Здесь мы представляем протокол для полуколичественной оценки глобальных уровней m⁶A с помощью точечного блота. Общая РНК извлекается, денатурируется, выявляется на нейлоновой мембране, пробуется антителом против m⁶A и визуализируется с помощью хемилюминесценции. Интенсивность сигнала, количественно измеряемая с помощью серого анализа ImageJ, отражает относительное количество метилирования, обеспечивая воспроизводимый рабочий процесс для исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ с точками для обнаружения глобальных уровней модификации РНК N6-метиладенозина
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
N6-метиладенозин (m⁶A) является самой распространённой внутренней модификацией в эукариотической мессенджерной РНК (мРНК) и служит ключевым регулятором посттранскрипционной экспрессии генов. Методы исследования m⁶A могут применяться на различных уровнях разрешения, включая глобальную количественную оценку, нуклеотидно-специфическое обнаружение и анализ конкретных интересующих транскриптов. Среди них анализ dot blot предлагает простой, быстрый и экономичный подход к полуколичественной оценке глобальных уровней модификации m⁶A. В этом анализе клетки сначала обрабатываются для извлечения полной РНК, которая затем разбавляется и денатурируется. Образцы РНК размещаются на нейлоновой мембране, пробуются антителами анти-m⁶A и визуализируются с помощью хемилюминесценции, при этом интенсивность сигнала указывает на относительную объёмность метилирования. Наконец, количественная оценка и сравнение интенсивности сигналов выполняются путём измерения значений в оттенках серого с помощью ImageJ. По сравнению с методами секвенирования или масс-спектрометрии, точка-блот требует минимальных инструментов и технической экспертизы, что делает его особенно подходящим для рутинного скрининга, предварительных функциональных исследований и сравнительных анализов. Этот протокол обеспечивает подробный и воспроизводимый рабочий процесс для реализации m⁶A точечного анализа как в базовых исследованиях, так и в трансляционных приложениях.
Введение
N6-метиладенозин (m⁶A) является самой распространённой внутренней модификацией в эукариотической РНК (мРНК) и играет важную роль в посттранскрипционной регуляции, включая стабильность РНК, сплайсинг, деградацию, трансляцию и экспорт1,2,3. Дисрегуляция модификации m⁶A связана с различными физиологическими и патологическими процессами, включая инициацию, прогрессирование и метастазированиеопухоли 4,5. При остеосаркоме наблюдается повышенный уровень m⁶A как в клеточных линиях, так и в тканях, что указывает на роль аномального метилирования РНК в биологии заболеваний 6,7. Поэтому систематическая оценка глобального количества m⁶A вместе с его изменениями в транскриптах, связанных с остеосаркомой, и регуляторных путях крайне важна для ясности биологических механизмов и клинических последствий метилирования РНК при остеосаркоме.
Доступны несколько аналитических методов для изучения модификацийm⁶A 8,9. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия/масс-спектрометрия (LC-MS/MS)10 и ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) 11 используются для измерения глобальных уровней m⁶A. Первый обладает высокой чувствительностью, но требует специализированного оборудования и экспертизы, а второй даёт относительныйуровень m 6A и способствует более высокой стоимости, чем анализ с точками блота. MeRIP-qPCR позволяет целенаправленно оценивать конкретные транскрипты, но на него сильно влияет эффективность иммунопреципитации12. MeRIP-seq13, m⁶A-seq14 и m⁶A-SAC-seq15 — это подходы, основанные на секвенировании, которые могут точно отображать сайты метилирования m⁶A; однако они дорогие и требуют обширного биоинформатического анализа.
m⁶A точечный блот предлагает простой, быстрый и экономичный метод определения глобальных уровней модификации m⁶A в РНК. Как полуколичественный иммуноанализ, его основное преимущество заключается в получении общего представления о содержании m⁶A без необходимости специализированного оборудования или сложного биоинформатического анализа. Это делает анализ m⁶A точка-блот ценным инструментом для рутинного скрининга, предварительной функциональной валидации и клинических исследований, а также практическим дополнением к передовым методам секвенирования и масс-спектрометрии. Текущий протокол предлагает подробный пошаговый рабочий процесс, обеспечивая воспроизводимое обнаружение и широкое применение.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол организован в три раздела: подготовка РНК, анализ с точками и количественная оценка. Таблица материалов обобщает необходимые материалы, дополнительная таблица 1 подробно описывает формулы реагентов, а рисунок 1 иллюстрирует экспериментальный рабочий процесс.
1. Подготовка РНК
- Подготовка клеток
- Удалять 143B-клетки со стабильным SNHG21-knockdown (shSNHG21), отрицательными контрольными клетками (shCtrl) и клетки, обработанными 3-деазааденозином (3-DAA; [100 мкм, 24 часа]) и меклофенаминовая кислота (MA; [100 мкм, 24 часа]) из инкубатора при температуре 37 °C.
