембраны сушили на воздухе. Мигрировавшие клетки изучались под световым микроскопом, а клетки в нескольких случайно выбранных полях в каждой вставке подсчитывались вслепым образом для количественной оценки миграционной способности.

Анализ апоптоза TUNEL

Для обнаружения апоптоза клетки RAW264.7 культивировались на стеклянных покрытиях и подвергались указанным методам обработки или трансфекциям. Клетки фиксировались 4% параформальдегидом на 30-60 минут при комнатной температуре и промывались с помощью PBS. Эндогенная пероксидазная активность блокировалась инкубацией в перекиси водорода 0,3% в течение 20 минут, после чего следовали промывки PBS. Использовался набор для анализа TUNEL, а для покрытия клеток наносили смесь для маркировки. Образцы инкубировали при 37 °C примерно 60 минут в увлажнённой камере, и реакция была остановлена согласно инструкциям комплекта. После инкубации стрептавидином-HRP или эквивалентным реагентом для обнаружения в течение 30 минут при 37 °C ядра визуализировали с хромогенным субстратом, таким как 3,3′-диаминобензидин (DAB), пока не стали заметны коричневые апоптотические ядра. Стекли окрашивались гематоксилином, обезвоживались с помощью градированного этанола, очищались ксилолом и монтировались с помощью постоянного материала. Апоптотические клетки и полные ядра наблюдались под световым микроскопом, а апоптотический индекс рассчитывался как процент клеток, положительных к TUNEL.

Иммунофлуоресценция

Для иммунофлуоресценции срезы ткани, вложенные в парафин, были обезвощены в ксилоле и регидированы через серию градуированного этанола в воду. Забор антигена проводился с использованием соответствующего буфера (например, цитратного буфера, pH 6.0) и теплового извлечения эпитопа с помощью микроволновой или скороварки, согласно рекомендациям по антителам. После охлаждения и промывания секции блокировались 5% нормальной сывороткой в PBS на 1 час при 37 °C для снижения неспецифического связывания. Ткани затем инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против маркеров поляризации макрофагов и воспалительных цитокинов, включая CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, индуцируемую оксидную азот-синтазу (iNOS), IL-4, IL-10 и Arg-1 (обычно при разбавлении 1:500), разбавленных в блокирующем буфере.

На следующий день секции были промыты в PBS и инкубированы соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с фторофором, в течение 1 часа при 37 °C в темноте. Ядра были контрокрашены 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 5 минут. После окончательных промыв секции монтировались с помощью монтажной среды против затухания и исследовались под флуоресцентным микроскопом с использованием подходящих фильтров. Изображения получались с одинаковыми настройками экспозиции для разных групп, а на всех панелях и надписях фигуры отображались полосы масштаба (например, 20 мкм) и увеличения.

Модель мыши с сепсисом, вызванной CLP,

Самцы мышей C57BL/6 (24-32 г) акклиматизировались не менее чем за 1 неделю до операции, а затем случайным образом распределены по группам Sham, CLP, CLP плюс отрицательный контроль короткой шпильки или CLP плюс NEAT1 (n = 6 на группу). Мышей анестезировали вдыханием эфира в закрытой камере примерно 1–3 минуты, пока не пропало эфир с рефлексом выпрямления или другого одобренного анестетика при дозе и длительности воздействия, что вызывало потерю рефлекса выправления при сохранении достаточной дыхательной функции. Волосы на животе были выбриты, а кожа продезинфицирована соответствующим антисептиком. Была проведена средняя лапаротомия диаметром примерно 1-2 см, чтобы обнажить слепую кишку с прилегающей кишкой.

При CLP слепочная кость была аккуратно наружу выведена и перевязана стерильным швом примерно на две трети длины, стараясь не закрывать илеоцекальный клапан и не нарушать кровоток брыжей. Перевязанная слепая кость была дважды проколона стерильной иглой калибра, указанного в утверждённом протоколе (например, 21 G), и небольшое количество фекального материала аккуратно экструдировалось для обеспечения проходимости мест проколов. Затем слепую мышцу возвращали в брюшную полость, а брюшную стенку и кожу закрывали слоями швами. Мыши, оперируемые с помощью имитации, проходили такую же лапаротомию и контакт слепокожей груди без перевязки или проколов.

