Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель перехода острой к хронической болезни почек, вызванной ишемией почек/реперфузионной травмой

809 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69866

⸱

10 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Pittsburgh Medical Center Children's Hospital of Pittsburgh (UPMC CHP), University of Pittsburgh

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье представлена ишемическая модель ХБП с использованием односторонней почечной ИРИ с контралатеральной нефрэктомией, выполненной за день до взятия образца; этот протокол позволяет проводить функциональную оценку на основе сыворотки, высокую выживаемость и воспроизводимую патологию ХБП на 28 и 42 днях, предоставляя универсальную платформу для механистических и интервенционных исследований.

Аннотация

Хирургическая временная окклюзия педикулы почки вызывает ишемию почек и реперфузионное повреждение (ИРИ), широко используемую модель для изучения острого повреждения почек (ОПП) и её прогрессирования в хроническую болезнь почек (ХБП) у мышей. Однако традиционные протоколы часто либо исключают функциональную оценку на основе сыворотки, либо приводят к высокой смертности. Хотя существующие односторонние и двусторонние модели почечного ИРС делают акцент на воспроизводимости, остаются трудности в достижении как стабильной тяжести травмы, так и долгосрочной выживаемости, подходящей для изучения прогрессирования ХБП. Здесь представлен протокол дорсального подхода, который предоставляет надёжную и воспроизводимую модель ишемического перехода от ОПП к ХБП. Дорсальный подход облегчает прямой доступ к почкам и минимизирует внутревальные манипуляции. Мы используем одностороннюю почечную ИРТ в сочетании с контралатеральной нефрэктомией, выполняемой за день до забора крови и ткани. Этот подход имеет два основных преимущества: (1) он минимизирует вариабельность, избегая несоответствий, связанных с двусторонними травмами, и (2) достигает почти 100% выживаемости при сохранении стабильности травмы, в отличие от протоколов, где нефрэктомия проводится раньше и связана с более высокой смертностью. Функциональная оценка проводится с помощью сыворотки BUN и креатинина, а интерстициальный фиброз количественно измеряется с помощью трихромного отложения коллагена и генов маркеров ХБП Массона через 28 и 42 дня после ИРС почек. Вместе эти показатели дают дополнительное понимание функциональных нарушений и развития патологии тканей. Этот протокол устанавливает надёжную и универсальную модель ишемического ХБП у мышей для механистических исследований.

Введение

ОПП является распространённым осложнением у госпитализированных пациентов и остаётся серьёзной глобальной проблемой здравоохранения. Эпидемиологические исследования показывают, что ОПП встречается до 20% госпитализированных и 30-60% тяжело больныхпациентов 1,2. Хотя некоторые пациенты восстанавливают почечную функцию, другие демонстрируют неполное восстановление, что предрасполагает их кХБП 3. Переход от ОПП к ХБП всё больше признаётся основным фактором долгосрочных результатов и стал объектом механистических и терапевтических исследований 4,5,6. Для изучения молекулярных механизмов и проверки возможных терапий необходимы воспроизводимые животные модели.

Хирургическая транзиентная окклюзия педикула почки (артерии и вены) вызывает почечную ИРС — одну из самых широко используемых моделей для изучения ОПП у мышей. Эта процедура вызывает острое повреждение трубчатого эпителия и воспалительный ответ, который может прогрессировать в хронический интерстициальныйфиброз 7,8. Однако традиционные протоколы почечной ИРИ представляют ряд проблем. Односторонняя почечная ИРС связана с минимальной смертностью и широко используется для долгосрочныхисследований 9; Однако оценка функции почек (например, химии сыворотки, анализа мочи или скорости фильтрации клубочков) невозможна. Двусторонние почечные ИРТ или модели, сочетающие одностороннюю почечную ИРТ с одновременной или ранней контралатеральной нефрэктомией, связаны с повышением смертности, что ограничивает их использование в хронических исследованиях. Хотя недавно исследовались надёжные вариации этихмоделей, их применение в хронических исследованиях требует тщательного рассмотрения. Кроме того, некоторые протоколы используют вентральную среднюю линию лапаротомии, которая требует манипуляций с внутрибрюшными органами для обнажения педикулы почек. Это может увеличить хирургическую инвазивность и техническую сложность. Скрипник и др. сообщили, что контралатеральная нефрэктомия, проведённая через 8 дней после односторонней ишемии, позволяет серологически оценить функцию почек после травмы, при этом сохраняя высокий уровеньвыживаемости 11. Этот протокол предоставляет систематический набор процедур, оптимизированных для оценки перехода от ОПП к ХБП в течение до 42 дней.

