Исследовательская статья
* These authors contributed equally
Этот протокол позволяет интегрировать секвенирование следующего поколения и многоцветную иммунофлуоресценцию для профилирования аденокарциномы легких. Её цель — проанализировать взаимосвязь между геномной гетерогенностью и плотностью иммунных клеток, инфильтрирующих опухоли. Этот многомерный подход способствует всесторонней оценке микросреды опухоли для послеоперационной прогностической оценки.
Прогноз аденокарциномы лёгких (LUAD) традиционно оценивается с помощью стадии метастазирования опухоли-узла (TNM), которая не учитывает иммунный статус пациента. Этот протокол интегрирует геномное профилирование и анализ иммунной микросреды для более комплексной послеоперационной прогностической оценки. Метод включает ретроспективный анализ опухолевых тканей, вложенных в парафин, с использованием двух основных методов. Во-первых, следующее поколение секвенирования (NGS) проводится с помощью индивидуальной панели из 37 генов для выявления мутаций в драйверных генах и вариантов неопределённого значения. Во-вторых, мультиплексная иммунофлуоресценция (mIF) используется для таргетирования маркеров, включая HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 и PanCK. Это позволяет количественно оценивать пространственное распределение и плотность для специфических субпопуляций иммунных клеток в различных регионах опухоли. Такой интегрированный подход позволяет одновременно оценивать геномную гетерогенность и характеристики иммунных клеток, инфильтрирующих опухоли. Полученные данные выявляют специфические комбинации мутационных профилей — таких как статус EGFR — и плотности иммунных клеток. Эти интегрированные комбинации позволяют изучать их коллективное влияние на выживаемость пациентов, предлагая перспективный подход к разработке будущих прогностических моделей рака лёгких. Этот протокол демонстрирует надёжный метод характеристики сложных биологических особенностей микросреды опухолей LUAD.
LUAD — самый распространённый подтип рака лёгких, однако средняя выживаемость за 5 лет остаётся низкой — примерно 15%1. Текущая прогностическая оценка в основном опирается на систему стадирования TNM; однако этот метод часто упускает из виду общий иммунный статус пациента, что может ограничить точность прогнозирования. Данные свидетельствуют о том, что как геномная гетерогенность, так и микросреда опухоли (TME) играют критическую роль в опухолиогенезе LUAD и прогрессировании заболевания 2,3.
В последние годы переход от традиционного секвенирования Сэнгера к таргетному NGS позволил проводить высокочувствительный одновременный анализ нескольких драйверных генов, таких как EGFR, TP53 и KRAS 4,5. Хотя NGS предоставляет высококачественную карту генетических изменений, одни геномные данные не могут отразить сложные клеточные взаимодействия и пространственную организацию внутри TME.
Для решения этих сложностей mIF обладает значительными преимуществами по сравнению с традиционными методами иммунного профилирования. В то время как иммуногистохимия с одним плексным плексом (IHC) ограничена одним маркером на секцию, mIF позволяет одновременно обнаруживать несколько белковых маркеров при сохранении пространственной архитектуры ткани. В отличие от последовательного IHC, который может вызывать деградацию тканей, или проточной цитометрии и секвенирования объёмной РНК, которые приводят к потере пространственной локализации и разрешения на одну клетку 6,7,8, mIF в сочетании с аннотированием пространственных регионов позволяет на месте, многопараметрическую характеристику иммунноголандшафта 9.
Этот протокол устанавливает комбинированный рабочий процесс, интегрирующий таргетную оценку NGS, mIF и пространственную область (охватывающую всю ткань, границу опухоли и ядро опухоли). Такой многомерный подход необходим для изучения взаимодействия между геномными изменениями и плотностью иммунных клеток — связь, которую одномодальные подходы часто не охватывают. Оценивая эти интегрированные характеристики, этот протокол предоставляет дополнительную стратегию для характеристики биологических особенностей LUAD и предлагает более надёжную основу для послеоперационной прогностической стратификации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Это ретроспективное исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике больницы Куньмин Яньань (Одобрение No 2021-140-01). Все участники получили информированное согласие.