Для достижения in vivo knockdown-а NEAT1 был подготовлен аденовирусный вектор, кодирующий shNEAT1, и соответствующий отрицательный контрольный вектор при определённом титре (например, 1 × 109 единиц образования бляшек/мл). Фиксированный объём вирусной суспензии (например, 100 мкл на мышь) вводился через хвостовую вену в определённое время относительно CLP (например, через 1 час после операции), как описано в экспериментальном дизайне и одобрено этическим комитетом. После операции мыши получали стандартный послеоперационный уход, включая подкожную жидкостную реанимацию при признаках, а также проходили наблюдение на клинические признаки сепсиса и дискомфорта. В заранее определённый момент животных гуманно усыпляли путём передозировки эфира в закрытой камере с использованием примерно 5-10 мл эфира для быстрого прекращения дыхания, после чего подтверждали смерть, собирали кровь для анализа цитокином, а органы брали для гистопатологии, иммунофлуоресценции и молекулярных анализов.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием версии SPSS 23.0 или аналогичного программного пакета. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD), если не указано иное. Для сравнения между двумя группами использовался непарный t-тест Студента, когда данные обычно распределялись с однородными дисперсиями. Для сравнений между тремя и более группами применялся односторонний анализ дисперсии (ANOVA), за которым следовали соответствующие пост-хок тесты для множественных сравнений при обнаружении значимого общего эффекта. Двустороннее значение p < 0,05 считалось статистически значимым. Значение статистических символов (например, p < 0,05, *p < 0,01) было определено в легендах на рисунках, а количество биологических реплик указано в соответствующем тексте или легендах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обнаружение экспрессии NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 и их взаимодействия при сепсисе

В сыворотке пациентов с сепсисом уровни NEAT1 и HMGB1 были значительно выше, чем у здоровых контрольных групп, тогда как miR-181a-5p был заметно снижен. Похожие паттерны экспрессии наблюдались в PBMC и макрофагах RAW264.7, стимулированных липополисахаридом, что свидетельствует о постоянном изменении этой оси при сепсисе и воспалительных состояниях (рисунок 1A-C<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сепсис характеризуется глубокой и часто длительной дисрегуляцией иммунной системы, при которой фазы гипервоспаления и иммуносупрессии сосуществуют и совместно способствуют отказу органов и плохимисходам 21,22. Накопленные данные свидетельствуют о том, что длинные некодирующие РНК (lncRNA) участвуют в этих процессах, модулируя воспалительные сигналы и поляризациюмакрофагов 23,24...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Авторы благодарят клинический и лабораторный персонал Аффилированной больницы Университета Хэбэй за помощь в наборе пациентов, обработке образцов и уходе за животными. Эта работа была поддержана Комиссией по здравоохранению провинции Хэбэй (грант No 20220640).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аденовирусный вектор (shNEAT1)10692-V5Vigene BiosciencesАденовирус, используемый для снижения экспрессии NEAT1 in vivo и in vitro.
Набор для анализа белков BCA23227Термо ФишерРаньше Kit количественно определял концентрацию белка в клеточных лизатах.
Набор для анализа репортёров с двойной люциферазойE1910PromegaНабор используется для анализов репортеров с двойной люциферазой для измерения взаимодействия miR-181a-5p.
Наборы ELISA (цитокина)Н/ДR& D SystemsНаборы, используемые для измерения уровня цитокинов в сывороточных и тканевых образцах.
Сыворотка для плода быка (FBS)16000-044GibcoДобавка, используемая в культурных средах для роста клеток.
Антитела к GAPDH2118SТехнология клеточной сигнализацииПервичное антитело против GAPDH используется как контроль нагрузки в western blot.
Набор для окрашивания гематоксилина и эозинаН/ДТермо ФишерНабор, используемый для гистологического окрашивания тканевых срезов для патологического анализа.
Иммунофлуоресцентные антитела (CD206)14693-1-APProteintechАнтитела, используемые для обнаружения маркера макрофага M2 CD206 в срезах ткани.
Липополисахарид (LPS)L2630Сигма-ОлдричLPS используется для индуцирования поляризации воспалительных макрофагов в клетках RAW264.7.
miR-181a-5p МимикН/ДН/ДСинтетический miR-181a-5p имитатор используется для модуляции уровней miR-181a-5p.
Плазмида экспрессии NEAT1Н/ДН/ДПлазмида, используемая для гиперэкспрессии NEAT1 у макрофагов RAW264.7.
Макрофаговые клетки RAW264.7TIB-71ATCCКлеточная линия мышиных макрофагов, используемая для экспериментов in vitro.
RIPA Lysis Buffer89901Термо ФишерБуфер, используемый для лизирования клеток с целью извлечения общего белка.
RPMI-1640 средний11875-093GibcoСреда посева макрофагов RAW264.7.
SYBR Green Master Mix4385612Термо ФишерРеагент, используемый для количественного анализа ПЦР в реальном времени.
Трансвеллские миграционные пробиральные камеры3422КорнингКамеры, используемые для анализов миграции трансвелла для оценки миграции макрофагов.
Комплект для апоптоза TUNELab66110AbcamНабор, используемый для обнаружения апоптоза в клетках RAW264.7 с помощью окрашивания TUNEL.
Западные антитела к блотингу (HMGB1)AB18256AbcamПервичное антитело против HMGB1, используемое при западном блотинге.