В этом исследовании демонстрируется ишемическая модель AKI-CKD с использованием односторонней почечной ИРС, за которой следует отложенная контралатеральная нефрэктомия, выполненная за день до взятия образцов почек и крови. Ранее мы использовали аналогичные процедуры в качестве модели AKI в нескольких публикациях12, 13, 14, 15. Мы успешно расширили этот подход для изучения перехода от AKI к CKD, при котором к 28-му и 42-му дням очевидны явные признаки CKD (рисунок 1 для схемы). Такой подход обеспечивает отличную выживаемость, вызывает высокофиброзный фенотип у повреждённых почек и позволяет оценить функцию почек с помощью собранной крови. Поэтому этот подход особенно полезен для исследований, требующих серологической оценки (в отличие от односторонней почечной ИРС) и повышения выживаемости (по сравнению с двусторонней почечной ИРТ). Для прямого доступа к почке использовался подход с дорсальной стороны. По сравнению с вентральной лапаротомией средней линии, этот подход минимизирует внутрибрюшную манипуляцию и ограничивает хирургическую манипуляцию только почками и перигилярными тканями, тем самым улучшая процедурную согласованность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на животных, проведённые в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Питтсбурга (IACUC; Протокол No 23103811), в соответствии с институциональными руководящими принципами. По мере необходимости может быть включена группа, проводящая фиктивную хирургическую контрольную группу, которая обычно проходит хирургическое воздействие без сосудистого зажимания или контралатеральной нефрэктомии. См. раздел «Материалы» для подробной информации о используемых инструментах и оборудовании. Острые предметы, включая иглы, лезвия для скальпеля и зажимы, необходимо утилизировать в специально отведённые контейнеры для острых предметов. Биологические отходы, включая ткани и трупы, должны обрабатываться и утилизироваться в соответствии с институциональными протоколами по биологическим опасностям. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка животных и хирургические установки

  1. Автоклав всех хирургических инструментов перед использованием. При проведении операций на нескольких животных между процедурами удаляйте кровь и мусор с инструментов, затем стерилизуйте их в течение 10-15 секунд с помощью горячего бусинного стерилизатора. Дайте инструментам остыть перед повторным использованием.
  2. Поставьте грелку с циркуляцией воды и разместите инфракрасную лампу над хирургическим полем.
  3. Поместить мышь в камеру для анестезии и индуцировать анестезию изофлураном (1,5%-2% кислорода, 1-2 л/мин) (согласно утверждённым институциональными протоколами). Когда мышь потеряла сознание, убедитесь, что глубина анестезии достаточна, сделав щипку пальца для проверки потери рефлексов.
  4. Перенесите мышь на нагретую хирургическую прокладку и поддерживайте анестезию с помощью носового конуса.
  5. Введите Ethiqa XR (бупренорфин с пролонгированным высвобождением; 3,25 мг/кг, s.c.) для послеоперационной анальгезии.
  6. Положите мышь в положение лежа на хирургической площадке. При необходимости закрепите конечности скотчем, чтобы минимизировать движение.
  7. Сбрийте спинные волосы вокруг места разреза с помощью машинки.
  8. Нанесите глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание во время процедуры.
  9. Вставьте ректальный зонд, закрепите его лентой и подключите к термометру для постоянного мониторинга.
  10. Дезинфицируйте операционную зону, чередуя 10% повидона-йода и 70% этанола, затем накройте область стерильной занавеской.