- Проверьте, что слияние клеток составляет примерно 80-90% и клетки находятся в хорошем состоянии под микроскопом.
- Удалите посевную среду, затем дважды промывайте клетки 1 мл PBS.
- Удалите PBS, затем добавьте 1 мл трипсина на блюдо размером 6 см.
- Аккуратно встряхните, чтобы равномерно распределить трипсин и инкубировать в течение 1 минуты.
- Удалите трипсин, затем добавьте 1 мл среды с 10% FBS, чтобы прекратить пищеварение.
- Несколько раз подвесьте клетку пипеткой, чтобы рассеять клетки.
- Перенесите суспензию клетки в микроцентрифугную трубку без РНазы объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркируйте тюбик перед использованием. Шаги 1.1.3–1.1.8 должны выполняться в стерильных условиях. - Центрифугуйте при 1000 × г в течение 3 минут, затем полностью удалите супернатант.
- Экстракция РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция РНК проводится с помощью комплекта для очистки РНК EZ-press.- Добавьте 600 мкл буфера лизиса (присутствующего в наборе для очистки РНК) в гранулу и вихрь тщательно, чтобы полностью лизировать клетки, и оставьте постоять 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 2 × 106 клеток используются для выделения РНК. - Добавьте равный объём 100% этанола и тщательно вторьте.
- Добавьте 600 мкл смеси на спин-колонку, собранную с помощью сборной трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите спин-колонку и трубку для сбора перед использованием, а перед использованием маркируете трубку. - Центрифугуйте при 12 000 × г в течение 1 минуты и высыпьте жидкость в сборную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте контакта между нижней частью колонки и жидкостью или оператором. - Повторите предыдущие шаги 1.2.3-1.2.4 для оставшейся смеси.
- Добавьте 500 мкл буфера для промывания (присутствующего в наборе для очистки РНК) в каждую колонку спина, оставьте при комнатной температуре 1 минуту.
- Центрифугуйте при 12 000 × г в течение 1 минуты и высыпьте жидкость в сборную трубку.
- Снова центрифугуйте пустую колонку при 12 000 × г в течение 1 минуты, чтобы удалить остатки жидкости.
- Перенесите спин-колонку в новую трубку без РНазы объемом 1,5 мл, откройте крышку и высушите на воздухе 2 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркируйте тюбик перед использованием. - Добавьте 25-50 мкл буфера элюции (безферментной воды) в центр спиновой колонны.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 минут.
- Центрифугу при 12 000 × г в течение 1 минуты для элюции РНК.
- Отбросьте спин-колонку и поместите РНК на лёд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните РНК при -80 °C до использования.
- Добавьте 600 мкл буфера лизиса (присутствующего в наборе для очистки РНК) в гранулу и вихрь тщательно, чтобы полностью лизировать клетки, и оставьте постоять 5 минут.
- Разбавление РНК
- Измерение концентрации РНК 143B клеток shSNHG21, 143B клеток shCtrl и клеток, обработанных 3-DAA и MA с помощью спектрофотометра DS-11.
- Подготовьте 1 мкг общей РНК из каждой клеточной линии.
- Серийно разбавляйте РНК до 400 нг, 200 нг и 100 нг водой, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Корректируйте градиент концентрации по мере необходимости.
- Денатурация РНК
- Теплом разбавляя образцы РНК при 95 °C в течение 3 минут.
- Немедленно переложите образцы в лёд для охлаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Денатурированную РНК можно хранить при 4 °C до 1 недели.
2. Точка на пятно
- Обнаружение РНК
- Разрежьте положительно заряженную нейлоновую мембрану до нужного размера.
- Нарисуйте опорные линии и обозначите мембрану названием образца.
- Тщательно смешайте РНК с помощью мягкой вихри или пипетирования.
- Пятно 1-2 мкл каждого образца РНК на определённые позиции мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипеток без РНазы в любое время. Избегайте прямого контакта между кончиком пипетки и мембраной. Позволить РНК естественно диффундировать по мембране. Используйте новый наконечник пипетки для каждого образца. Не превышайте 2 мкл на пятно для предотвращения нерегулярной диффузии.
- Перекрёстное связывание РНК
- Сушите мембрану на воздухе в течение 3 минут.
- Выполните сшищение РНК путём облучения мембраны в ультрафиолетовом сшивателе при 254 нм, 120 мДж/см².
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать мембрану при 37 °C в течение 30 минут в качестве альтернативы. - Промыйте мембрану 10 мл 1x TBST на качающейся платформе в течение 5 минут, чтобы удалить несвязанную РНК.