Ссылки

  1. Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Girardis, M., et al. Understanding, assessing and treating immune, endothelial and haemostasis dysfunctions in bacterial sepsis. Intensive Care Med. 50 (10), 1580-1592 (2024).
  3. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  4. Chen, L. L., Kim, V. N. Small and long non-coding RNAs: past, present, and future. Cell. 187 (23), 6451-6485 (2024).
  5. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  6. Ashrafizadeh, M., et al. Non-coding RNA-based regulation of inflammation. Semin Immunol. 59, 101606(2022).
  7. Zhang, L., Liu, B., Han, J., Wang, T., Han, L. Competing endogenous RNA network analysis for screening inflammation-related long non-coding RNAs for acute ischemic stroke. Mol Med Rep. 22 (4), 3081-3094 (2020).
  8. Pan, S., et al. LncRNA NEAT1 mediates intestinal inflammation by regulating TNFRSF1B. Ann Transl Med. 9 (9), 773(2021).
  9. Wang, L., Qu, P., Yin, W., Sun, J. Lnc-NEAT1 induces cell apoptosis and inflammation but inhibits proliferation in a cellular model of hepatic ischemia/reperfusion injury. J Int Med Res. 49 (3), 300060519887251(2021).
  10. Yamazaki, T., et al. Functional domains of NEAT1 architectural lncRNA induce paraspeckle assembly through phase separation. Mol Cell. 70 (6), 1038-1053.e7 (2018).
  11. Isobe, M., et al. Forced isoform switching of Neat1_1 to Neat1_2 leads to the loss of Neat1_1 and the hyperformation of paraspeckles but does not affect the development and growth of mice. RNA. 26 (3), 251-264 (2020).
  12. Zhang, R. X., et al. Mechanism of action of lncRNA-NEAT1 in immune diseases. Front Genet. 16, 1501115(2025).
  13. Liu, J., et al. LIN28A-dependent lncRNA NEAT1 aggravates sepsis-induced acute respiratory distress syndrome through destabilizing ACE2 mRNA by RNA methylation. J Transl Med. 23 (1), 15(2025).
  14. Zhou, Y., et al. Downregulation of lncRNA NEAT1 alleviates sepsis-induced acute kidney injury. Cent Eur J Immunol. 47 (1), 8-19 (2022).
  15. Hashemian, S. M., et al. Non-coding RNAs and exosomes: their role in the pathogenesis of sepsis. Mol Ther Nucleic Acids. 21, 51-74 (2020).
  16. Liu, B., Ren, H., Chen, J. LncRNA NEAT1 correlates with Th1 and Th17 and could serve as an assistant biomarker in sepsis. Biomark Med. 15 (13), 1177-1186 (2021).
  17. Sun, F., et al. LncRNA KCNQ1OT1 attenuates sepsis-induced myocardial injury via regulating miR-192-5p/XIAP axis. Exp Biol Med. 245 (7), 620-630 (2020).
  18. Luo, S., et al. Long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 1 alleviates sepsis-associated myocardial injury by modulating the miR-181a-5p/XIAP axis in vitro. Ann Clin Lab Sci. 51 (2), 231-240 (2021).
  19. Pan, W., et al. miRNA-204-5p acts as a tumor suppressor in gastric cancer by inhibiting cell migration, invasion, and glycolysis via the RAB22A/PI3K/AKT axis. Sci Rep. 15 (1), 204-205 (2025).
  20. Qi, R., et al. PRMT2-mediated upregulation of miR-323-3p in sensory neurons promotes trigeminal neuropathic pain by targeting Kv2. 1 channels. Cell Rep. 44 (8), 116028(2025).
  21. Cao, M., Wang, G., Xie, J. Immune dysregulation in sepsis: experiences, lessons and perspectives. Cell Death Discov. 9, 465(2023).
  22. Zeng, X., et al. Screening of key genes of sepsis and septic shock using bioinformatics analysis. J Inflamm Res. 14, 829-841 (2021).
  23. Zhao, Q., et al. Long non-coding RNAs regulate the inflammatory responses of macrophages. Cells. 11 (1), 5(2021).
  24. Yarani, R., Mirza, A. H., Kaur, S., Pociot, F. The emerging role of lncRNAs in inflammatory bowel disease. Exp Mol Med. 50 (12), 1-14 (2018).
  25. Gan, T., et al. LncRNA MAAMT facilitates macrophage recruitment and pro-inflammatory activation and exacerbates autoimmune myocarditis through the SRSF1/NF-κB axis. Int J Biol Macromol. 278 (Pt 1), 134193(2024).