2. Односторонняя почечная ИРС

  1. Сделайте разрез по спине по средней линии (3-4 см), охватывающий уровень почек.
  2. Отдельте кожу от подкожных слоёв с помощью тканевых ножниц, разделяющих ткани.
  3. Определите расположение почки с помощью пальпации через кожу.
  4. На уровне, где визуализируется почка, примерно в 1 см латерально от позвоночника с левой стороны, сделайте продольный разрез мышцы 1–1,5 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если разрез слишком длинный, почка может проскользнуть обратно в брюшную полость, что усложняет последующие манипуляции. Минимальный кожный разрез может сохранить почку внешней формой.
  5. Аккуратно выделяйте почку наружу через спинной разрез. Если тонкая мембрана препятствует доступу, её резко вскрыть.
  6. При стабилизации почки с помощью незазубренных щипцов грубо рассеките перигилярный жир и соединительные ткани вокруг верхней и нижней педикулы почек, чтобы создать «канал» для установки сосудистого зажима.
  7. Убедитесь, что температура тела в области тела достаточно высокая (36,8-37,2 °C) до вызвать ишемию. Наместите нетравматический сосудистый зажим через почечную артерию и вену в виде пучка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что сосуды расположены по центру в губках зажима и сжимаются с равномерным давлением. Закрепляйте зажим в однородном месте на жилуме. Ориентируйте зажим перпендикулярно оси сосуда. Этот конкретный зажим можно повторно использовать примерно для 10 процедур на животных.
  8. Потяните кожу, чтобы покрыть почку, чтобы она была максимально близка к температуре тела.
  9. Поддерживайте температуру тела на уровне 36,8-37,2 °C во время ишемии, устанавливая тепловой насос на 38-39 °C (регулируйте по необходимости) и включайте/выключайте инфракрасную лампу для поддержания нужной температуры тела (регулируйте расстояние до лампы по необходимости).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система отопления «сэндвич», состоящая из грелки с циркуляцией воды и инфракрасной лампы, эффективно поддерживает температуру тела в узком диапазоне от 36,8 до 37,2 °C. Каждую минуту фиксируйте температуру корпуса, чтобы поддерживать её на уровне 36,8-37,2 °C.
  10. Через 30 минут ишемического периода снимите зажим и верните почку ватной палочкой в брюшную полость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вся почка выглядит равномерно бледной перед снятием зажима. После снятия зажима подтвердите успешную реперфузию. Если реперфузия заметно задерживается, например, на 30 секунд и более, это может указывать на неполную реперфузию, и следует рассмотреть исключение животного из последующих анализов. Восприимчивость к почечной ИРС и последующей тяжести ХБП существенно зависят от возраста, пола и фонового напряжения. Проведение пилотного эксперимента для определения оптимальной продолжительности ишемии является необходимым для каждого дизайна исследования.
  11. Закройте мышечный слой 5-0 впитываемых швов, а затем кожу зажимами для раны (например, 9 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите зажимы для раны через 10 дней после операции.
  12. Прекратите анестезию изофлураном и дайте мыши восстановиться в чистой клетке. Если животное оправилось после анестезии и не проявляет признаков дискомфорта или переохлаждения, возвращайте клетку в комнату для обслуживания животных. После операции животных контролируют на наличие боли или дискомфорта, при необходимости вводятся дополнительные дозы Ethiqa XR. Гуманные конечные точки устанавливаются в соответствии с институциональными рекомендациями IACUC для минимизации страдания животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ethiqa XR обеспечивает обезболивание до 3 дней. Вводите дополнительную дозу, если животные испытывают признаки боли или дискомфорта, через 72 часа после первоначальной дозы.

3. Контралатеральная нефрэктомия

  1. Следуйте шагу 1 — этапам подготовки животных.
  2. Выполните разрез кожи, как описано в шагах 2.1 и 2.2.
  3. На уровне, где визуализируется правая почка, примерно на 1 см латерально от позвоночника справа, сделайте продольный разрез мышцы длиной 1–1,5 см.
  4. Удерживая почку с помощью незубчатых щипцов, грубо расчлените перигилярный жир и соединительную ткань, чтобы обнажить педикул почек.
  5. Аккуратно отделяйте надпочечник от почки, оставляя надпочечник целым и избегая повреждения сосудов.
  6. Перевязать педикул почек с помощью зажима для связки (размер клипсы: маленький) и 4-0 шелковых швов, затем пересекать сосуды на почечной стороне. Затем перерезайте мочеточник и удалите почку.
  7. Закройте разрез, как описано в шаге 2.11.