Дизайн исследования и сбор образцов
В 2015–2021 годах была включена группа из 63 пациентов с патологически или гистологически подтверждённой LUAD, перенесших хирургическую резекцию. Критерии исключения включали получение неоадъювантной химиотерапии, радиотерапии или иммунотерапии перед операцией. Кроме того, пациенты с сопутствующими опухолищами, тяжёлыми сопутствующими заболеваниями, плохим качеством тканей или неполными клиническими записями были исключены из анализа. Опухоли, закреплённые формалином-фиксированным парафином (FFPE), были обработаны в срезы диаметром 1 мм для депарафинизации. Как показано в рабочем процессе (рисунок 1), эти образцы прошли интегрированный анализ с использованием mIF и целевого NGS. Этот комбинированный подход позволяет одновременно оценивать геномные изменения и характеристики иммунной микросреды, предоставляя многомерную основу для характеристики биологии опухолей.
Продолжение
Таргетные препараты, иммунотерапия и прогрессирование или смерть заболевания отслеживались по телефону, а также получалась подробная информация о состоянии выживаемости, прогрессировании или рецидиве заболевания, адъювантных методах лечения после операции и новых сопутствующих заболеваниях. Время наблюдения закончилось в июле 2023 года, а конечной точкой наблюдения стало прогрессирование заболевания или смерть. Общая выживаемость определялась как время от начала операции до смерти пациента. Не было ни одного пациента, потерявшего для последующих осмотров. Минимальный срок последующего наблюдения составлял 21 месяц.
Подготовка и секвенирование библиотек NGS
Экстракция ДНК из срезов ткани FFPE
Получить срезы ткани FFPE (толщиной 3–10 мкм) из патологических образцов. Помещайте срезы в стерильные микроцентрифугальные трубки. Добавьте ксилол в каждую трубку и инкубуйте 5–10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить парафин. Центрифугуйте при 12 000 г в течение 5 минут и аккуратно выбросьте супернатант. Повторите обработку ксилолом 1 раз, чтобы обеспечить полную депарафинизацию. Последовательно промывайте гранулы 100% этанолом дважды, чтобы удалить остаточный ксилол. Высушите гранулы на воздухе при комнатной температуре, пока остаточный этанол полностью не испарится. Добавьте подходящий буфер для лизиса и протеиназу K (включенную в наборе для экстракции ДНК) и инкубировать при 56 °C в течение 1–3 часа (или ночью при необходимости), пока ткань полностью не будет лишена. Проведите дополнительную инкубацию при 90 °C в течение 1 часа, чтобы обратить обратное перекрёстное соединение формалинов. Экстракция геномной ДНК с помощью коммерческого набора для экстракции FFPE (см. таблицу материалов) согласно инструкциям производителя. Качество ДНК из образцов FFPE часто фрагментировано; следовательно, качество ДНК должно соответствовать минимальным порогам целостности (например, DIN ≥ 5), чтобы обеспечить успешную подготовку библиотеки для целевого NGS.
Количественная оценка и нормализация ДНК
Количественно измерить ДНК с помощью флюорометрического метода для обеспечения точного измерения концентрации. Нормализовать образцы ДНК до конечной концентрации примерно 5–10 нг/мкл с использованием буфера Tris-HCl (pH 8,5). При необходимости для обеспечения точности и стабильности концентрации ДНК проводите поэтапные этапы разбавления.
Подготовка библиотеки и обогатение целей
Подготовьте библиотеки секвенирования с использованием гибридного целевого NGS на основе захвата на ДНК, извлеченной из тканиFFPE 10. Проведите обогащение мишени с помощью индивидуальной зондовой панели, охватывающей экзонные области выбранных генов, связанных с развитием опухоли. При необходимости оценивать качество библиотеки и распределение размера фрагментов с помощью стандартных методов (например, систем на основе электрофореза).