- Мембранная блокировка
- Подготовьте раствор с 5% BSA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием приготовьте этот раствор свежим. - Инкубировать мембрану в блокирующем растворе при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Подготовьте раствор с 5% BSA.
- Инкубация антител
- Инкубировать мембрану антителом анти-m⁶A за ночь при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разведите антитела 1:1000 в растворе BSA 5% перед использованием. Инкубировать мембрану на покачивающейся платформе с лёгким встряхиванием (50 об/мин). - Промыйте мембрану три раза с помощью 10 мл 1x TBST на качающейся платформе в течение 10 минут.
- Инкубировать мембрану вторичным антителом, конъюгированным пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 часа при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разведите антитела 1:1000 в растворе BSA 5% перед использованием. - Промыйте мембрану три раза с помощью 10 мл 1x TBST на качающейся платформе в течение 10 минут.
- Инкубировать мембрану антителом анти-m⁶A за ночь при 4 °C.
- Обнаружение хемилюминесценции
- Равномерно наносите хемилюминесцентную подложку HRP по капле на мембрану.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать мембрану с субстратом в течение 1 минуты при комнатной температуре с аккуратным покачиванием. - Обнаружение сигнала с помощью системы хемилюминесценции.
- Используйте функцию автоэкспозиции в системе хемилюминесценции в качестве начального предварительного сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Принимайте автовремя только если самый яркий сигнал насыщен менее 65%; в противном случае уменьшите экспозицию вдвое и восстанавливайтесь, пока пиковый сигнал не опадёт в пределах 30-60%.
- Равномерно наносите хемилюминесцентную подложку HRP по капле на мембрану.
- Окрашивание метиленового синего (MB)
- Инкубировать мембрану в растворе для окрашивания MB в течение 1 минуты.
- Промыйте мембрану три раза с помощью 10 мл 1x TBST на качающейся платформе в течение 5 минут и сделайте изображение как регулятор загрузки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрасьте ту же мембрану, что и для хемилюминесценции. Избегайте нарушения осадка в растворе для окрашивания. Носите защитную одежду и маску, так как MB сложно снять. - Очистить маскировку мембраны после изображения с помощью раствора с 1% SDS на качающейся платформе в течение 15 минут для облегчения документации или возможного повторного зондирования.
3. Количественная оценка
- Измерение значения в тонках серого
- Импортируйте изображение в программное обеспечение ImageJ.
- Преобразите изображение в 8-битный формат с помощью Image > Type > 8-бит.
- Вычтите фон с Процессом > Вычитать фон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Радиус: 50,0 пикселей, проверьте световой фон. - Используйте инструмент Rectangle , чтобы выбрать область анализа.
- Определите линии последовательно с помощью Analyze > Gels > Select First Lane.
- Генерируйте профили интенсивности с помощью Analyze > Gels > Plot Lanes и измеряйте пики.
- Измерьте значения в оттенках серого m⁶A и MB соответственно.
- Скопируйте данные в таблицу для анализа.
- Сравните интенсивность сигнала для оценки глобальных уровней модификации m⁶A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для строгой проверки эффективности анализа dot blot и изучения роли SNHG21 в регулировании глобальных уровнейm6 A 143B-клетки подвергались фармакологическим возмущениям, которые либо подавляют, либо усиливают метилированиеm6 A, и контролировали содержание m6 A в обоих направлениях.
Количественное определение глобального m6 A
Сначала мы оценили способность этого анализа обнаруживать снижения уровней m6 A...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании снижение SNHG21 в клетках остеосаркомы 143B привело к снижению интенсивности сигнала m⁶A, что демонстрирует ценность этого анализа для оценки влияния генетических модификаций на метилирование РНК. Кроме того, этот анализ служит инструментом для различных применений, включая: 1) Функциональные исследования и механистическую валидацию: Этот анализ может использоваться для быстрого предварительного скрининга, чтобы определить, связаны ли глобальные уровни m⁶A с конкретны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не сообщают о конфликтах интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук (82174408, 82374477 и 82474535). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3-деазааденозин (3-DAA) | MCE | HY-W013332A | 1 мг |
| Анти-m6A моноклональное антитело | Proteintech | 68055-1-Ig | 50 & Mu; L |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA, Fraction V) | BioFroxx | 4240GR100 | 100 г |
| Система визуализации ChemiDoc MP | BIO RAD | 12003154 | |
| DMEM Высокий уровень глюкозы | WISENT | 319-005-CL | 500 мл |
| Спектрофотометр DS-11 | DeNOVIX | DS-11 | |
| Комплект для очистки РНК EZ-press | EZB | B0004DP | 100 Preps |
| FBS — превосходное качество | WISENT | 086-150 | 500 мл |
| HRP-конъюгированный козёлый антимышиный IgG (H+L) | Beyotime | A0216 | 1 мл |
| Иммобилон западный хемилюминесцентный HRP субстрат и bbsp; | Миллипор | WBKLS0500 | 2 и раза; 250 мл |
| Меклофенаминовая кислота (MA) | MCE | HY-117275 | 1 мг |
| Раствор для окрашивания метиленового синего | Solarbio | G1300 | 0,1%, 100 мл |
| Мембрана переноса нейлона | LABSELECT | TM-NY-XS-45 | 7.4 и раз; 8,5 см, 0,45 и мю; m, 10 PCS/BAG |
| Буфер PBS (готовый к использованию сухой порошок) | biosharp | BL601A | pH: 7,2-7,4, 2 л/мешок |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Sigma | L5750-500G | 500 г |
| Предварительная порошок TBS Buffer | Сангон | A510025-0001 | 1EA (243,9 г порошка) |
| Фермент TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | 1 раз, 500 мл |
| Tween-20 | Сангон | A600560-0500 | 500 мл |
| УФ-сшиватель | UVP | CL-1000 |
Ссылки
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Zhang, Z., Wei, W., Wang, H., Dong, J. N6-methyladenosine-sculpted regulatory landscape of noncoding RNA. Front Oncol. 11 (1), 743990(2021).