4. Сбор крови и ткани почек

  1. Индуцировать анестезию у мышей с помощью изофлурана (1,5%-2% кислорода, 1-2 л/мин) и подтверждать глубину анестезии с помощью сжатия пальца для подтверждения потери рефлексов.
  2. Поместите мышь в положение на спине, затем сделайте разрез по средней линии и удалите диафрагму.
  3. Аккуратно экспонируйте сердце и введите иглу 23-G, прикреплённую к шприцу объемом 3 мл, в левый желудочек.
  4. Забирайте кровь медленно (600-1000 мкл).
  5. Удалите иглу, чтобы предотвратить гемолиз, и перепустите кровь в сборную трубку.
  6. Вырезать левую почку и разрезать её скальпелем (лезвие, закреплённое на ручке) в соответствии с требованиями исследования.
  7. Проведите эвтаназию, удаляя сердце под анестезией (согласно утверждённым институциональными протоколами).
  8. Обрабатывайте секционные ткани в соответствии с требованиями исследования (например, фиксация, резкое замораживание).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Характерное изменение цвета почек, наблюдаемое во время операции, подтвердило индукцию равномерной почечной ишемии, за которой последовала успешная реперфузия. Успешная ишемия характеризуется изменением цвета почек с чёрного на тёмно-фиолетовый, с последующим улучшением после снятия сосудистого зажима, что подтверждает реперфузию. Если почечная ишемия не будет успешно вызвана, почка демонстрирует лишь минимальное изменение цвета, и последующее повреждение может быть непоследовательным. В...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предоставляет воспроизводимую модель перехода от ОПП к ХБН, индуцированную почечной ИРС, которая характеризуется устойчивой дисфункцией почек и прогрессирующим интерстициальным фиброзом, широко признанными признакамиХБП 17,18. Односторонняя мочеточная обструкция (УУО) — это широко используемая модель ХБН, которая индуцирует обструктивную нефропатию и в первую очередь вызывает фиброз через устойчивую трубчат...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни одного.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIDDK K01-DK133635; Награда UPMC VMI P3HVB; Премия Фонда Самуэля и Эммы Уинтерс; UPMC CHP RAC стартовый грант; Премия грантодателей Фонда UPMC CHP Children's Trust; Программа Opportunity Pool Alliance по почечным ресурсам Джорджа М. О'Брайена (OKRA OPP) (для TC), NIDDK R01-DK121758; DK134346; R25-DK119180 (на SSL), NIDDK R01-DK125015; R01-DK137410 (JH), а также Кэролин и Марк Снайдер с семьёй Снайдеров (JH и SSL). Мы благодарим Гистологическую лабораторию CHP UPMC за помощь в гистологии и сканировании, а также Ветеринарные диагностические лаборатории Университета штата Канзас за поддержку в области сывороточной химии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Газовый фильтр для анестезииА.М. Бикфорд  F-AIR
Анестезиологическая индукционная камера, прогревЛабораторные продукты AIMSWCS8
Трубка для сбора кровиBD Microtainer365967
ЭтанолDecon Labs2701
Ethiqa XR (бупренорфин с пролонгированным выпуском)Fidelis Animal HealthNDC 86084-100-30
Мазь для глазAKORNNDC 17478-062-35
Марлевые прокладки, стерильные Динарекс3353
Машинка для стрижки для мелких животныхWAHLCLP-9868
Тепловая лампа, инфракрасныйPhysitemp InstrumentsHL-1
Тепловой насос для циркуляции тёплой водыBrainTree ScientificHTP-1500
Система тепла/анестезии для мелких животных, Versaflex и nbsp;BrainTree ScientificEZ-7150
Хирургические шторы, удерживающие теплоBraintree ScientificSPDR-MPS
Горячий стерилизатор бусинокСаймон КеллерSteri 250
Раствор изофлуранаКоветрус29405
Прикладщик для лигирования клипаУХ533140
Зажимы для перевязкиУХ533837
Микрозонд для температуры ректальной кишки PhysitempRET-3
Микрозондовый термометрPhysitempBAT-12
Микроскоп, оптическийLeicaDM2500
Микроскоп, слайдерный сканерLeicaСлайд-сканер Aperio CS2
Мышь (FVB/NJ)Лаборатория Джексона001800
Игла (23G)BD305145
Повидон йодные палочки и nbsp;Динарекс1201
Лезвия скальпеляТонкие научные инструменты10020-00
Рукоятка скальпеляТонкие научные инструменты10060-13
Хирургические щипцы, без зубцовХирургический инструмент RobozRS-5228
Хирургические щипцы с зубцамиТонкие научные инструменты11051-10
Хирургические щипцы, зубчатыеТонкие научные инструменты11019-12
Хирургические перчаткиCTISPGF750
Хирургические ножницы для разделения тканейТонкие научные инструменты14072-10
Швы, полигликолевая кислота (PGA)/абсорбируемая и bbsp; (5-0)Динарекс9131
Швы, шёлк (4-0)ОазисMV-683-V
Шприц (3 мл)BD309628
Шторы для полотенец, стерильные Динарекс4410
Сосудистый зажим с применением щипцовТонкие научные инструменты15057-14
Сосудистый зажим, нетравматический Тонкие научные инструменты 18055-03
Прикладной аппарат для зажимов для раныТонкие научные инструменты12020-09
Зажимы для ранТонкие научные инструменты12022-09