Пулинг и секвенирование библиотек
Измерите каждую библиотеку с помощью флюорометрического анализа. Пулы библиотек с эквимолярными концентрациями в соответствии с требованиями комплекта секвенирования. Загрузите объединённые библиотеки на платформу секвенирования Illumina и выполните секвенирование с парным концом 150 бп.
Обработка данных и обнаружение вариантов
Необработанные секвенирующие считывания обрабатывались с использованием стандартных биоинформатических конвейеров, включая обрезание адаптеров, фильтрацию качества и выравнивание с человеческим эталонным геномом (GRCh37/hg19). Метрики контроля качества были следующими: Q20 > 85%, средняя глубина секвенирования > 2500x, показатель точности > 65% и базовый штраф Fold 80 ≤ 2. Контроль качества и выравнивание: сырые данные FASTQ проходили контроль качества с помощью FastQC и Trim Galore (или Trimmomatic) для удаления загрязнения адаптеров и низкокачественных последовательностей. Очищенные считывания были выровнены с человеческим эталонным геномом GRCh37 (hg19) с помощью элайнера Burrows-Wheeler (BWA). Обработка после выравнивания: сортировка, маркировка дубликатов и перекалибровка базового качества (BQSR) были выполнены с помощью Picard и инструмента анализа генома (GATK) для минимизации ложноположительных вызовов. Вызов вариантов: Зародышевые однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и InDel были обнаружены с помощью BWA MEM (0.7.16a - r1181). Соматические SNV и InDel были выявлены с помощью консенсусного подхода с использованием Mutect2 и VarScan2. Низкочастотные мутации дополнительно оценивались с помощью статистической модели Фрибайса (v 1.3.2). Аннотация и фильтрация: Варианты были аннотированы с помощью ANNOVAR, интегрируя данные из gnomAD, ClinVar и COSMIC. Зародышевые варианты отличались от соматических мутаций путём фильтрации высокочастотных популяционных SNP и оценки частот вариантных аллелей (VAF). Пороги VAF: Для клональных событий (например, ROS1 и ALK) применялся порог VAF в ≥5%, а для мутаций генов ( например, EGFR) применялся порог 1% для обеспечения обнаружения низкочастотных изменений, что стало возможным благодаря высокой средней глубине секвенирования >500x. Мутации зародышевой линии отличались от соматических мутаций с помощью данных проекта 1000 Genomes Project (1000G) и локальной базы данных здоровых ханьцев, созданной в нашей лаборатории. Оценка патогенности выявленных соматических вариантов проводилась в соответствии с основой AMP/ASCO/CAPframework 11, которая уточняет оценку доказательств для соматических вариантов с помощью многоуровневого, основанного на доказательствах подходе. Патогенные/вероятные патогенные (P/LP) варианты сохраняются, а их классификация основана на критериях I/II уровней, требующих доказательств A/B (FDA одобрения, клинические испытания) или C/D (доклинические/клинические исследования) для оценки. Уровень III (VUS) не имеет убедительных доказательств, тогда как уровень IV указывает на доброкачественные варианты через частоту популяций (например, gnomAD) или функциональные исследования; Эти мутации исключаются из последующих анализов. Оценка патогенности выявленных вариантов зародышевой линии проводилась в соответствии с рекомендациями ACMG/AMP 12. В этом исследовании были зафиксированы варианты патогенного (P), вероятнопатогенного (LP) и неопределённого значения (VUS). В дальнейшие анализы были включены только варианты с высокой уверенностью, проходящие критерии контроля качества (QUAL ≥1; глубина покрытия >10 для мутации зародышевой линии и глубина покрытия >500x для соматической мутации)
Подготовка образца из ткани FFPE
Подготовка керофиновых сечений
Разрежьте блоки ткани FFPE на срезы толщиной 3 мкм с помощью микротома. Плавающие секции на водяной бане при температуре 40–45 °C, чтобы сгладить ткань. Крепите секции на клеевые микроскопические стекли и сушите при комнатной температуре. Поставьте слайды в сушильную духовку при температуре 65 °C на 1 час, чтобы обеспечить прочное прилипление участков ткани к стеклам и расплавить избыток парафина.