- Hsu, P. J., et al. The RNA-binding protein FMRP facilitates the nuclear export of N6-methyladenosine-containing mRNAs. J Biol Chem. 294 (52), 19889-19895 (2019).
- Chen, X. -Y., Zhang, J., Zhu, J. -S. The role of m6A RNA methylation in human cancer. Mol Cancer. 18 (1), 103(2019).
- Li, Y., et al. Molecular characterization and clinical relevance of m6A regulators across 33 cancer types. Mol Cancer. 18 (1), 137(2019).
- Hu, Y., Zhao, X. Role of m6A in osteoporosis, arthritis and osteosarcoma (review). Exp Ther Med. 22 (3), 926(2021).
- Zhang, Y., et al. N6-methyladenosine (m6A) modification in osteosarcoma: expression, function and interaction with noncoding RNAs-an updated review. Epigenetics. 18 (1), 2260213(2023).
- Zhu, W., et al. Detection of N6methyladenosine modification residues (review). Int J Mol Med. 43 (6), 2267-2278 (2019).
- Wang, Y., Jia, G. Detection methods of epitranscriptomic mark N6-methyladenosine. Essays Biochem. 64 (6), 967-979 (2020).
- Stejskal, S., et al. Global analysis by LC-MS/MS of N6-methyladenosine and inosine in mRNA reveal complex incidence. RNA. 31 (4), 514-528 (2025).
- Ensinck, I., et al. m6A-ELISA, a simple method for quantifying N6-methyladenosine from mRNA populations. RNA. 29 (5), 705-712 (2023).
- Liu, J., et al. m6A mRNA methylation regulates AKT activity to promote the proliferation and tumorigenicity of endometrial cancer. Nat Cell Biol. 20 (9), 1074-1083 (2018).
- Zhang, M., Li, Q., Xie, Y. A Bayesian hierarchical model for analyzing methylated RNA immunoprecipitation sequencing data. Quant Biol (Beijing). 6 (3), 275-286 (2018).
- Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
- Mishra, T., Phillips, S., Zhao, Y., Wilms, B., He, C., Wu, L. Epitranscriptomic m6A modifications during reactivation of HIV-1 latency in CD4+ T cells. mBio. 15 (11), e0221424(2024).
- Li, J., et al. METTL16 promotes lipid metabolic reprogramming and colorectal cancer progression. Int J Biol Sci. 21 (11), 4782-4797 (2025).
- Ren, F., Cai, Y., Song, Y. OTUD7B stabilization by METTL14-mediated m6A methylation drives HIF-1α expression in esophageal squamous cell carcinoma. Oncol Res. 33 (8), 2055-2074 (2025).
- Chen, Y., et al. WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1. Mol Cancer. 18 (1), 127(2019).
- Gu, Y., et al. Upregulation of circGDI2 inhibits tumorigenesis by stabilizing the expression of RNA m6A demethylase FTO in oral squamous cell carcinoma. Noncoding RNA Res. 10 (1), 140-152 (2025).
- Ura, Y., et al. Quantitative dot blot analyses of blood-group-related antigens in paired normal and malignant human breast tissues. Int J Cancer. 50 (1), 57-63 (1992).
- Reed, K. C., Mann, D. A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7207-7221 (1985).
- Herrin, D. L., Schmidt, G. W. Rapid, reversible staining of northern blots prior to hybridization. Biotechniques. 6 (3), 196-200 (1988).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2001).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: Predict and validate. Nat Rev Genet. 18 (5), 275-291 (2017).
- Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