Ссылки

  1. Susantitaphong, P., et al. World incidence of AKI: A meta-analysis. Clin J Am Soc Nephrol. 8, 1482-1493 (2013).
  2. Pickkers, P., et al. Acute kidney injury in the critically ill: an updated review on pathophysiology and management. Intensive Care Med. 47, 835-850 (2021).
  3. Varrier, M., Forni, L. G., Ostermann, M. Long-term sequelae from acute kidney injury: potential mechanisms for the observed poor renal outcomes. Crit Care. 19, 102(2015).
  4. Coca, S. G., Singanamala, S., Parikh, C. R. Chronic kidney disease after acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis. Kidney Int. 81, 442-448 (2012).
  5. Chawla, L. S., Eggers, P. W., Star, R. A., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes. N Engl J Med. 371, 58-66 (2014).
  6. Venkatachalam, M. A., Weinberg, J. M., Kriz, W., Bidani, A. K. Failed Tubule Recovery, AKI-CKD transition, and kidney disease progression. J Am Soc Nephrol. 26, 1765-1776 (2015).
  7. Hesketh, E. E., et al. Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. J Vis Exp. (88), e51816(2014).
  8. Malek, M., Nematbakhsh, M. Renal ischemia/reperfusion injury; from pathophysiology to treatment. J Renal Inj Prev. 4, 20-27 (2015).
  9. Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice. PLoS One. 11, e0152153(2016).
  10. Smith, T., et al. Robust rat and mouse models of bilateral renal ischemia reperfusion injury. In Vivo. 38, 1049-1057 (2024).
  11. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post-injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), e50495(2013).
  12. Chiba, T., et al. Sirtuin 5 regulates proximal tubule fatty acid oxidation to protect against AKI. JASN. 37 (1), 0163(2019).
  13. Chiba, T., et al. Endothelial-derived miR-17~92 promotes angiogenesis to protect against renal ischemia-reperfusion injury. JASN. 32 (3), 552-563 (2021).
  14. Silva Barbosa, A. C., et al. Dicarboxylic acid dietary supplementation protects against AKI. JASN. 35, 135-148 (2024).
  15. Chiba, T., et al. Loss of long-chain acyl-CoA dehydrogenase protects against acute kidney injury. JCI Insight. 10, (2025).
  16. Chiba, T., et al. Retinoic Acid signaling coordinates macrophage-dependent injury and repair after AKI. JASN. 27, 495-508 (2016).
  17. Webster, A. C., Nagler, E. V., Morton, R. L., Masson, P. Chronic kidney disease. Lancet. 389, 1238-1252 (2017).
  18. Martínez-Klimova, E., Aparicio-Trejo, O. E., Tapia, E., Pedraza-Chaverri, J. Unilateral ureteral obstruction as a model to investigate fibrosis-attenuating treatments. Biomolecules. 9 (4), 141(2019).
  19. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
  20. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
  21. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, F1487-F1494 (2012).
  22. Lu, X., et al. C57BL/6 and 129/Sv mice: Genetic difference to renal ischemia-reperfusion. J Nephrol. 25, 738-743 (2012).
  23. Scarfe, L., et al. Long-term outcomes in mouse models of ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury. Am J Physiol Renal Physiol. 317, F1068-F1080 (2019).
  24. Jordan, C. Z., et al. Murine kidney transplant outcome is best measured by transdermal glomerular filtration rate. Am J Transplant. 24, 2150-2156 (2024).
  25. Scarfe, L., et al. Measures of kidney function by minimally invasive techniques correlate with histological glomerular damage in SCID mice with adriamycin-induced nephropathy. Sci Rep. 5, 13601(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Острое повреждение почекдорсальный доступодносторонняя ишемия-реперфузия почкиконтрлатеральная нефрэктомиякреатинин сывороткиинтерстициальный фиброз
Мышиная модель перехода острой к хронической болезни почек, вызванной ишемией почек/реперфузионной травмой
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.