Депарафинизация и регидратация
Положите слайды в стойку для окрашивания и погрузите их в раствор для очистки I на 5 минут. Последовательно переносите слайды на очищающий раствор II и очищающий раствор III, по 5 минут каждая, чтобы полностью растворить парафин. Переведите стекли на 100% этанол на 3 минуты, чтобы удалить остаточный очищающий реагент. Регидратировать срезы ткани с помощью градуированной серии этанола: 95% этанола в течение 3 минут и 80% этанола в течение 3 минут. Промывайте слайды 2 раза в дистиллированной воде, давая 3 минуты между промывками. Ксилол и этанол, используемые при депарафинизации, обрабатывались в химическом выхлопчике из-за своей летучости и токсичности. Все растворы для отходов, содержащие органические растворители, были собраны отдельно и утилизированы в соответствии с институциональными рекомендациями по утилизации опасных отходов.
HE окрашивающая перегородка
Окрашивание гематоксилином и эозином
После депарафинизации и регидратации в растворе гематоксилина погружать стекли в течение 5–10 минут при комнатной температуре. Промываю слайды под проточной водопроводной водой в течение 5 минут. Дифференцировать слайды в 1% солянокислотном спирте на несколько секунд (3–10 с). Сразу же прополосните проточную водопроводную воду. Синие ядра погружаются в воду из-под крана или в раствор для синего на 5 минут. Погружение в раствор эозина на 1–3 минуты при комнатной температуре. При необходимости немного прополосните в дистиллированной воде.
Обезвоживание и очистка
Дегидратат скользит через градированный этанол: 80% этанол в течение 1 минуты; 95% этанола в течение 1 минуты и 100% этанола 2 раза в течение 1 минуты. Прозрачные стекли в ксилоле I–II, по 2–5 минут каждая.
Монтаж
Нанесите каплю нейтрального бальзама. Аккуратно размещайте накладку, чтобы избежать пузырьков воздуха. Дайте стеклам высохнуть при комнатной температуре перед визуализацией.
Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов тканей FFPE
Последовательное мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание проводилось для выявления множества иммунных и опухолевых маркеров на одном и том же срезе ткани. Такой подход позволяет визуализировать различные популяции клеток на месте при сохранении пространственногоконтекста 13. Забор антигенов: наполните банку для окрашивания буфером для получения антигенов. Поставьте банку в микроволновку и нагрейте на высокой мощности 3-5 минут, пока раствор не начнёт кипеть. Аккуратно переместите стекла после депарафинизации и регидратации в нагретый буфер для забора, убедившись, что тканевые срезы полностью погружены. Нагревание на низкой мощности микроволновой волны в течение 15 минут позволяет эффективно снимать антиген. После нагрева дайте слайдам естественно остыть при комнатной температуре в течение 30 минут. Перенесите слайды в ледяную воду на 5 минут, чтобы остановить процесс извлечения антигена.
Промывка и подготовка гидрофобного барьера
Промывайте стекли 1 раз дистиллированной водой, чтобы удалить остатки буфера для извлечения. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг вокруг каждого участка ткани. Снова ненадолго прополоскайте дистиллированной водой. Стирка 2 раза с TBST-буфером. После каждой мойки ставьте слайды горизонтально на 3 минуты, чтобы обеспечить полное удаление буфера.
Блокировка
Нанесите блокирующий буфер, чтобы полностью покрыть тканевой участок (~100 мкл на слайд). Инкубационные слайды в увлажнённой камере при комнатной температуре в течение 15 минут.
Инкубация первичных антител
Снимите блокирующий буфер, аккуратно постукая по краю затвора по впитывающей бумаге. Первичные антитела против HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 и PanCK применялись при оптимизированных рабочих разбавлениях в диапазоне от 1:100 до 1:400. Нанесите ~100 мкл разбавлённого раствора первичных антител на каждый участок ткани. Инкубировать слайды в увлажнённой камере: 37 °C в течение 1 часа или 4 °C ночью для повышения чувствительности.