  26. Munteanu, M. C., et al. Long non-coding RNA FENDRR regulates IFNγ-induced M1 phenotype in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 13672(2020).
  27. Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
  28. Zhang, R., Feng, J. The diagnostic value of plasma high mobility group box 1 for sepsis following severe trauma. J Surg Res. 314, 79-84 (2025).
  29. Li, X., Jing, G., Guo, Z., Guo, Z. High-mobility group box 1 in acute kidney injury. Front Pharmacol. 16, 1618971(2025).
  30. Fan, H., et al. Inhibiting HMGB1-RAGE axis prevents pro-inflammatory macrophages/microglia polarization and affords neuroprotection after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 17 (1), 295(2020).
  31. Hollis, R., Tenet, M., Aziz, M., Wang, P. Anti-DAMP therapies for acute inflammation. Front Immunol. 16, 1579954(2025).
  32. Roh, J. S., Sohn, D. H. Damage-associated molecular patterns in inflammatory diseases. Immune Netw. 18 (4), e27(2018).
  33. Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
  34. Cheng, Y., et al. Identification of circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA competitive endogenous RNA network as novel prognostic markers for acute myeloid leukemia. Genes. 11 (8), 868(2020).
  35. Shahpari, M., et al. The functional roles of competitive endogenous RNA (ceRNA) networks in apoptosis in human cancers: the circRNA/miRNA/mRNA regulatory axis and cell signaling pathways. Heliyon. 10 (21), e37089(2024).
  36. Huang, L., Wu, C., Xu, D., Cui, Y., Tang, J. Screening of important factors in the early sepsis stage based on the evaluation of ssGSEA algorithm and ceRNA regulatory network. Evol Bioinform Online. 17, 11769343211058463(2021).
  37. Liu, Z., et al. Uncovering the ceRNA network related to the prognosis of stomach adenocarcinoma among 898 patient samples. Biochem Genet. 62 (6), 4770-4790 (2024).
  38. Zhu, J., et al. lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA ceRNA network in lumbar intervertebral disc degeneration. Mol Med Rep. 20 (4), 3160-3174 (2019).
  39. Chang, Z., et al. The construction and analysis of ceRNA network and patterns of immune infiltration in colon adenocarcinoma metastasis. Front Cell Dev Biol. 8, 688(2020).
  40. Hume, D. A., Irvine, K. M., Pridans, C. The mononuclear phagocyte system: the relationship between monocytes and macrophages. Trends Immunol. 40 (2), 98-112 (2019).
  41. Smigiel, K. S., Parks, W. C. Macrophages, wound healing, and fibrosis: recent insights. Curr Rheumatol Rep. 20 (4), 17(2018).
  42. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  43. Arts, R. J. W., Netea, M. G. Adaptive characteristics of innate immune responses in macrophages. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
  44. Sweet, M. J., Ramnath, D., Singhal, A., Kapetanovic, R. Inducible antibacterial responses in macrophages. Nat Rev Immunol. 25 (2), 92-107 (2025).
  45. Rasheed, A., Rayner, K. J. Macrophage responses to environmental stimuli during homeostasis and disease. Endocr Rev. 42 (4), 407-435 (2021).
  46. Lee, H. C., et al. LPS-induced systemic inflammation is suppressed by the PDZ motif peptide of ZO-1 via regulation of macrophage M1/M2 polarization. eLife. 13, RP95285(2024).
  47. Qiu, P., Liu, Y., Zhang, J. Review: the role and mechanisms of macrophage autophagy in sepsis. Inflammation. 42 (1), 6-19 (2019).
  48. Patoli, D., et al. Inhibition of mitophagy drives macrophage activation and antibacterial defense during sepsis. J Clin Invest. 130 (11), 5858-5874 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

NEAT1HMGB1CLP
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.