Стирка
Стирка 3 раза с TBST-буфером, по 3 минуты за каждую стирку. После каждой мойки размещайте стекли горизонтально, чтобы обеспечить буферный дренаж.
Инкубация вторичных антител
Подготовьте вторичный раствор антител, разбавляя 1:3 в буфере TBST. Наносите примерно 100 мкл вторичного раствора антител на каждое стекло. Инкубация скользит при 37 °C в течение 10 минут в увлажнённой камере. Стирка 3 раза с TBST, по 3 минуты за каждую стирку.
Усиление флуоресцентного сигнала
Разведите флуоресцентный амплификационный реагент 1:100 в буфере усиления. Нанесите 100 мкл разбавлённого реагента на каждое стекло. Инкубировать стекли при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте, чтобы предотвратить фотоотбеливание. Стирка 3 раза с TBST, по 3 минуты за каждую стирку.
Извлечение антигена между маркерами
Проведите микроволновую извлечение антигена, как описано. После нагрева охлаждайте последовательно: 5 минут в тёплой воде и 5 минут в ледяной воде.
Последовательное окрашивание дополнительных маркеров
Повторяйте этапы инкубации первичных и вторичных антител для каждого дополнительного маркера антител. Убедитесь, что забор антигена проведён после окрашивания каждого маркера перед переходом к следующему антителу.
Ядерное контрокрашивание
Промывайте слайды 1 раз с буфером TBST. Нанесите окраску DAPI Nuclear Mortar. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут в темноте. Промывайте слайды три раза дистиллированной водой. Определение конечной точки: ядра должны выглядеть чётко окрашёнными при флуоресцентной микроскопии.
Окрашивание только с последним маркером
Нанесите биотиновый раствор, разбавленный 1:200 в амплификационном буфере, инкубируйте 10 минут при комнатной температуре. Промывайте слайды 3 раза с буфером TBST. Проведите забор антигена, как описано. Промывайте слайды 3 раза с буфером TBST. Нанесите эндогенный блокирующий биотин, инкубуйте при 37 °C в течение 30 минут. Нанесите краситель для морилки 1:100 в TBST и инкубуйте 30 минут при комнатной температуре в темноте. Стирайте слайды 1 раза с TBST и дайте слить 3 минуты.
Монтаж
Добавьте каплю Antifade Mounting Medium на салфетку. Аккуратно наденьте накладку на горку. Дайте стеклам высохнуть перед визуализацией.
Получение изображений секций H&E и mIF
С помощью слайд-сканера были получены изображения целых слайдов (WSI) срезов тканей, окрашиваемых H&E, и mIF FFPE. Для срезов H&E проводилось сканирование Brightfield, а флуоресцентное сканирование — для срезов mIF. Цель: увеличение в 20 раз для обзорного сканирования; 40-кратное увеличение для региональной съёмки высокого разрешения. Настройки возбуждения и излучения: оптимизированы для каждого флуорофора в соответствии с спецификациями производителя. Время экспозиции и усиление: Автоматически регулируется программным обеспечением для обеспечения достаточной интенсивности сигнала без насыщения.
Контроль качества mIF и оценка изображения
Для обеспечения надёжности результатов mIF был внедрён строгий протокол контроля качества перед классификацией тканей и количественной оценкой клеток с использованием цифровой системы патологии HALO. Удаление артефактов и определение оценительных областей: Изображения целых слайдов (WSI) были тщательно изучены для ручного исключения областей с тканевыми складками, артефактами окрашивания и неспецифическими фоновые сигналы. Этот шаг был необходим для предотвращения ложноположительных сигналов и обеспечения точности пространственного анализа. После этого скрининга в среднем 80% (диапазон: 50%–95%) площади ткани по всем образцам было определено как оценённая область mIF. Патологическая верификация и разбиение: Для точного определения опухолевых и стромальных компартментов срезы mIF были перекрёстно сверены с соседними серийными срезами, окрашёнными H&E. Аннотации независимо рассматривались двумя опытными патологами, при этом любые расхождения разрешались консенсусом. Образцы с площадью опухолевой ткани менее 30% были исключены из исследования для поддержания аналитической строгости. Валидация после количественной классификации: После автоматизированного фенотипирования и количественной оценки клеток пространственное распределение и паттерны экспрессии субпопуляций иммунных клеток были переоценены патологами. Этот обзор обеспечил соответствие цифровых количественных данных исходящим гистоморфологическим характеристикам, что гарантировало надёжность и точность результатов.
Цифровой анализ патологии и аннотация регионов
Панорамные сканированные изображения импортировались в платформу цифрового анализа патологических изображений для обработки. Для сегментации и идентификации клеток использовался плагин HALO AI Nuclei Seg-Plugin. Используя окрашивание H&E в качестве ориентира, следующие области интереса (ROI) были вручную аннотированы: Вся область опухоли (WSIT); Граница опухоли (ТБ); Опухолевой центр (ТК). Обнаружение положительного сигнала определялось на основе порогов интенсивности флуоресценции и ожидаемой субклеточной локализации каждого маркера. Этот подход, специфичный для компартмента, был применён для минимизации фоновых помех и повышения точности идентификации иммунных клеток. Плотность иммунных клеток количественно определялась как количество клеток, положительных к маркерам, на выбранные области опухоли. Выровнять изображения mIF с соответствующими аннотациями, полученными от H&E, на основе морфологии ткани. Пациентов стратифицировали на группы с высокой и низкой плотностью в зависимости от медианного значения плотности иммунных клеток для каждого маркера.
Статистический анализ
Для анализа использовалось программное обеспечение SPSS 17.0. Нормально распределённые данные выражались как среднее ± стандартное отклонение, а ненормально распределенные количественные данные — как медиана (диапазон квантиль 25%–75%). Корреляция между типом мутации гена, плотностью иммунных клеток и клиническими характеристиками была проанализирована с помощью модели регрессии пропорциональных опасностей Кокса с использованием модели Python lifelines. В зависимости от размера выборки и соответствия данных нормальному распределению, для сравнения непрерывных переменных использовался тест Стьюдента или тест Манна-Уитни U. Для сравнения переменных ранга использовался знаковый тест Уилкоксона. Для анализа неупорядоченных категориальных переменных выбирался критерий хи-квадрат или точный тест Фишера в зависимости от размера выборки и теоретической частоты. Тест Спирмана или тест Пирсона использовался для корреляционного анализа. Общая выживаемость пациентов была получена методом Каплана-Майера, и для тестирования использовался тест ранга Log. Кривые выживания были нарисованы с помощью языка R, основанного на программном обеспечении RStudio. P-значение <0,10 считалось статистически значимым.
Практическая применимость и ограничения
Для надежной реализации этого интегрированного рабочего процесса блоки тканей FFPE должны соответствовать строгим стандартам качества, включая идеальную клеточность опухоли ≥30% и отсутствие обширного некроза или значительных тканевых артефактов. Технический успех mIF во многом зависит от сохранения тканей; Такие факторы, как чрезмерная фиксация, чрезмерные повреждения или высокая фоновая автофлуоресценция, могут привести к недостаточному проникновению антител и неоптимальной интенсивности сигнала. Кроме того, следует учитывать ряд внутренних ограничений этого исследования. Во-первых, анализ основан на ретроспективной одноцентровой когорте из 63 пациентов, что может ограничить статистическую силу и широкую обобщимость результатов для других популяций. Во-вторых, область оценки ограничена фиксированной панелью NGS из 37 генов и специфическим набором иммунных маркеров (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 и PanCK; Дополнительная таблица 1). Как отмечается в источниках, хотя этот комбинированный подход обеспечивает более прочную основу для прогностической стратификации, необходимы более масштабные проспективные многоцентровые исследования для дальнейшей проверки этих ассоциаций и уточнения прогностической полезности выявленных биомаркеров.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Клинические характеристики пациентов с аденокарциномой лёгких
В этом исследовании было собрано 63 пациента, которым с 2015 по 2021 год поставили диагноз LUAD и которые проходили хирургическоелечение в нашей больнице с 2015 по 2021 год, соответствующие критериям включения. Клинические характеристики включённых пациентов показаны в таблице 1. Среди зарегистрированных пациентов медианный возраст составлял 60 лет (47–73 года), включая 30 из 63 му...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Интегрированное геномное и пространственно разрешенное иммунологическое профилирование LUAD
Это исследование демонстрирует интегрированный рабочий процесс, объединяющий целевые NGS и mIF для характеристики многомерного ландшафта LUAD. Наши геномные результаты совпадают с предыдущей литературой, особенно в отношении этнических различий частоты мутаций. Наблюдаемая частота мутаций EGFR (примерно 40%-60%) соответствует зарегистрированным частотам в азиатских поп...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не заявляют о коммерческих или финансовых отношениях, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Эта работа была поддержана Медицинским и медицинским планом науки и технологий провинции Чжэцзян (2022KY1237); Проект Научно-исследовательского фонда Департамента образования Юньнани (2025Y0387); Ключевая программа исследований и разработок Юньнани (202403AC100002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Комплект мультиплекса AlphaTSA IHC | alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Медиум для монтажа антифейда | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252, Lot0525A17 | Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| CD163 | Пекинская компания Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0428 | RRID:AB_3714707; Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| CD206 | Abcam, Inc | Кат# 5307-1 | RRID:AB_10896526; Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| CD68 | Пекинская компания Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0060 | RRID:AB_2904190; Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Индивидуальная панель генов рака | TWIST Co., Ltd. | Подготовка библиотеки NGS | |
| Депарафинизация Буфф | QIAGEN Co., Ltd. | 19093 | ДНК-экстракция с окрашиванием HE; Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание из срезов тканей FFPE |
| Dynabead M-270 streptavidin | Thermo Co., Ltd. | 65602 | Подготовка библиотеки NGS |
| Флуорометр | ThermoFisher Scientific Co., Ltd. | QUBIT 4.0 | Подготовка библиотеки NGS |
| Цифровая платформа анализа изображений патологии HALO | Indica Labs, Inc., Альбукерке | версия 3.6.4134 | HE окрашивание и мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ окрашивания |
| Набор для окрашивания гематоксилином-эозином | Wuhan elabscience Technology Co., Ltd. | E-IR-R117 | Окрашивание HE |
| ДНК-набор HiPure FFPE | Гуанчжоу Magen Biotechnology Co., Ltd. | D6323 | Экстракция ДНК из срезов тканей FFPE |
| HLA-DR | HUABIO Co., Ltd. | ET1610-66 | RRID:AB_3069950; Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| ДНК-секвенсор Illumina | Illumina, Inc | 550DX | Последовательность |
| Нейтральный бальзам | Beijing Solarbio Science & Science Technology Co., Ltd. | G8590 | Окрашивание HE |
| Panck | Пекинская компания Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0069 | RRID:AB_2941997; Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| PD-L1 | Системы исследований и разработок | Каталог # AF1019 | RRID:AB_354540; Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Буфер TBST | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | HE окрашивание и мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание |
| UN-Blocker | Компания Homgen Co., Ltd. | Подготовка библиотеки NGS | |
| VAHTS ДНК-чистые бусины и bbsp; | Vazyme Co., Ltd. | N411 | Подготовка библиотеки NGS |
| Комплект подготовки библиотеки ДНК VAHTS для Illumina | Vazyme Co., Ltd. | ND610 | Подготовка библиотеки NGS |
| Система съёмки целого слайда | ZEISS Co., Ltd. | ZEISS AXIOSCAN 7 версии 3.3 | HE окрашивание и мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ окрашивания |
| xGen Hybridization and Wash Kit | IDT Co., Ltd. | 1080577 | Подготовка библиотеки NGS |
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение